黄连素联合胞嘧碇脱氨酶自杀基因对直肠癌细胞的抑制作用

目的 探讨黄连素联合胞嘧碇脱氨酶自杀基因(Ad-CD)对直肠腺癌细胞的体外杀伤作用.方法 培养人直肠腺癌细胞株HR-8348细胞,将重组腺病毒自杀基因转染人直肠癌细胞株HR-8348后,用四甲基偶氮唑盐(MTT法)检测黄连素联合Ad-CD基因对HR-8348细胞存活率的影响.结果 构建pcDNA3.1( )-CD真核表达载体成功,CD基因序列分析表明:重组子pcDNA3.1( )-CD含有完整的CD基因.RT-PCR表明CD基因在HR-8348细胞中表达,成功筛选出稳定表达CD基因的HR-8348细胞.HR-8348-CD细胞对浓度为100μg/ml以上的5-FC敏感,随着药物浓度升高和作用时间的延长,杀伤作用增强,但在250μg/ml以上浓度变化时,细胞杀伤率变化不大.分别以0.1、0.3、3.0、30.0μm浓度的黄连素联合5-FC对直肠癌细胞作用,细胞抑制作用随黄连素浓度升高而上升,但3.0、30μm浓度作用变化不大.在250μg/ml 5-FC浓度下,0.1、0.3、3.0、30.0μm浓度的黄连素联合5-FC对直肠癌细胞生长抑制率分别为:27.7%、42.4%、52.3%、56.3%.结论 黄连素联合5-Fc作用HR-8348-CD细胞能够增强对直肠癌细胞的抑制作用.     

结直肠癌原发灶和肝转移灶组织中蛋白质组差异表达及临床意义

目的探讨结直肠癌发生和肝转移相关蛋白及其与肝转移的关系。方法采用等电聚焦／SDS聚丙烯酰胺双向凝胶电泳法,对比分析结直肠癌原发灶、癌旁肠黏膜和肝转移灶中蛋白质组表达差异,经质谱分析、鉴定差异蛋白点;采用细胞转染方法,将差异蛋白基因导入到结直肠癌细胞,观察细胞生物学行为改变。结果结直肠癌原发灶、肝转移灶与正常肠黏膜蛋白质组分在PH7．0—9．5范围内有明显差别。分析13个差异蛋白点,其中2个蛋白点在癌原发灶组织中表达下调,5个蛋白点在原发灶组织中表达上调,6个蛋白点在肝转移组织中表达上调。经质谱鉴定,碳酸酐酶Ⅱ（CAⅡ）在癌组织中表达下调,磷酸甘油酸激酶Ⅰ、延胡索酸水合酶、醛缩酶A在原发灶中表达上调。精氨酸酶,谷胱甘肽S-转移酶A3在肝转移灶中表达上调。将碳酸酐酶ⅡcDNA克隆转染HR-8348细胞后,癌细胞侵袭、趋化运动能力及耐药性均明显减弱。结论结直肠癌原发灶和肝转移灶蛋白质组表达有显著差异,碳酸酐酶Ⅱ表达下调和精氨酸酶、谷胱甘肽S-转移酶A3增强表达可使结直肠癌细胞生物学行为发生改变并促进肝转移发生。     

成纤维细胞与大肠癌细胞相互作用对大肠癌细胞表达EMMPRIN的影响

目的研究成纤维细胞与大肠癌细胞相互作用对大肠癌细胞表达细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN）的影响。方法建立大肠癌细胞SW620与HELF成纤维细胞共培养模型，并设SW620细胞单独培养为对照组，通过RT-PCR和免疫细胞化学方法检测对照组和共同培养组SW620细胞中EMMPRIN的表达。结果共同培养组SW620细胞EMMPRIN的表达在mRNA水平和蛋白水平均高于对照组。结论成纤维细胞与大肠癌细胞相互作用促进了大肠癌细胞EMMPRIN表达增加，EMMPRIN表达增加可能在大肠癌浸润和转移中发挥重要作用。     

