抗人膀胱癌/抗VEGF双功能基因抗体导入治疗荷瘤鼠膀胱癌的研究

目的：探讨抗人膀胱癌，抗VEGF双功能基因抗体对膀胱癌生长的抑制作用。方法：应用双功能抗体作用荷瘤鼠模型，观察抑瘤作用；应用免疫组化技术检测体内生长肿瘤中微血管密度。结果：双功能抗体对体内生长的肿瘤有明显的抑制作用，经双功能抗体治疗的瘤体中微血管密度明显低于对照组。结论：双功能抗体可以抑制肿瘤血管生成，有望为膀胱癌的治疗提供新的方法。     

抗人喉癌/抗VEGF双功能抗体制备及应用研究

目的：研制抗人喉癌／抗血管内皮因子（VEGF）双功能克隆抗体，用于喉癌抗血管生成治疗。方法：采用二次杂交瘤技术制备抗人喉癌／抗VEGF双功能抗体。经酶联免疫吸附试验法和SP法检测喉癌及癌前病患者血清及癌组织中VEGF的含量表达。结果：获得6株分泌抗人喉癌／抗VEGF双功能抗体的杂交瘤，经免疫组化证实与喉癌细胞特异性结合率为93％，而与血管内皮细胞结合率为89％。血清中VEGF含量表达，喉癌组与癌前病组及正常对照组相比差异均显著。IgG亚型鉴定为IgG2aBSAb抗体效价为1：25 600倍（ELISA法）。结论：二次杂交瘤法制备的双功能抗体具有均匀性、可控性、效价高、稳定性好，可用于喉癌抗血管生成治疗，动态检测可作为判断喉癌预后的客观指标。     

人胃癌双功能抗体制备的研究

以不同技术路线制备Ｐ２１０／ＭＭＣ，Ｐ２１０／ＴＮＰ及Ｐ４０／ＣＤ３三种双功能抗体（ＢｓＡｂ）。在１１次细胞融合中，接种７４８４孔，获１５株二次杂交瘤，其中５株分泌ＢｓＡｂ。将亲本杂交瘤分别诱变为ＨＧＰＲＴ＾－及ＴＫ＾－，融合后以ＨＡＴ选择培养并辅以饲养细胞较易获得二次杂交瘤。证明两种抗原交互反应的桥联试验，特别是当二次杂交瘤分泌不同类别的Ｉｇ时，对于确证ＢｓＡｂ的存在有着重要意义。本文首次报告，     

抗人喉癌/抗CD3双功能抗体的制备及对Hep-2细胞株的杀伤作用

目的：研究制备抗人喉癌／抗CD3双功能抗体，探讨喉癌主动免疫治疗。方法：以化学方法将人喉癌及抗CD3单克隆抗体交联为双功能抗体，进行介导对肿瘤细胞的杀伤作用。结果：该双功能抗体介导效应细胞对靶细胞的杀伤率高于抗CD3的介导作用，并随着效靶比的提高而升高。结论：采用化学交联法制备的抗人喉癌／CD3双功能抗体具有潜在的临床应用价值。     

从噬菌体抗体库克隆抗人RBC单链抗体基因

目的用噬菌体抗体库技术克隆抗人红细胞（ＲＢＣ）的单链抗体（ＳｃＦｖ）基因。方法以人ＲＢＣ免疫小鼠，取脾细胞，ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＶＨ和Ｖκ基因，组装到ＳｃＦｖ－噬菌体抗体表达载体中，构建了噬菌体抗体库，以人ＲＢＣ为固相抗原，对该库进行了四轮“吸附－洗脱－扩增”筛选，获得了抗人ＲＢＣ的ＳｃＦｖ基因。结果ＤＮＡ序列分析表明其可变区基因分别属于小鼠ＶＨⅢ亚群和ＶκⅤ亚群。结论所表达的ＳｃＦｖ可与不同人ＲＢＣ结合，与ＡＢＯ血型抗原无关，可用于构建快速血凝诊断的工程抗体     

抗皂角毒、表皮生长因子受体双功能抗体的制备与体外效应的研究

目的：研究制备抗皂角毒和表皮生长因子受体双功能抗体,用以导向皂角毒杀伤肿瘤细胞。方法：在制备ＥＱ７５、ＣＹ１２．１４单克隆抗体细胞株的基础上,通过杂交杂交瘤技术制备双功能抗体细胞株。结果：双功能抗体（ＥＱ７５×ＣＹ１２．１４）与单用皂角毒杀伤肿瘤细胞（Ａ４３１）的ＩＣ５０分别为１０－９．６、１０－８．４ｍｏｌ／Ｌ。结论：双功能抗体（ＥＱ７５×ＣＹ１２．１４）杀伤肿瘤细胞（Ａ４３１）,以ＩＣ５０值计算,有效率为单用皂角毒的１５倍左右。     

