中国钩端螺旋体rRNA基因限制性内切酶酶切位点多态性分类研究

目的初步建立我国致病性钩端螺旋体ｒＲＮＡ基因限制性内切酶酶切位点多态性分类体系。方法采用ｒＲＮＡ基因限制性内切酶酶切位点多态性（ＭＲＳＰ）方法对６５个血清型７５株国内外钩端螺旋体参考株及２７株野生株进行分析。结果１６ＳｒＲＮＡ及２３ＳｒＲＮＡ基因在ＨｉｎｆⅠ、ＤｄｅⅠ的酶切位点上呈多态性,分别存在１８种和２４种不同的图谱。结合两种方法则有３４种不同的图谱。致病性钩端螺旋体间ＭＲＳＰ谱型差别相对较小,遗传距离较近,而它们与非致病性钩端螺旋体的ＭＲＳＰ谱型相差大,遗传距离远。国内主要流行型的ＭＲＳＰ只表现为ＭＲＳＰ１型和２型,非主要流行型的ＭＲ－ＳＰ型变化较多。大多数野生株与相应的参考株的ＭＲＳＰ型相同,个别具有不同ＭＲＳＰ型的野生株与相应参考株的遗传距离较近。结论ｒＲＮＡ基因限制性内切酶酶切位点多态性（ＭＲＳＰ）可用于钩体分类,而且是钩体病分子流行病学调查的一种好方法     

中国钩端螺旋体rRNA基因酶切片段长度多态性（RFL…

用限制性内切酶ＥｃｏＲ Ⅰ对５６株国内外钩体参考株和２８株野生株进行ｒＲＮＡ基因ＲＦＬＰ分析时发现；８４个菌株中共有６６个不同的核糖核酸型，除Ｂａｌｌｕｍ和Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ型相同；赛尔东尼群的Ｈａｉｎａｎ和Ｗｈｉｔｃｏｍｂｉ型相同，赛罗群的Ｗｏｌｆｆｉ和Ｓａｘｋｏｅｂｉｎｇ型相同，爪哇群部的Ｍｅｎｇｒｕｎ和Ｍｅｎｇｍａ型相同外，其它的血清型都有互不相同ＲＴ。该方法在ＤＮＡ同源性研究相吻合，同一个     

钩端螺旋体DNA限制性内切酶图谱鉴定分类的初步研究

用ＥｃｏＲⅠ等六种限制性内切酶消化分析了七日热群和波摩那群各型标准株以及一些野生株钩端螺旋体ＤＮＡ。结果表明，不同血清型菌株具有完全不同的限制性内切酶图谱（ＲＥＰ）；来自不同地域、不同时期、不同宿主的同型野生株ＲＥＰ一致，与它们相应的标准株ＲＥＰ没有差别或仅有微小差别。说明钩端螺旋体ＤＮＡ内切酶图谱具有血清型特征性ＲＥＰ，而且相当稳定。本研究测算出七日热和波摩那各型标准株的ＥｃｏＲⅠＲＥＰ五条高分子带的分子量，并以此作为标准鉴定了部分野生苗株。结果显示，仅凭ＥｃｏＲⅠＲＥＰ两条最大的带就可鉴别两群各型菌株。我们认为ＲＥＰ是一种比较灵敏、快速、简便、准确的钩端螺旋体分类方法，所分型别与传统的血清学型别基本一致。     

中国钩端螺旋体 rRNA 基因酶切片段长度多态性(RFLP)分析

用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ对５６株国内外钩体参考株和２８株野生株进行ｒＲＮＡ基因ＲＦＬＰ分析时发现：８４个菌株中共有６６个不同的核糖核酸型（ＲＴ），除Ｂａｌｕｍ和Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ型相同；赛尔东尼群的Ｈａｉｎａｎ和Ｗｈｉｔｃｏｍｂｉ型相同；赛罗群的Ｗｏｌｆｉ和Ｓａｘｋｏｅｂｉｎｇ型相同、爪哇群中的Ｍｅｎｇｒｕｎ和Ｍｅｎｇｍａ型相同外，其它的血清型都有互不相同ＲＴ。该方法和ＤＮＡ同源性研究相吻合，同一个基因型往往拥有共同的核心片段。在所检测的中国菌株中致病性钩体至少有５个基因种，腐生菌一个基因种，细丝体一个基因种。研究中发现在我国部分新的血清型菌株以及野生株中可能存在新的基因种，尤其在流感伤寒、黄疸出血、爪哇以及七日热等血清群中可能性更大。     

钩端螺旋体外膜抗原基因ompL1在卡介苗中的克隆和初步 …

目的 将钩端螺旋体外膜基因ｏｍｐＬ１克隆到大肠杆菌－卡介苗（Ｅ．ｃｏｌｉ－ＢＣＧ）穿梭质粒载体ｐＹ６００２中，将重组质粒导入ＢＣＧ并对重组ＢＣＧ的表达进行初步表达研究。方法 采用ＰＣＲ技术直接从致病性钩端螺旋体（钩体）赖型０１７株基因组中扩增钩体外膜蛋白基因ｏｍｐＬ１，并克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－ＢＣＧ穿梭质粒载体ｐＹ６００２中，重组质粒经电转化导入ＢＣＧ。斑点杂交筛选重组ＢＣＧ，再通过免疫印迹对其表达     