遗传性非息肉病性大肠癌FasL蛋白表达与肿瘤浸润淋巴细胞数量及分布的关系

探讨遗传性非息肉病性大肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocyte,TIL)计数高于散发性大肠癌(sporadic colorectal carcinoma,SCRC)可能的原因。方法应用免疫组织化学MaxVisionTM染色方法检测20例HNPCC及20例SCRC标本的凋亡相关蛋白因子配体(FasL)蛋白的表达及肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)数量、分布情况。另选正常大肠黏膜20例作为对照。结果 HNPCC、SCRC癌细胞及正常大肠粘膜细胞FasL蛋白的表达阳性率分别为30%、70%、0%,3者比较差异有统计学意义(P<0.05);遗传性非息肉病性大肠癌TIL数量高于散发性大肠癌(P<0.05),且其分布与FasL蛋白的表达为负相关关系(r=-0.483,P<0.05)。结论 HNPCC癌细胞FasL蛋白相对低表达或缺失可能是TIL记数高于散发性大肠癌和较之预后较好的重要原因之一。     

转化生长因子α mRNA在大肠癌组织和细胞中的表达及其临床意义

为探讨转化生长因子α(TGF-α)mRNA在大肠癌发生、发展中的作用及其临床意义,应用核酸杂交方法对14例大肠癌患者3组不同组织及直肠癌细胞系HR-8348进行TGF-αmRNA表达检测。结果显示:14例大肠癌3组不同组织及细胞系中均有TGF-αmRNA不同程度的表达,以癌远侧组织中表达为最弱:TGF-αmRNA表达与Dukes分期相关,可望作为判断大肠癌恶性程度的指标。另根据其在癌远侧组织中表达减弱趋势,提示临床是否可作为手术切缘的评估指标,尚有待于进一步的研究。     

Lnc-CRCMSL在结直肠癌中的表达及对癌细胞生长的影响

目的探讨长链非编码RNA-CRCMSL(Lnc-CRCMSL)在结直肠癌组织和癌细胞中的表达及对癌细胞生长的影响。方法采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测Lnc-CRCMSL在结肠癌组织和癌旁正常组织、正常结肠上皮细胞及结直肠癌细胞中的表达特点。建立SW480耐药株SW480/DDP,并通过基因干扰实验过表达其Lnc-CRCMSL水平,采用流式细胞术测定细胞的凋亡率,CCK-8测定细胞的增殖活力,划痕愈合实验测定细胞的迁移能力,Transwell测定细胞的侵袭能力,免疫蛋白印迹实验测定基质金属蛋白酶2(MMP2)和基质金属蛋白酶9(MMP9)的蛋白表达。结果Lnc-CRCMSL在结直肠癌组织的表达低于癌旁正常组织,在Ⅱ期、Ⅲ期结直肠癌组织中的表达低于Ⅰ期,且在结直肠癌细胞中的表达量低于正常结肠上皮细胞(P＜0.05)。过表达Lnc-CRCMSL提高了SW480/DDP的凋亡率,抑制了SW480/DDP的增殖、迁移和侵袭活力(P＜0.05)。同时,过表达Lnc-CRCMSL降低了SW480/DDP的MMP2和MMP9表达水平(P＜0.05)。结论Lnc-CRCMSL在结直肠癌中表达异常,对结直肠癌细胞的增殖、凋亡、迁移及侵袭行为具有调控作用。     

大肠癌转移机制的研究进展

大肠癌的发病数和死亡数近年呈上升趋势,侵袭和转移是影响大肠癌患者治疗效果和预后的重要因素.癌细胞从原发灶脱落后,突破细胞外基质(ECM)和基底膜组成的结构屏障,才能向周围组织侵袭或进入血循环及淋巴系统从而进一步向远处转移.肿瘤细胞可以通过释放蛋白水解酶降解细胞外基质和基底膜,侵犯到周围组织中.作为侵袭转移第一步骤,细胞脱落与聚合、黏附与去黏附贯穿在肿瘤细胞转移过程的始终.金属蛋白酶、黏附分子在肿瘤侵袭、转移中的作用己成为目前的研究热点.     

