采用SEREX方法从cDNA表达文库中筛选大肠癌抗原基因

目的寻找人源性大肠癌特异性抗原基因。方法采用SMART技术构建人大肠癌组织来源的cDNA噬菌体表达文库,以自体或异体大肠癌患者血清按SEREX方法进行免疫筛选,对平板法扩增获得的阳性克隆片段导入克隆载体PUCm-T后进行测序、鉴定和BLAST同源性比较,并根据cDNA序列进行生物信息分析。结果构建了3个大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库,其滴度分别为2.39×10^6pfu/mL、2.07×10^6pfu/mL和1.86×10^6pfu/mL,插入片段长度为0.5-4 kb,平均分别为1.4、1.6和1.3 kb,重组率最高达到97.5%。选择高滴度文库扩增后滴度达到4.1×10^10pfu/mL。SEREX筛选共获得16个阳性克隆,代表12个不同抗原基因,其中10个基因片段为已知抗原基因,如IFITM1、CD24、Survivin、KLK6等,2个为未知EST片段。根据序列分析,筛选出的抗原基因有结构基因、调节基因、代谢相关基因等。结论利用SEREX方法筛选出大肠肿瘤相关抗原基因并获得2个肿瘤抗原候选基因。     

人源性大肠癌Fab段噬菌体抗体库的筛选与鉴定

目的　通过大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞抗原对人源性大肠癌Fab段噬菌体抗体原始库的反复筛选 ,鉴定抗体库的特性并检测其与人大肠癌相关抗原的结合活性。方法　PCR鉴定阳性重组菌xL1 B1ue中人大肠癌相关抗体Fab段的插入率 ,构建人大肠癌Fab段原始库 ,提取 3例用于构建原始抗体库的致敏大肠癌组织抗原 ,13例非致敏大肠癌组织抗原及 3种体外培养的大肠癌细胞株Lovo、HT 2 9、LS 174T的抗原各自等体积混合 ,利用 3组混合抗原分别对原始抗体库进行 3轮筛选 ,将筛选后的三个三级库等体积混和后通过ELISA法鉴定其与人大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞的结合活性 ,取胃癌、食管癌及正常肠粘膜组织和体外培养的胃癌、肝癌细胞进行对照研究。结果　N片段及κ链的插入率分别为 40 %和 70 % ,Fd片段及κ链均插入质粒Pcomb3的重组率为 2 8% ,Fab段基因库库容为 2 .1× 10 6,3组大肠癌混合抗原分别对原始抗体库进行 3轮筛选后 ,抗体库均得到了不同程度的富集 ,ELISA显示富集后的Fab段抗体库对大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞均有较特异性的结合活性。结论　利用噬菌体抗体库技术筛选出了相关抗大肠癌Fab段抗体 ,且筛选后的抗体片段与人大肠癌相关抗原有较特异性的结合活性     

人源性大肠癌自然致敏噬菌体抗体Fab呈现库的构建与筛选

目的构建大肠癌病人自然致敏淋巴结抗体 Fab 段噬菌体呈现库,初步筛选相关抗大肠癌抗体。方法取大肠癌病人转移淋巴结,提取淋巴结总 RNA,逆转录 PCR 扩增重链 Fd 和 k 轻链 cDNA。依次将 PCR 产物插入载体 pComb3的相应部位,构建人源性大肠癌噬菌体 Fab 基因库,并应用噬菌体表面呈现技术对该抗体库进行淘选及鉴定。结果所选2种 Ig 亚类的重链 Fd 片段、2种 k 轻链 cDNA 得到扩增。Fd 片段和 k 轻链均插入 pComb3的重组率为40%,Fab 噬菌体表达库容达1.48×10~6。经3轮淘选,抗体库得到约120倍的富集。3轮抗体库的点印记免疫染色均显示有 Fab 表达:酶联免疫吸附实验显示其与大肠癌抗原有结合活性。结论成功构建了大肠癌病人自然致敏淋巴结抗体 Fab 段噬菌体呈现库,利用噬菌体抗体库技术,可筛选相关抗大肠癌抗体。     