中国钩端螺旋体强毒株017膜蛋白基因的质粒载体构？…

目的 构建表达我国钩体强毒赖型０１７株外膜蛋白的重组质粒。方法 用ＰＣＲ方法扩增并回收０１７株钩体外膜蛋白基因片段ＯｍｐＬ１，将其与质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ重组，通过菌落颜色和酶谱分析筛选出重组质粒。     

黄疸出血群及犬群中三个新型钩端螺旋体的分类鉴定

目的对四川省检出的三个新型钩端螺旋体（下称钩体）７９－５７、８１－５２２及８２－２２４株进行分类鉴定。方法采用凝集试验及凝集素交叉吸收试验法反复鉴定。结果确定７９－５７株为犬群新型钩体，命名为邛崃型，８１－５２２及８２－２２４株为黄疸出血群新型钩体，分别命名为仁寿型和凉山型。结论这些新型钩体菌株的发现为国际国内参考菌株系列提供了新的血清型，在钩体分类学发展及血清学鉴定中具有重要科学意义。     

中国强毒钩端螺旋体膜蛋白基因的真核表达及基因免疫

目的　检测含有强毒赖型钩体OmpL1外膜蛋白基因的 2个重组质粒pBC OmpL1和pcDNA3 OmpL1在哺乳动物细胞中的表达 ,及其作为DNA疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果。方法　采用脂质体转染法 ,以重组质粒转染COS7细胞 ,通过抗性标志筛选稳定转染入质粒的细胞 ,RT PCR和Westernblot检测被转染细胞OmpL1基因的表达情况。然后 ,将重组质粒以肌注法免疫BALB c小鼠 ,每 2周 1次 ,共 3次 ,ELISA检测小鼠的体液免疫应答水平。结果　RT PCR结果显示 ,重组质粒转染组在约 1kb处出现特异的扩增带 ;Westernblot检测显示 ,重组质粒转染组总蛋白样品在相对分子质量 (Mr)为 33.5× 10 3 处出现特异的蛋白带 ,而空质粒载体转染组均没有此相应的DNA或蛋白质条带。两质粒第 2次免疫小鼠 2周后 ,10 0 μg重组质粒pBC OmpL1和pcDNA3 OmpL1DNA免疫组产生了效价为 1 196 83的高滴度抗体 ,注射 5 0 μgpcDNA3 OmpL1+5 0 μgpcDNA3的小鼠产生滴度为 1 6 5 6 1较高的抗体 ,第 3次免疫 2周后 ,抗体水平下降。结论　两重组质粒者均能在体外培养的哺乳动物细胞中表达钩体OmpL1蛋白质 ,以其免疫小鼠后 ,均诱导产生高滴度的特异性抗体 ,其效价与全钩体疫苗相当。     

黄疸出血群钩端螺旋体MLVA分型研究

目的 初步探讨MLVA(multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis)技术在黄疸出血群钩端螺旋体基因分型中的应用.方法 选取7个VNTR位点,对我国致病性钩端螺旋体黄疸出血群菌株提取基因组DNA,采用PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳技术检测,应用BioNumerics(Ver-sion4.0)软件进行聚类分析.结果 共对117株钩端螺旋体的7个VNTR位点进行了检测,聚类分析分为3个群(A群、B群、C群)28种基因型,其中A群占11.97%(14/117)、B群占0.85%(1/117)、c群占87.18%(102/117);多态性指数介于0.0831与0.8005之间;MLVA基因型存在明显的地域性.结论 MLVA分型技术可初步对钩端螺旋体进行遗传学分类鉴定,应用该技术,将在钩体病分子流行病学研究中发挥重要的作用.     

我国常见钩端螺旋体蛋白质免疫化学及免疫生物学特性…

分别用我国常见的１５群１５型钩端螺旋体多克隆抗体对我国常见的１５群１５型钩端螺旋体全菌蛋白进行了Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析。结果显示：用不同群的多克隆抗体与１５群１５型钩端螺旋体参考株的全菌蛋白反应，其图谱并不相同，表现在阳性反应带数量的多少和分子量的变化；而用同一群多克隆抗体与１５群１５型钩端螺旋体参考株的全菌蛋白反应，其Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ图谱非常相似，都有３条分子量分别     