人直肠癌细胞系HR-8348 DNA转化活性的研究及其初步鉴定

从国内建立的人直肠癌细胞系HR-8348提取基因组DNA,与pSV2neo质粒DNA共同转染大鼠成纤维细胞系rat-1细胞.HR-8348细胞DNA 80μg,pSV2neo质粒DNA4μg;采用磷酸钙沉淀法共转染10~6rat-1细胞,用含G418(400μg/ml)的DMEM培养液筛选.转染1周后,未加pSV2neo质粒DNA的对照组rat-1细胞全部死亡.2周后,从G418筛选后转染细胞长出的集落中,挑出具典型形态转化的细胞克隆4个.HR-8348DNA转化灶形成率为0.05个/(1μgDNA·10~6细胞).将其中C1-6转化灶扩     

Fas/FasL在大肠癌及癌旁组织的表达

目的研究Fas/FasL在大肠癌及癌旁组织中的表达及其生物学意义。方法利用免疫组织化学方法对 5 0例大肠癌组织、癌旁交界组织、距肿瘤边缘 5cm处、正常组织的Fas/FasL表达进行检测 ,分析上述组织中Fas/FasL表达的差异。结果大肠癌组织、癌旁交界组织与正常组织Fas/FasL的阳性表达率均有显著性差异 (P<0 .0 5 ) ;距肿瘤边缘 5cm处与正常组织的Fas/FasL的阳性表达率无显著性差异 (P >0 .0 5 )。不同分化的肿瘤组织中Fas/FasL表达均无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论大肠癌中存在Fas表达的下调和FasL表达的上调 ,Fas/FasL系统可能参与了大肠癌细胞的免疫逃避机制     

口腔鳞癌细胞Fas/FasL的表达及对癌细胞凋亡的影响

目的:研究凋亡相关蛋白Fas、FasL在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及对癌细胞凋亡的影响。方法:采用免疫组织化学方法检测10例正常口腔黏膜、38例不同分化程度口腔鳞癌组织Fas、FasL的表达;脱氧核糖核酸末端转移酶介导的原位末端标记(TUNEL)技术,检测鳞癌细胞的凋亡。结果:Fas在正常口腔黏膜中广泛表达,鳞癌组织表达明显下调(P<0.05);FasL在正常口腔黏膜不表达,鳞癌组织表达明显上调(P<0.01);Fas、FasL表达与口腔鳞癌分化程度无关;口腔鳞癌细胞Fas表达阴性组癌细胞凋亡指数(Apop-toticIndex,AI)明显低于Fas表达阳性组(P<0.01),Fas表达阳性组中,随Fas表达的下降,癌细胞AI逐步降低,各组间AI差异有显著性(P<0.01);口腔鳞癌细胞FasL表达阳性组癌细胞AI明显低于FasL表达阴性组(P<0.01);不同程度FasL表达间的癌细胞凋亡指数有差异。结论:口腔鳞癌细胞Fas、FasL的表达与癌细胞的凋亡及肿瘤的形成有密切关系。     

