稳定沉默Beclin1的人成神经瘤SH-SY5Y细胞系的构建

为了构建pGenesil-1-Beclin1真核表达载体,并建立Beclin1稳定沉默的人成神经瘤SH-SY5Y细胞系,将合成的shRNA片段连接pGenesil-1质粒,构建成重组质粒pGenesil-1-Beclin1,转化其至感受态大肠杆菌JM109,挑取阳性克隆进行双酶切和DNA测序鉴定。常规培养SH-SY5Y细胞,将重组质粒pGenesil-1-Beclin1和空白对照质粒pGenesil-1转染SH-SY5Y细胞,G418抗性筛选,在荧光显微镜下挑取单细胞克隆并扩大培养至稳定细胞株,经RT-PCR和Western blot检测Beclin1基因的表达。经酶切和DNA测序鉴定重组真核表达载体构建正确,成功筛选出两株细胞系。和对照组转染pGenesil-1的细胞系相比,转染pGenesil-1-Beclin1细胞系的Beclin1mRNA表达下降71.28%±1.45%(P0.05),Beclin1蛋白表达下降75.50%±2.63%(P0.05)。提示已经成功构建pGenesil-1-Beclin1真核表达载体并建立了Beclin1基因稳定沉默的SH-SY5Y细胞系,为研究Beclin1功能提供了细胞模型。     

pEGFP-N1-PGC-1α重组质粒的构建及体外表达

目的 构建PGC-1α真核表达载体pEGFP-N1-PGC-1α重组质粒,鉴定及体外表达.方法 通过RT-PCR方法从组织中克隆PGC-1α基因片段,酶切后将其定向插入真核表达载体pEGFP-N1中,构建pEGFP-N1-PGC-1α重组质粒.结果 双酶切法、测序法鉴定表明目的基因正确插入质粒.结论 成功构建了pEGFP-N1-PGC-1α真核表达载体,转染huh-7细胞后,可瞬时、有效表达,为进一步研究PGC-1α调节HBV、HPV生物合成奠定了基础.     

人RUVBL2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建带有绿色荧光蛋白的RUVBL2真核表达载体pEGFP-N1-RUVBL2,并鉴定其在HeLa细胞中的表达。方法:以pGADT7-RUVBL2质粒为模板,PCR扩增RUVBL2基因,首先克隆至T载体中,进一步亚克隆至p-EGFP-N1,并对重组表达载体进行酶切及测序鉴定。采用脂质体转染法将重组质粒瞬时转染HeLa细胞系,应用荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达,并用Western blot法检测RUVBL2-GFP融合蛋白的表达。结果:经限制性酶切鉴定及测序分析证实pEGFP-N1-RUVBL2载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的HeLa细胞中有绿色荧光蛋白的表达,Western blot法证实转染细胞中能表达RUVBL2-GFP融合蛋白。结论:pEGFP-N1-RU-VBL2表达载体构建成功,并在HeLa细胞内成功表达。     

小鼠pdx-1基因真核表达载体的构建及其在胚胎干细胞中的表达

目的： 克隆小鼠pdx-1基因，构建其真核表达载体，并在小鼠胚胎干细胞中表达，为糖尿病的细胞移植治疗奠定基础。方法： PCR扩增小鼠胰腺pdx-1基因 cDNA，酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1重组，将pdx-1基因 cDNA片段连接到pEGFP-N1载体的多克隆位点，形成重组载体pEGFP/pdx-1，转化大肠杆菌DH5α菌株，构建成pdx-1基因真核表达载体质粒。扩增DH5α后抽提质粒DNA，Hind Ⅲ 和BamHⅠ酶切，电泳，DNA测序鉴定。鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染小鼠胚胎干细胞MESPU13。结果： 从小鼠胰腺cDNA扩增出876 bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N1载体中。经酶切和DNA测序验证，插入载体的DNA片段为pdx-1基因，插入方向正确。重组质粒经脂质体转染胚胎干细胞MESPU13，24 h 后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的基因的pdx-1表达。结论： 小鼠pdx-1基因的克隆和真核表达载体构建获得成功，为进一步研究其功能奠定了基础。     

人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体的构建

人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体的构建。以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD2基因启动子不同长度的4段序列,利用特定的限制性内切酶位点,以切除启动子的pEGFP-N3作为框架结构,将这4个序列片段进行酶切并插入表达载体pEGFP-N3中,用Vsp I和Pst I双酶切和PCR鉴定重组质粒,再将重组质粒进行DNA序列分析。构建的重组质粒经脂质体LipofectamineTM2000介导转染HTK293T细胞,转染24 h后加入TNF-α持续刺激细胞24 h或不加TNF-α刺激,在倒置荧光显微镜下观察其能否在NOD2基因启动子的调控下表达报告基因绿色荧光蛋白(green fluores-cent proteins,GFP)。结果:pEGFP-N3-NOD2(617 bp)、pEGFP-N3-NOD2(747 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 136 bp)、pEG-FP-N3-NOD2(1 387 bp)分别经酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,构建的4段重组质粒pEGFP-N3-NOD2(617 bp)、pEGFP-N3-NOD2(747 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 136 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 387 bp)转染的HTK293T均能表达绿色荧光,其中构建pEGFP-N3-NOD2(1 387 bp)重组质粒经TNF-α持续刺后激绿色荧光表达最强。4段不同长度的人NOD2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体成功构建,这为进一步研究NOD2基因表达及调控机制奠定了良好的基础。     