用SEREX方法筛选HCC抗原及hcct-19表达谱的检测

目的:用SEREX方法鉴定HCC表达的肿瘤抗原,检测hcct-19的表达谱．方法:将HCC表达文库铺板,IPTG诱导蛋白质表达,BSA封闭．同1:1 000稀释的预吸收 HCC患者血清反应后,与1:5 000稀释的羊抗人抗体反应,在BCIP／NBT的作用下显色,挑取阳性克隆噬菌斑块,重复筛选和铺板3次,直至得到一致的单克隆免疫阳性重组噬菌体．挑取阳性克隆噬菌斑,用载体克隆位点两端的通用引物进行PCR扩增,PCR产物纯化测序, 序列结果用BLAST软件同GenBank中的已知基因进行对比分析．检测阳性克隆抗原基因 hcct-19在部分正常组织、肿瘤组织及肿瘤细胞株中的表达,半定量RT-PCR方法检测阳性克隆抗原基因在肝癌及癌旁组织中的表达．结果:共得到31个阳性克隆,代表14个不同的 cDNA序列,其中10个为已知功能的基因,4 个为未知功能的基因．在已知功能的基因中, RFC2、NDUFA4及MCART1首次被发现与 HCC有关．hcct-19在部分正常组织、肿瘤组织及肿瘤细胞株中表达,在肝癌组织中的表达强度明显高于癌旁组织(13．2±2．7vs2．9±0．3, P<0．05)．结论:本实验筛选出的HCC抗原有助于进一步阐明HCC的形成过程．hcct-19可能作为一个过量表达的基因参与了HCC的发病过程．     

应用SEREX技术筛选和鉴定非小细胞肺癌肿瘤相关抗原

背景与目的目前用于非小细胞肺癌诊断的标志物为数不多,为寻找更多的早期诊断和靶向治疗相关的标志物,本研究应用SEREX技术筛选与鉴定非小细胞肺癌肿瘤相关抗原。方法使用非小细胞肺癌患者血清对人肺鳞癌和腺癌噬菌体展示文库进行生物淘选和SEREX筛选。PCR扩增阳性克隆插入片段后测序,结果与GeneBank数据库中已知基因进行同源性比较,分析其生物学特性。结果用非小细胞肺癌血清对噬菌体展示文库进行筛选,共获得31个阳性克隆,测序后发现其代表15个基因,其中12个与已知cDNA序列同源,与肺癌或其它肿瘤的发生、发展关系密切;另外3个未发现有同源基因,可能是新基因。结论应用SEREX技术发现15个肺癌相关抗原和3个肺癌相关抗原的候选基因,为进一步的深入研究打下良好的基础。     

大肠癌转移淋巴结构建人源性抗大肠癌噬菌体Fab抗体库

目的 构建人源性抗大肠癌噬菌体Fab抗体库.方法 术中剥取老年大肠癌患者系膜内转移淋巴结,提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA,进行PCR,克隆于pComb3 载体,再经电转化大肠杆菌XLI-Blue菌株,形成噬菌体抗体库,最后通过免疫印记法鉴定初级抗体库中噬菌体上有Fab段的表达.结果 从系膜内转移淋巴结中扩增出650 bp重链Fd和轻链基因产物,轻链基因产物插入测得转化菌数为4.7×10~6,鉴定插入率为70%;重链Fd基因产物测得转化菌数为3.5×10~6,插入率为60%;免疫印迹法鉴定成功建立噬菌体Fab抗体库,库容量达1.4×10~6.结论 筛选大肠癌特异性抗原和相应噬菌体抗体,对大肠癌发病机制的研究以及探讨早期诊断方法有重要意义.     

粪便基因检测筛选大肠癌的研究进展

粪便中的肿瘤脱落细胞包含着与大肠癌关系密切的突变基因，粪便中基因检测可望成为筛选诊断大肠癌的新方法。现对目前粪便中基因检测的各种方法做一献回顾。     

粪便基因检测筛选大肠癌的研究进展

粪便中的肿瘤脱落细胞包含着与大肠癌关系密切的突变基因,粪便中基因检测可望成为筛选诊断大肠癌的新方法。现对目前粪便中基因检测的各种方法做一文献回顾。     

人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库的构建及鉴定

目的　构建人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库。方法　从人大肠癌组织中提取总RNA ,RT PCR反转录合成cDNA第 1链 ,用长距离PCR技术合成cDNA第 2链 ,除去小于 5 0 0bp的小片段后与λTriplEx2噬菌体连接 ,体外包装 ,构建成cDNA噬菌体表达文库。转染E .coliXL1 Blue大肠杆菌 ,滴定文库的滴度 ,确定文库容量大小 ,测定重组率。用EXTagTM酶做PCR和SfiⅠ酶切鉴定插入的cDNA片段大小。结果　构建成含 2 .39× 10 6pfu/ml重组子的人大肠癌cDNA噬菌体表达文库 ,重组率为 97.5 %。插入的外源cDNA片段大小为 5 0 0bp～ 4kb ,平均长约 1.4kb。 结论　成功构建高质量人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库 ,适合于免疫筛选cDNA克隆的人大肠癌相关抗原基因。     