金属硫蛋白和组织蛋白酶B在结直肠癌中的表达及意义

【目的】探讨金属硫蛋白（MT）和组织蛋白酶B（CatB）表达与结直肠癌淋巴结和肝转移的关系。【方法】采用免疫组化方法检测68例结直肠癌原发灶、正常结直肠黏膜、转移淋巴结和肝转移灶组织MT、CatB表达。对比分析MT、CatB表达与临床分期和病理类型的关系。【结果】在68例结直肠癌原发灶中MT、CatB表达阳性率分别为52.9%和47.1%;在正常肠黏膜中表达阳性率分别为26.5%、19.1%;结直肠癌原发灶中MT、CatB表达阳性率均高于正常肠黏膜组织（χ2=9.9512、11.9893,P0.01）。按TNM分期,Ⅲ、Ⅳ期原发灶MT、CatB表达阳性率高于Ⅰ、Ⅱ期（χ2=9.9498、10.0192,P0.01）。低分化腺癌MT、CatB表达阳性率高于高分化和中分化腺癌（χ2=8.8788、9.7183,P0.01）。在34例转移淋巴结中MT和CatB共表达阳性率为47.1%;在16例肝转移组织中,MT和CatB共表达阳性率为50.0%。转移淋巴结和肝转移灶中MT和CatB共表达阳性率高于无转移的结直肠癌原发灶组织（χ2=5.7521、5.0794,P0.05）。【结论】MT、CatB增强表达与结直肠癌淋巴结和肝转移有关,检测结直肠癌组织中MT、CatB表达可做为评价结直肠癌患者预后的重要指标。     

探讨Fas/FasL的表达与大肠癌发展及转移的关系

 【目的】探讨Fas/FasL在大肠癌组织细胞的表达以及它们与肿瘤的发展及转移的关系。【方法】应用免疫组化(SABC)法对41例(包括各个不同Dukes分期)的大肠癌组织以及正常大肠组织的Fas/FasL进行检测。【结果】大肠癌组织Fas阳性率为48.8%,低于正常大肠黏膜组织的Fas阳性率92.7%(P<0.01)。大肠癌组织FasL阳性率为53.7%,高于正常大肠黏膜组织的FasL阳性率4.9%(P<0.01)。在不同分期的大肠癌组织中,Fas阳性率分别为:A期87.5%,B期66.7%,C期25.0%,D期21.2%。而FasL阳性率分别为:A期25.0%,B期33.3%,C期66.7%,D期88.8%。随着Dukes分期的递升,Fas阳性率呈递减趋势,而FasL阳性率呈递升趋势。【结论】在大肠癌组织中,Fas表达下调,以及FasL表达上调,肿瘤细胞凋亡减少,这有利于肿瘤细胞的增殖。Fas/FasL在大肠癌的发生、发展和转移中起着重要的作用,为大肠癌的基因治疗提供了新思路。     

酵母双杂交筛选雄激素受体辅助调节因子267-α(ARA267-α)的相互作用蛋白

目的:通过酵母双杂交系统筛选与雄激素受体辅助调节因子267-α(androgen receptor-associated coregulator 267-α,ARA267-α)有相互作用的蛋白质,为研究ARA267-α的生理功能寻找证据和方向.方法:以能表达ARA267-α中4个PHD(p1ant homeodomain)和1个SET[Su(var)3-9,Enhancer-of-zeste,Trithorax]结构域的pGBKT7-PHD-SET重组质粒为"诱饵",采用酵母融合(yeast mating)方法筛选预转化的人脑cDNA文库.挑选阳性酵母菌落进行质粒提取、限制性内切酶分析和DNA测序.将测序结果在GenBank中进行核苷酸序列同源性比对,确定它们所对应的基因.通过再次酵母双杂交排除假阳性相互作用.结果:筛选cDNA文库共获得约600个阳性酵母菌落,随机挑选其中的65个菌落提取混合质粒.经过在氨苄青霉素培养盘中筛选,共得到43个文库pACT2-cDNA质粒.选取35个酶切片段不同的文库pACT2-cDNA质粒进行测序,测序结果比对揭示,35个cDNA插入片段来源于16种不同的基因.酵母双杂交证实其中RanBPM是ARA267-d的假阳性作用蛋白.结论:通过筛选cDNA文库发现ARA267-α可以与多个不同的蛋白质相互作用,这提示ARA267-α可能是一个具有多种生理功能的蛋白分子,而RanBPM极可能是一个转录因子.     