乙肝病毒HBsAg-EGFP融合蛋白真核表达载体构建及稳定转染Chang Liver细胞系的建立

目的 构建可表达乙型肝炎病毒(HBV)HBsAg-EGFP融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系.方法 利用PCR技术从HBV基因组中扩增出HBsAg基因片段,BamH I/EcoR l双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP-N1真核表达载体,转化TG1菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒pEGFPNl.HBsAg.将阳性克隆用脂质体法转染Chang Liver细胞,经持续G418压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系.结果 成功构建了真核表达载体pEGFPN1-HBsAg;建立了其重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系.结论 重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系可表达HBsAg-EGFP融合蛋白;该细胞系可以用于筛选HBsAg转染细胞后,差异表达的蛋白质研究,为深入研究HBsAg可能的致病机制提供依据.     

人NKG2D的基因克隆及其在CHO细胞中的表达

目的:构建重组人NKG2D真核表达载体并在CHO细胞表达重组人NKG2D。方法:用RT-PCR方法从NK-92细胞中调取NKG2D基因片段,克隆到pGEM-TEasy载体并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制内切酶EcoRI和BamHI消化pGEM-TEasy/NKG2D重组质粒,分离NKG2D片段,并插入真核表达质粒pEGFP-N1的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pEGFP-N1/NKG2D。然后经脂质体介导转染CHO细胞。应用荧光显微镜观测、Westernblot方法和免疫组化染色对转染细胞内pEGFP-N1/NKG2D的表达进行鉴定。结果:RT-PCR扩增获得650bp基因片段,经DNA序列分析证明所获得的DNA序列与文献报道的NKG2D序列一致。转染的CHO细胞在荧光显微镜下发出强绿色荧光,Westernblot分析显示重组蛋白能特异地与抗人NKG2D单克隆抗体结合;免疫组化检测显示,转染的CHO中有棕色颗粒,证明所构建的NKG2D真核表达载体可以在细胞中表达。结论:构建了人NKG2D的哺乳动物细胞表达载体,并成功地在CHO细胞中获得重组人NKG2D的表达。     

GFP／HBVX融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

丙肝病毒NS5B-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及稳定转染HepG2细胞系的建立

目的　构建可表达丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B EGFP融合蛋白的真核表达载体 ;获得重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。方法　利用PCR技术从HCV基因组中扩增出ns5b基因片段 ,XhoⅠ KpnⅠ双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP N3真核表达载体 ,转化TG1菌株感受态细胞 ,获得阳性重组质粒pEGFPN3 ns5b。将阳性克隆用脂质体法转染HepG2 细胞 ,经持续G4 18压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系。结果　成功构建了真核表达载体pEGFPN3 ns5b ;建立了其重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。结论　重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系可表达NS5B EGFP融合蛋白 ;该HepG2 细胞系可以应用于以ns5b基因为靶位的抗HCV感染研究     

小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western...     

多发性骨髓瘤负性相关基因DAZAP2的真核表达及定位

目的 构建无精症相关蛋白2(DAZAP2)真核表达重组载体, 对基因进行细胞定位. 方法提取1例正常人骨髓单个核细胞总RNA, 以逆转录产物作为模板,PCR扩增DAZAP2的开放阅读框(ORF).采用定向克隆法与真核表达载体pEGFP-N1连接,转染大肠杆菌DH5α,经双酶切及测序证实.脂质体法转染COS7细胞后,运用Western 印迹及免疫定位技术检测表达产物.结果 测序证实真核表达重组质粒的阅读框没有发生改变,转染重组质粒的细胞表达融合蛋白DAZAP2-EGFP,主要在COS7细胞质中表达.结论 成功获得了DAZAP2真核表达重组质粒并有效地表达重组融合蛋白,DAZAP2主要定位在细胞质中的泡状分泌结构上.     

