SD大鼠骨髓基质细胞体外培养及分化研究

目的 研究SD大鼠骨髓基质细胞(marrow stromal cells,MSCs)的生物学特性及其成骨和成脂分化能力.方法 处死16只6月龄SD大鼠动物,非连续密度梯度离心分离大鼠MSCs,传代后分别在成骨及成脂培养基中诱导培养14天,观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,通过组织特染对MSCs的成骨,成脂表型进行鉴定,计数阳性染色细胞百分比.结果 SD大鼠MSCs在体外具有成骨细胞分化潜力,油红0染色显示成脂诱导培养基可定向诱导其分化.结论 本实验成功分离SD大鼠MSCs且保持分化能力.     

大鼠脂肪干细胞的体外分离培养及对脂肪颗粒移植的影响

目的分析体外大鼠脂肪干细胞(ADSCs)混合脂肪移植后的存活情况。方法无菌条件下切取大鼠腹股沟脂肪组织,消化、分离培养得到第3代ADSCs,行成骨诱导(茜素红染色)和成脂诱导(油红O染色)。用CM-Dil荧光标记第3代ADSCs,24只大鼠每只背部皮下3处分别植入1.5ml脂肪颗粒、1.5ml荧光标记的ADSCs(密度为5×107个细胞/ml)和0.9ml荧光标记的ADSCs+0.6ml脂肪颗粒。术后2周、1个月和3个月每次取出8只大鼠的移植物,石蜡切片HE染色观察病理变化,冰冻切片荧光显微镜下观察ADSCs定位。结果 ADSCs成骨诱导2周后茜素红染色阳性,成脂诱导3周后油红O染色阳性。ADSCs与脂肪颗粒混合移植能明显改善脂肪组织的病理学变化。结论体外分离培养的大鼠ADSCs具有成骨、成脂分化的潜能,能改善脂肪颗粒移植时的脂肪组织的液化吸收现象。     

体外诱导人牙龈成纤维细胞多向分化潜能的实验研究

目的 探索人牙龈成纤维细胞（hGFs）是否具有多向分化潜能, 为组织工程学提供新的细胞来源。方法 经志愿者知情同意后收集健康牙龈组织, 组织块法培养 hGFs。取第 3 代 hGFs 进行成骨、 成软骨和成脂诱导, 未分化诱导的细胞为对照组。分别用碱性磷酸酶 （ALP） 染色和茜素红染色、 阿利新蓝染色、 油红 O 染色检测细胞成骨、 成软骨和成脂能力。实时定量聚合酶链反应 （PCR） 检测细胞中成骨分化标志基因 ALP、 runt 相关转录因子 2 （Runx2）、成软骨分化标志基因聚集蛋白聚糖（AGR）和成脂分化标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（PPARγ2）的表达。结果 成骨诱导组培养至 7 d 时 ALP 染色可见大量的蓝紫色沉淀, 28 d 时细胞周围有大量红染的钙结节沉积,而对照组无钙结节, 培养至 14 d 细胞中 ALP 和 Runx2 表达明显高于对照组（P < 0.01）。14 d 时成软骨诱导组阿利新蓝阳性, 成脂诱导组可见红色的脂肪滴, 而对照组 2 种染色为阴性, AGR、 PPARγ2 表达均明显高于对照组（P <0.01）。结论 hGFs 具有成骨、 成软骨和成脂分化的多向分化潜能。     

人牙龈成纤维细胞和牙周膜韧带细胞多向分化潜能的比较

目的 体外培养人牙周膜韧带细胞 （HPDLCs） 和人牙龈成纤维细胞 （HGFs）, 对比两者成骨、 成软骨以及成脂的多向分化潜能的差异。方法 运用酶消化结合组织块法体外培养 HPDLCs 和 HGFs, 选择生长状态良好的 3~4 代 HPDLCs 和 HGFs, 进行成骨、 成软骨、 成脂诱导, 未分化诱导的细胞作为对照组。分别用茜素红染色、 油红 O 染色以及阿利新蓝染色分别检测两种细胞的成骨、 成软骨及成脂分化能力。半定量逆转录聚合酶链反应 （RT-PCR） 检测 HPDLCs 和 HGFs 中相关标志基因骨钙素(OCN)、 Ⅰ型胶原蛋白 （Col 1）、 runt 相关转录因子 2 （RUNX2）、 过氧化物酶体增殖物激活受体γ2 （PPARγ2）、 X 型胶原蛋白 （Col 10） mRNA 的表达。结果 成骨诱导两种细胞培养至 28 d 时, 细胞周围均有红染钙结节形成, HPDLCs 形成的钙结节明显多于 HGFs; 成软骨诱导两种细胞 14 d 时均可见胞质蓝染的细胞, HGFs 较 HPDLCs 明显; 成脂诱导两种细胞 21 d 时, 可见红色脂肪滴形成, HPDLCs 形成的脂肪颗粒明显少于 HGFs。HGFs 和 HPDLCs 分化培养 7 d 和 14 d 后, 均有 OCN、 Col 1、 RUNX2、 PPARγ2 和 Col 10 的表达, 在 14 d 时的表达均高于 7 d; HPDLCs 中 OCN、 Col 1、 RUNX2 的表达高于 HGFs, PPARγ2、 Col 10 的表达低于 HGFs（均 P＜ 0.05）。结论 HPDLCs 的成骨能力较 HGFs 强, 成软骨和成脂能力较 HGFs 弱。     