大肠癌并肝转移的蛋白质组学研究

目的采用蛋白质组学技术研究有转移组和无转移组大肠癌组织蛋白质组表达的差异,分析和鉴定两组间特异表达的肿瘤蛋白质,探索大肠癌并肝转移发生的机制. 方法用等电聚焦/SDS聚丙烯酰胺双向凝胶电泳对比分析20例大肠癌患者原发灶、癌旁肠黏膜和肝转移灶中蛋白表达,经肽质量指纹谱分析、鉴定差异蛋白质.结果双向电泳图像对比分析表明,癌旁大肠黏膜组织、癌原发灶和肝转移灶中蛋白质表达有明显差异.在肝转移组中存在AnnexinA2蛋白和JE0350蛋白特异表达,磷酸丙酮酸水合酶和CAC15744蛋白表达上调;在无肝转移组存在CAD80231和A38983蛋白特异表达,AAH01166蛋白表达上调. 结论大肠癌并肝转移者与无肝转移者在蛋白质组表达上存在一定的差异.对这些差异蛋白质的进一步深入研究,可帮助了解大肠癌易发生远处转移的蛋白质组学机制及采取相应的处理对策.     

大肠癌Fas、FasL表达、突变与肝转移关系的研究

目的：探讨Ｆａｓ、ＦａｓＬ系统表达、突变与大肠癌转移的关系;方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ和ＣＲ－ＳＳＣＰ方法检测大肠癌原发灶、肝转移灶、癌旁肠粘膜、门静脉 Ｆａｓ、ＦａｓＬ表达、突变。结果：在８６例大肠癌原发灶、肝转移灶、癌旁肠粘膜、门静脉血淋巴细胞中Ｆａｓ表达率分别为６７．４％、６３．２％,４１．９％,８７．２％。Ｆａｓ突变率分别为５０．０％。７０．８％,２５％,８．９％。在大肠癌栽⒃睢⒏巫圃钪校     

CytoTrap酵母双杂交筛选与乙型肝炎病毒HBx 蛋白相互作用的肝细胞蛋白

目的筛选与乙型肝炎病毒HBx蛋白发生相互作用的肝细胞蛋白。方法构建诱饵重组载体pSos-HBx,经测序正确后将
其转化酵母菌cdc25Hα中,检测其在酵母中的表达及有无自激活作用,并利用CytoTrap酵母双杂交的方法筛选与诱饵蛋白HBx
相互作用的肝细胞蛋白。结果获得重组诱饵质粒pSos-HBx,验证可以在酵母中表达诱饵蛋白Sos-HBx,且诱饵质粒在此系统
中没有自激活作用。利用此系统筛选出6个能与HBx相互作用的肝细胞蛋白,分别为纤连蛋白1、翻译调控肿瘤蛋白1、核受体
结合蛋白IQ-WD1、软泡抑素、血清类粘蛋白1、二硫化物异构酶家族A3。结论成功克隆出乙型肝炎病毒HBx蛋白的结合蛋白,
为进一步研究HBx蛋白在肝炎或肝癌过程中发挥的作用提供了新线索。
     

酵母双杂交文库筛选HBX相互作用蛋白*

目的：筛选鉴定新的乙肝病毒X蛋白（hepatitis B viral X protein,HBX）相互作用蛋白。方法：以HBX为诱饵蛋白,将其与酿酒酵母转录因子GAL4 DBD（DNA binding domain）融合表达,将人肝脏cDNA文库编码的蛋白与GAL4的AD区（activation domain）融合表达。通过酵母双杂交筛选鉴定肝脏中与HBX相互作用的蛋白。筛选得到的阳性酵母转化子,经质粒提取和测序后,分析其所包含的序列编码的蛋白,通过再次验证,初步确定该蛋白是否与HBX具有相互作用。结果：筛选得到5个潜在的能与HBX相互作用的蛋白。结论：通过酵母双杂交cDNA文库筛选,得到多个潜在的HBX相互作用蛋白,进一步的验证及功能研究将对揭示HBX促进肝癌发生的机制起到重要的推动作用。     