多发性骨髓瘤负性相关基因DAZAP2的真核表达及定位

目的 构建无精症相关蛋白2（DAZAP2）真核表达重组载体, 对基因进行细胞定位. 方法提取1例正常人骨髓单个核细胞总RNA, 以逆转录产物作为模板,PCR扩增DAZAP2的开放阅读框（ORF）.采用定向克隆法与真核表达载体pEGFP-N1连接,转染大肠杆菌DH5α,经双酶切及测序证实.脂质体法转染COS7细胞后,运用Western 印迹及免疫定位技术检测表达产物.结果 测序证实真核表达重组质粒的阅读框没有发生改变,转染重组质粒的细胞表达融合蛋白DAZAP2-EGFP,主要在COS7细胞质中表达.结论 成功获得了DAZAP2真核表达重组质粒并有效地表达重组融合蛋白,DAZAP2主要定位在细胞质中的泡状分泌结构上.     

α-synuclein-pEGFP真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的表达

为了构建 α-synuclein-p EGFP真核表达载体 ,检测其在 SH-SY5 Y细胞内的表达 ,本研究应用下述方法 :PCR扩增 α-synuclein基因并消除终止密码子 ;PCR产物连入 p GEM T-easy载体 ,经测序确认无误后 ,亚克隆入 p EGFP-N1,构建α-synucle-in-p EGF P真核表达载体 ;Lipofect AMINE法转染 SH-SY5 Y细胞 ;荧光显微镜检测报告基因表达产物 EGFP,原位杂交和免疫荧光细胞化学法检测α-synuclein m RNA及其蛋白表达。结果显示 ,该载体转染 SH-SY5 Y细胞后 ,可在细胞内观察到报告基因和目的基因的表达产物。结论 :α-synuclein-p EGFP真核表达载体构建成功 ,并可在细胞内表达。本工作为今后动态观察研究α-synu-clein致 Parkinson病多巴胺能神经细胞损伤机制奠定基础     

外源表达Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化

目的:构建人Nkx2-5基因融合绿色荧光蛋白真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5,探讨外源性Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化的作用。方法:以真核表达质粒pEFSA-HA-Nkx2-5为模板,PCR扩增得到人Nkx2-5基因,将目的片段亚克隆到pEGFP-N1载体,鉴定正确。将重组质粒pEGFP-N1-Nkx2-5以脂质体法转染P19细胞,G418筛选2周,聚集4d,贴壁培养16d。以免疫细胞化学检测desmin、α-sarcomeric actin和cardiac Troponin T(cTnT)的表达。结果:将Nkx2-5基因正确插入pEGFP-N1载体,外源表达Nkx2-5基因可使P19细胞在无诱导剂、聚集条件下表达desmin、α-sarcomeric actin和cTnT蛋白。结论:成功构建真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5,外源表达Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化。     

Bcl-xl基因克隆及其在SH-SY5Y细胞中的表达

目的研究Bcl-xl基因在SH-SY5Y细胞中的表达。方法构建真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,采用脂质体介导将重组质粒导入SH-SY5Y细胞,RT-PCR和Western-blot检测外源基因表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,并用脂质体介导的方法高效转染SH-SY5Y细胞,RT-PCR显示有Bcl-xlmRNA表达增加,Western-blot显示有32kD的蛋白质表达增加。结论重组质粒pIRES2-EGFP/Bcl-xl经转染能够在SH-SY5Y细胞中高效表达,为进一步研究Bcl-xl对SH-SY5Y细胞的生物学功能奠定了基础。     

早期B细胞因子3对HepG2细胞周期的影响

目的:克隆人早期B细胞因子3 (EBF3)基因,构建真核表达载体pEGFP/EBF3,研究人EBF3对肝癌细胞株HepG2细胞周期的影响.方法:提取人胎盘组织总RNA,采用RT-PCR技术克隆人EBF3基因,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1,重组质粒双酶切鉴定,并进行序列测定.将重组质粒转染HepG2细胞,Western blot确证EBF3-EGFP融合蛋白的表达及亚细胞定位,流式细胞术分析转染细胞周期.结果:成功获得全长人EBF3基因,经双酶切和序列测定鉴定,真核表达质粒pEGFP/EBF3构建正确,将pEGFP /EBF3导入HepG2细胞24小时后,在倒置荧光显微镜下可观察到EBF3-EGFP融合蛋白主要表达于核内.Western blot证实转染pEGFP/EBF3后24小时和48小时细胞质和细胞核中均检出相对分子质量(Mr)为87 000的EBF3-EGFP融合蛋白.转染pEGFP/EBF3后48小时和72小时,S期细胞比例均明显高于pEGFP-N1转染细胞组,表明EBF3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展,从而促进细胞增殖.结论:成功构建了真核表达质粒pEGFP/EBF3,pEGFP /EBF3转染组S期细胞比例高于pEGFP-N1转染组,提示EBF3对人肝癌细胞株HepG2细胞有促进增殖作用.     