高表达miR-25-3p对小鼠骨实质来源间充质干细胞成脂分化的抑制作用

目的 探究miR-25-3p对小鼠骨实质来源间充质干细胞（MSC）成脂分化的影响。方法 (1)取1周龄C57BL/6J小鼠胫骨和股骨分离培养MSC。体外培养扩增至P3代,吉姆萨染色,倒置显微镜镜下观察其形态;用流式细胞术检测其细胞表型;经成脂和成骨诱导液分别诱导分化7和14 d,分别用油红O染色和碱性磷酸酶染色检测其体外成脂和成骨分化能力,并用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测其成脂分化关键转录因子CCAAT增强子结合蛋白α(CEBPα)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)以及成骨标志性蛋白骨钙素（OCN）和成骨分化关键转录因子Runx相关转录因子2(Runx2)mRNA表达。(2)合成与MSC成脂分化相关的微RNA(miRNA)即miR-25-3p模拟物,将miR-25-3p模拟物及其对照miRNA分别瞬时转染P3代MSC,用荧光显微镜观察转染细胞Cy3红色荧光强度鉴定细胞转染效率,RT-qPCR检测转染细胞miR-25-3p表达水平。(3)将未转染、转染对照miRNA和转染miR-25-3p模拟物的P3代MSC成脂诱导分化7 d,用油红O染色检测细胞脂滴形成数目,RT...     

人绒毛膜来源的间充质干细胞成骨成脂分化潜能

目的:探讨人绒毛膜来源的间充质干细胞(hCDMSC)体外生长特性和成骨成脂分化潜能,证实人绒毛膜来源的间充质干细胞作为组织工程种子细胞的可行性.方法:取胎盘组织基蜕膜面用胶原酶和胰蛋白酶法分离培养,通过传代扩增观察细胞形态,MTT法检测细胞增殖曲线,体外向成骨、成脂诱导分化,茜素红和油红O染色鉴定细胞分化能力,RT-P...     

成人骨髓间充质干细胞多向分化潜能特性

目的 探讨体外不同诱导条件下成人骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞、脂肪细胞分化的能力.方法 采用地塞米松、胰岛素、β-磷酸甘油、抗坏血酸等诱导培养液对体外分离培养的成人骨髓MSCs进行成骨细胞及脂肪细胞的定向诱导并进行鉴定.结果 成人骨髓MSCs向成骨细胞诱导后可见钙盐分泌,茜素S与钙盐结合成红色,四环素标记后可见到黄色发光的钙化结节;而向脂肪细胞诱导后则可见含有多量脂滴的脂肪细胞,苏丹Ⅳ染色脂滴呈红色,苏木精染色细胞核呈蓝色.结论 成人骨髓MSCs在体外一定条件下可以诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,具有多向分化潜能.     

阿伦磷酸钠对小鼠骨髓基质细胞成骨和成脂分化的影响

目的在离体条件下研究阿伦磷酸钠对小鼠骨髓基质细胞(BMSCs)成骨和成脂分化的影响。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测阿伦磷酸钠对骨髓基质细胞增殖的影响,碱性磷酸酶(ALP)活性测定法检测阿伦磷酸钠对骨髓基质细胞(MSCs)成骨分化的影响,油红O染色形态学及定量测定法检测阿伦磷酸钠对骨髓基质细胞成脂分化的影响。结果1×10-10,1×10-9,1×10-8,1×10-7,1×10-6和1×10-5mol.L-1的阿伦磷酸钠可以促进小鼠原代骨髓基质细胞增殖,抑制骨髓基质细胞的成骨分化及成脂分化。结论阿伦磷酸钠对骨质疏松症的预防和治疗作用可能通过抑制骨髓基质细胞的成脂分化,进而减少脂肪细胞细胞因子的分泌而抑制破骨细胞的形成、激活以及骨吸收功能。     

兔骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的实验研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为成骨细胞的途径.方法 抽取兔骨髓,以全骨髓贴壁培养法进行体外培养,贴壁细胞传代.取第3代细胞诱导培养,倒置显微镜下观察细胞形态.培养16 d后,用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)/氯化硝基四氮唑蓝(NBT)底物显色试剂检测碱性磷酸酶(AP),茜素红染色检测钙结节.结果 全骨髓贴壁培养法可获得MSCs,原代和传代培养的MSCs具有活跃的增殖能力.诱导培养后,AP检测与钙结节染色均为强阳性.结论 兔骨髓中培养出的MSCs可以定向分化为成骨细胞,可用作骨组织工程中的种子细胞.     

Wnt10b与骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化的关系

目的研究Wnt10b与骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导间充质干细胞(MSCs)骨向分化的关系,以及相关的分子机制。方法利用PCR、Western blot、组织化学染色等方法,检测BMP9对Wnt10b表达的影响,以及Wnt10b对BMP9诱导的成骨分化的影响。同时,通过定量PCR、Western blot、油红O染色、流式细胞术等,分析Wnt10b影响BMP9成骨分化诱导作用的可能机制。结果 Wnt10b在C3H10T1/2、C2C12、MEFs和MC3T3-E1细胞中均有表达,BMP9在C3H10T1/2细胞中上调Wnt10b的表达水平。Wnt10b增强BMP9在C3H10T1/2细胞中增加OCN蛋白水平和促进钙盐沉积的能力,沉默Wnt10b减弱BMP9的作用。Wnt10b并不改变BMP9对细胞周期的影响,但能增强BMP9诱导的Smad1/5/8磷酸化,沉默Wnt10b减弱BMP9对Smad1/5/8磷酸化的促进作用。此外,Wnt10b抑制BMP9在C3H10T1/2细胞中诱导的成脂分化,沉默Wnt10b则促进BMP9的成脂分化诱导作用。结论 Wnt10b可以促进BMP9诱导的MSCs骨向分化,这种作用可能与增强BMP/Smad信号转导有关。