乙型肝炎病毒核心抗原肝细胞结合新蛋白的功能研究

目的为探讨乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)在乙型肝炎发病机制中的作用,筛选、克隆出人肝细胞中与HBcAg相互作用的未知蛋白基因C12并进一步对其功能作初步研究.方法应用酵母双杂交系统-3筛选到与肝细胞蛋白结合的蛋白编码基因C12,克隆该基因并用再次用重回交实验证实作用可靠后,将基因与荧光蛋白基因融合表达,分析该基因表达产物在哺乳动物细胞中的定位;用MTT代谢实验了解C12表达对哺乳动物细胞生长代谢的影响作用;酵母双杂交实验寻找肝细胞中与之相互作用的蛋白;基因芯片技术了解C12基因表达对其他基因表达的影响.结果成功地筛选并克隆出HBcAg的肝细胞结合蛋白C12基因,经回交实验再次证实C12基因的表达产物C12蛋白与HBcAg确切的结合作用.该基因与荧光蛋白基因融合表达转染293细胞、L02细胞后48 h细胞呈现均匀分布的强绿色荧光信号,提示C12蛋白可能主要定位在细胞质内;通过在Bel7402、L02细胞系中进行MTT检测,发现C12在上述细胞中表达没有对细胞的生长繁殖产生明显影响;用酵母双杂交系统-3筛选出肝细胞中与C12蛋白相互作用的蛋白基因16种;基因芯片技术在1 152个基因中筛选出17个差异表达的基因.结论 C12蛋白主要定位在细胞质内,对哺乳动物细胞生长繁殖无明显影响,能与肝细胞中多种蛋白结合,在细胞内的过表达引起的生物过程涉及许多不同基因表达的变化.     

酵母双杂交技术筛选与HCMV-UL146编码产物相互作用蛋白

目的 应用酵母双杂交技术,在人胎脑文库中筛选与人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV) UL146基因编码蛋白相互作用蛋白,以探讨HCMV-UL146的生物功能.方法 应用酵母双杂交系统,构建pGBKT7-UL146诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人胎脑cDNA文库质粒的酵母相互作用,于涂有X-α-gal营养缺陷型培养基上筛选生长.挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌,提取质粒DNA进行测序分析.结果 pGBKT7-UL146构建成功.经严格筛选,共有200余个阳性克隆,分离测序80个克隆,成功筛选出30个与HCMV-UL146特异性相互作用的蛋白.结论 HCMV-UL146与多种蛋白有相互作用,提示其生物学功能复杂.此结果为进一步研究HCMV-UL146基因功能提供依据.     

MMP-7和FasL在大肠癌的表达及其相互作用

目的:研究MMP7和FasL在大肠癌的表达及其意义。方法:应用免疫组化SP法检测MMP7和FasL蛋白在正常黏膜、非瘤性息肉、腺瘤和大肠癌等4组不同大肠病变组织中的表达情况,分析其间的相互作用关系。结果:①MMP7蛋白染色阳性率在4组分别为8.3%,10.0%,52.6%和70.4%,后2组显著高于前2组(均P<0.01),并且第4组显著高于第3组(P<0.05);FasL蛋白在4组阳性率分别为:0、10.0%、34.2%和63.6%。大肠癌组中FasL蛋白的表达阳性率显著高于前3组(均P<0.01)。②MMP7和FasL蛋白在大肠癌的表达与患者的性别、年龄、部位无明显相关性(P>0.05),随着分化程度的降低有增加趋势(P<0.05),在淋巴结有转移组、Duke’s分期C期及以上组分别高于淋巴结无转移组、Duke’s分期A、B期组(P<0.05)。③MMP7蛋白阳性表达与FasL蛋白阳性表达正相关(P<0.01)。结论:MMP7与FasL在腺瘤和大肠癌均有高表达,在大肠癌的发病过程中,它们的共同高表达具有协同效应,共同促进大肠癌的发生和发展。