NF-κB结合位点在NOD2基因调控中的作用

目的 探讨NF-κB结合位点在NOD2基因调控中的作用.方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子序列,以切除启动子的pEGFP-N3作为框架结构,将这段序列进行酶切并定向克隆入表达载体pEGFP-N3中,构建含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)载体,将构建的重组质粒经脂质体LipofectAMINETM2000介导瞬时转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下观察其能否在NOD2基因启动子的调控下表达报告基因GFP.用突变试剂盒将重组质粒pEGFP-N3-NOD2wt中的NF-κB结合位点缺失突变,将构建的突变重组质粒mpEGFP-N3-NOD2瞬时转染HeLa细胞,观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果 pEGFP-N3-NOD2wt和mpEGFP-N3-NOD2经酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功,并且NF-κB结合位点突变成功.细胞转染结果表明,构建的重组质粒pEGFP-N3-NOD2wt转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下能看到绿色荧光,而突变质粒mpEGFP-N3-NOD2荧光强度明显减弱,与未转染质粒相近.结论 成功构建了含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子的重组质粒和含有NF-κB结合位点缺失突变的重组质粒;NF-κB结合位点突变重组质粒在HeLa细胞巾绿色荧光表达明显减弱,说明NF-κB结合位点在NOD2基因调控中发挥了正调节作用;为进一步研究NOD2基因表达及调控机制奠定了良好的基础.     

突变A53Tα-synuclein基因核输入信号和核输出信号真核载体的构建及表达分析

目的:构建真核表达载体pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES,瞬时转染SH-SY5Y细胞。方法:PCR扩增法获得含有SalI和NotI的目的片段A53T-SNCA-NLS、A53T-SNCA-NES,SalI、NotI双酶切载体pRK5,线性pRK5与目的片段经ligation high连接,酶切、PCR鉴定重组质粒pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES。重组质粒通过Lipofactamine2000转染SH-SY5H细胞,免疫荧光法鉴定瞬转细胞。结果:真核表达载体pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES构建成功,NLS、NES能介导突变基因A53T-SNCA翻译的α-synuclein蛋白在核内表达或胞质表达。结论:基因A53T-SNCA翻译的突变α-synuclein蛋白核内高表达或胞质高表达可能是家族性帕金森氏病发病机制中关键因素之一。     

真核表达载体pEGFP-N3-M-IL-2(88Arg,125Ala)的构建表达及对神经胶质瘤细胞U87的影响

目的:以pEGFP-N3为载体,构建融合基因M-IL-2(88Arg,125Ala)的真核表达载体pEGFP-N3-M-IL-2(88Arg,125Ala),检测融合基因在神经胶质瘤细胞U87中的表达以及重组蛋白对U87细胞的影响,为癌症的基因治疗提供实验基础。方法:通过PCR获得实验所需要的M-IL-2(88Arg,125Ala)基因片段,酶切后克隆入载体pEGFP-N3,构建M-IL-2(88Arg,125Ala)融合基因的真核表达载体pEGFP-N3-M-IL-2(88Arg,125Ala)。重组质粒经PCR、限制性内切酶分析及DNA序列测定证实构建成功后,用脂质体LipofectamineTM2000转染神经胶质瘤细胞U87,使用荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR及Western blot检测M-IL-2(88Arg,125Ala)融合蛋白在U87细胞中的表达,CCK-8方法检测融合蛋白对U87细胞的影响并观察细胞形态变化。结果:经PCR、限制性内切酶酶切分析及DNA序列测定证实,重组真核表达载体pEGFP-N3-M-IL-2(88Arg,125Ala)构建成功,经RT-PCR及Western blot检测证实重组基因可在U87细胞中表达,CCK-8方法检测到融合蛋白对U87细胞增殖有一定的影响。结论:真核表达载体pEGFP-N3-M-IL-2(88Arg,125Ala)构建成功,融合基因M-IL-2(88Arg,125Ala)可在U87细胞中表达且融合蛋白对肿瘤细胞的增殖有一定影响,为融合毒素M-IL-2(88Arg,125Ala)基因的进一步研究奠定了基础。     

突变AS3Tα-synuclein基因核输入信号和核输出信号真核载体的构建及表达分析

目的:构建真核表达载体pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES,瞬时转染SH-SY5Y细胞.方法:PCR 扩增法获得含有Sal I和Not I的目的片段A53T-SNCA-NLS、A53T-SNCA-NES,Sal I、Not I双酶切载体pRK5,线性pRK5与目的片段经ligation high连接,酶切、PCR鉴定重组质粒pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES.重组质粒通过Lipofactamine2000转染SH-SY5H细胞,免疫荧光法鉴定瞬转细胞.结果:真核表达载体pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES构建成功,NLS、NES能介导突变基因A53T-SNCA翻译的α-synuclein蛋白在核内表达或胞质表达.结论:基因A53T-SNCA翻译的突变α-synuclein蛋白核内高表达或胞质高表达可能是家族性帕金森氏病发病机制中关键因素之一.