应用基因芯片技术筛选胰腺癌相关基因

目的应用基因芯片技术筛选胰腺癌相关基因。方法将14000种人类基因PCR产物按微矩阵排列点样于化学涂层的载玻片上，制成基因芯片。按一步法抽提4例胰腺癌和癌旁正常胰腺组织的总RNA，将等量的RNA分别逆转录合成荧光分子掺人的cDNA一链作探针，混合后杂交上述基因芯片。经严格洗片后用ScanArray 4000扫描仪扫描芯片荧光信号图像，每点上两种荧光信号的强度分别代表Cy5-dCTP和Cy3-dCTP的量，获得的荧光信号图像用计算机分析。结果按差异显著性标准，从14000个基因中筛选出在胰腺癌组织中共同差异表达基因189条，其中已知基因101条，新基因88条。在筛选出的已知基因中，有50条表达上调，51条表达下调。结论基因芯片技术的肿瘤基因表达谱分析能够高通量筛选胰腺癌相关基因。并高效对基因功能进行研究。胰腺癌基因表达谱的分析有助于认识肿瘤发病机制。     

基因芯片在肝细胞癌相关基因筛选中的初步研究

目的探讨基因表达谱芯片技术在筛查肝细胞癌相关基因群表达中的作用。方法采用美国Affymetrix公司的U133A2．0基因表达谱芯片，按一步法抽提肝细胞癌及正常肝脏组织总RNA，分离纯化两种组织的mRNA；经逆转录合成掺人生物素标记的cDNA合成探针，与芯片杂交和严格洗片后，用荧光扫描仪扫描芯片荧光信号图像，分析肝细胞癌及正常肝组织中差异表达的基因。结果在18400条基因中，肝细胞癌组织与正常肝脏组织间有2756条（14．98％）存在差异表达的基因，其中上调基因1772条和下调基因984条，对2756条差异表达基因作了初步功能分类，这些基因与肝细胞癌的发病机制存在相关性。结论基因表达谱芯片技术可以筛选出肝细胞癌表达异常的相关基因群，对其进一步研究有助于认识肝细胞癌的发病机制。     

肝细胞癌相关肿瘤抗原基因的筛选与分析

目的 筛选和分析肝细胞癌相关的肿瘤抗原。方法 用肝细胞癌组织构建cDNA表达文库，通过重组cDNA表达文库血清学分析法，用自体患者和异体患者的血清对文库进行筛选。将所得阳性噬菌体克隆体内剪切获得其pBK-CMV噬菌粒。通过限制性核酸内切酶鉴定插入cDNA片段，并作测序和生物信息学分析。同时将阳性克隆中的LIMS1插入片段进行原核表达。结果 自体血清筛选得到14种基因，异体筛选获得11种基因，两组中均筛选到kinectin，共有24种肝细胞癌相关的肿瘤抗原基因。其中有8种基因目前还不清楚其功能，其余16种基因根据确定的或者推断的功能可以分成8组。LIMS1原核重组蛋白表达成功。结论 本研究为肝细胞癌的免疫治疗提供了候选基因，并为理解肝细胞癌发生和发展的机制提供了线索。     

应用抑制消减杂交技术筛选大肠癌新相关基因

目的利用抑制消减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization，SSH）构建人大肠癌差异表达cDNA文序，分离并克隆出大肠癌发病的相关新基因。方法运用抑制消减杂交技术分离大肠癌组织及癌旁正常黏膜差异表达基因的cDNA片断，将其与T载体连接构建文库，从库中随机挑取200个白色菌落．使用PCR方法鉴定阳性克隆并对其中50个克隆进行测序，将测序结果登录GenBank进行卜司源性对比分析，并对部分有意义的差异表达片断进行Virtual Northern Blot分析。结果成功构建人源性大肠癌消减cDNA文库，通过筛选获得20个差异表达的基因，其中有2个片断未检测到同源性序列，根据杂交结果考虑可能是存大肠肿瘤中差异表达的新基因。结论运用SSH技术成功构建了人大肠癌的差异表达的cDNA消减杂交文库，并筛选出2个存大肠肿瘤中差异表达的新基因。     

肝细胞癌组织中肿瘤相关基因的初步筛选

为寻找肝癌早期诊断标志物,本研究用基因芯片技术检测了肝细胞癌(HCC)和正常肝组织中基因群的表达情况,初步筛选出相关的基因群,并对其中的肿瘤相关基因进行验证,以进一步了解这些基因对肝癌诊断的价值.