利用抑制消减杂交技术研究钩端螺旋体致病相关基因

目的：利用抑制消减杂交技术（SSH）,比较致病与非致病钩端螺旋体（简称钩体）之间基因组差异,筛选致病钩体特有的基因片段。方法：以赖型O17株为tester,非致病性patocI株为driver,选择合适的四碱基内切酶将基因组酶切,连接特殊设计的adaptor进行消减杂交和PCR,得到消减混合物,与T／A克隆载体连接,转化JM109建立差异消减文库,经PCR和Southern blot筛选鉴定阳性克隆,进而对部分片段进行测序和同源分析。结果：Alu I适于将钩体酶切成用于SSH技术的小片段;经SSH筛选鉴定得到30个片段大小为200－1300bp的阳性克隆,部分已测序的片段中1个与硫胺素合成蛋白高度同源,4个与GenBank无明显同源性,可能为赖型致病钩体所特有而非致病钩体缺失的基因片段,已被GenBank收录,收录号分别为AF300873－300877。结论：SSH是一种有效、灵敏、高特异的比较分析基因组差异的方法,对钩端螺旋体致病基因的筛选、基因组分化、分子遗传研究等具有重要意义。     

钩端螺旋体属特异性外膜蛋白抗原的分析

致病性问号钩端螺旋体(简称钩体)血清群众多,各群间交叉保护作用较弱或无,目前国内外均采用当地流行的钩体血清群来制备多价钩体疫苗,但对疫苗中未包含钩体血清群感染的保护作用极其有限,易造成钩体病的暴发流行。已知80℃灭活、生理盐水回收的腐生性双曲钩体PatocⅠ株全细胞抗原(TR PatocⅠ)能与所有钩体病人血清发生凝集反应,但其抗血清能否凝集不同血清群的问号钩端螺旋体尚不清楚。本研究中,我们采用TR PatocⅠ免疫的兔抗血清与我国15群17型问号钩体参考标准株、2群2型双曲钩体国际标准株进行了显微镜凝集试验(MAT) ,发现该抗血清能…     

钩端螺旋体外膜抗原基因ompL1在卡介苗中的克隆和初步表达

目的将钩端螺旋体外膜基因ｏｍｐＬ１克隆到大肠杆菌－卡介苗（Ｅ．ｃｏｌｉ－ＢＣＧ）穿梭质粒载体ｐＹ６００２中，将重组质粒导入ＢＣＧ并对重组ＢＣＧ的表达进行初步表达研究。方法采用ＰＣＲ技术直接从致病性钩端螺旋体（钩体）赖型０１７株基因组中扩增钩体外膜蛋白基因ｏｍｐＬ１，并克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－ＢＣＧ穿梭质粒载体ｐＹ６００２中，重组质粒经电转化导入ＢＣＧ。斑点杂交筛选重组ＢＣＧ，再通过免疫印迹对其表达进行初步研究。结果在所得６个重组ＢＣＧ中，有３个表达了ｏｍｐＬ１基因产物，其中一个表达较强。结论本研究为发展新一代高效广谱的钩体基因工程疫苗打下了基础。     

东莨菪碱综合治疗钩端螺旋体病

目的观察东莨菪硷等综合治疗钩端螺旋体病（简称钩体病）肺出血型的疗效。方法将３５６例钩体病患者按发生年限分为两组：对照组９６～９７年为１０９例,观察组９８年为２４７例。对照组采用传统的内科治疗方法,观察组采用东莨菪硷为主综合治疗。两组肺出血型分组比例无差异（Ｐ＞０．０５）。结果观察组的疗效明显优于对照组（Ｐ＜０．０１）,观察组的病死率明显降低（Ｐ＜０．０１）。结论使用东莨菪硷、酚妥拉明等综合治疗肺出血型钩体病获得满意疗效,值得临床推广应用。     

靶向敲除问号钩端螺旋体鞭毛相关fliN基因及其突变株致病性变化

其引起J774A.1细胞坏死和细胞凋亡率(30.6%和22.7%)也明显低于野生株(48.2%和35.2%)(P＜0.05).结论 fliN基因产物与问号钩体黏附细胞、分泌毒力因子和诱导细胞凋亡密切相关.采用基于自杀质粒基因敲除技术可用于研究问号钩体靶基因产物的致病机制.     

不同种属钩端螺旋体疏水外膜蛋白的特征研究

研究钩端螺旋体外膜蛋白的结构和抗原特征，对不同种属钩端螺旋体疏水外膜蛋白进行了比较研究。方法 用Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１１４抽提１０株同种属钩体疏水外膜蛋白用不连续缓冲系统制备５％浓缩胶和１２％的分离胶，行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，在恒压下１８０Ｖ电泳５小时，考巴斯亮兰Ｇ－２５０染色。     

钩端螺旋体内毒素的实验研究 Ⅴ 钩端螺旋体脂多糖增强机体特异性抗感染能力的作用

波摩那群波摩那型56608株钩端螺旋体脂多糖(L-LPS)免疫的豚鼠能抵抗同株钩端螺旋体的攻击而免于发病和死亡,旦其心血和肾脏培养阳性率也明显下降。L-LPS免疫动物后可产生以IgM为主的群特异性抗体。该抗体当有补体存在时,能在体外裂解钩端旋螺体。此外,L-LPS尚能特异性地抑制豚鼠腹腔巨噬细胞的粘附作用。实验结果提示L-LPS为一种保护性抗原,可特异性地增强机体抗感染的能力。