免疫亲和层析法纯化抗Pgp/抗CD3双功能抗体

目的：制备可以纯化抗Pgp/抗CD3双功能抗体的免疫亲和层析柱。方法：纯化的抗抗CD3ScFv单克隆抗体与预活化的Sepharose4B偶联制成免疫亲和层析柱,采用自制的免疫亲和层析柱纯化由摇瓶发酵获得的抗Pgp/抗CD3双功能抗体,采用间接免疫荧光法测定抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体能与Jurkat细胞及K562/A02细胞特异性结合活性。结果：成功地制备了可以纯化抗Pgp/抗CD3双功能抗体的免疫亲和层析柱,采用此柱纯化的抗体与Jurkat细胞及K562/A02细胞特异性结合的活性与带有E-tag纯化标志的抗体基本一致。结论：此介质可以替代价格高昂的E-tag亲和层析介质在纯化Pgp/抗CD3双特异双功能抗体中的应用,同时还可以避免由于E-tag纯化标志而带来的免疫原性问题,此项研究工作为抗Pgp/抗CD3双功能抗体将来在临床应用奠定了基础。     

抗CD3—抗胶质瘤双特异性抗体的制备及其细胞毒活性作…

采用化学联法制备抗ＣＤ３－抗胶质瘤双特异性的抗体，其分子结构为杂合的Ｆ（ａｂ‘）２片段、结合率试验证明，此双抗能同时识别并结合ＬＡＫ细胞和胶质瘤细胞，在细胞毒性试验中，虽然双抗，ＣＤ３单抗和ＳＺ－３９单抗混和物均能提高ＬＡＫ细胞对胶质瘤细胞的杀伤作用，但双抗的作用特别显著，增强效应为１４８％，而在以非胶质瘤细胞为靶细胞时，双抗虽有增强作用，但低于ＣＤ３单抗的作用。     

双特异性抗体对LAK细胞增殖和细胞毒作用影响的体外研究

将抗ＣＤ３与抗ＨＢｓ的单克隆抗体经化学偶联得到双特异性抗体，观察该双特异性抗体对ＬＡＫ细胞增殖和增强细胞毒性的作用。结果显示双特异性抗体显著提高ＬＡＫ细胞与２．２．１５细胞结合率；促进淋巴细胞增殖。１２５Ｉ－ＵｄＲ释放试验检测发现双特异性抗体增强ＬＡＫ细胞对２．２．１５细胞的细胞毒性且与抗体浓度呈正相关。进一步对抗体的特异性研究表明，加入双特异性抗体后ＬＡＫ细胞对２．２．１５细胞毒性作用显著高于对照组。     

Development and clinical application of bispecific antibody in the treatment of colorectal cancer

ABSTRACT

Introduction

Treatment of colorectal cancer as one of the most commonly diagnosed and a frequent cause of cancer-related deaths is of great challenges in health-related issues.     

用CDR3导向抗体库法对鼠抗人膀胱癌单抗进行人源化

目的　构建含鼠单抗CDR3的人源噬菌体抗体库 ,对膀胱癌鼠单抗进行人源化。方法通过重叠PCR及DNA重组技术 ,将抗膀胱癌鼠单抗BDI的CDR3区与人淋巴细胞来源的多样化的VH和Vκ组合 ,构建含BDICDR3的人源噬菌体抗体库 ;利用loxp cre定位重组系统 ,增加轻、重链的组合配对 ,获大容量抗体库 ;用膀胱癌细胞 (EJ)从中筛选人源化抗膀胱癌单抗Fab段 ,ELISA方法对所筛克隆进行特异性鉴定 ,同时运用竞争抑制实验对所筛特异性克隆进行抗原表位的核实。结果　首先构建了库容为 2× 10 7的含鼠CDR3区的人源噬菌体抗体库 ;经过在cre 细菌胞内的定位重组后 ,获得库容为 10 1 0 的大容量噬菌体抗体库 ;用EJ细胞筛选到可与其特异结合的人源性Fab段 ;竞争抑制实验表明所获人源抗体片段与亲本鼠源单抗结合同一抗原表位。结论　在没有亲本鼠单抗基因 ,仅了解其CDR3序列的条件下 ,可通过CDR3导向 ,构建大容量抗体库 ,筛选到相应的人源化抗体基因。     

利用纳米颗粒偶联双特异性抗体提高其功能及稳定性的研究

目的用PLGA纳米颗粒提高CD16-MUC1双特异性抗体的抗肿瘤功能及稳定性。方法利用原核生物表达的方法制备CD16-MUC1双特异性抗体,并利用可降解材料PLGA纳米颗粒偶联,然后利用NK细胞对癌细胞的杀伤实验来检测其功能。结果成功表达具有生物学活性的CD16-MUC1双特异性抗体,并经PLGA纳米颗粒偶联得到稳定性和功能均更优的双特异性抗体。结论经纳米颗粒偶联后的CD16-MUC1可提高其抗肿瘤功能及稳定性。     

抗人卵巢癌×抗人CD3双特异单链抗体介导的效应细胞在体外对卵巢癌细胞的杀伤作用

目的　研究双特异单链抗体 (scBsAb)介导的Jurkat细胞 (CD3+ )及人外周血单个核细胞(PBMC)在体外对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞的杀伤活性 ,从而探讨其用于卵巢癌治疗的可能性。方法以抗人卵巢癌×抗人CD3scBsAb激活效应细胞 ,以SKOV3为靶细胞 ,用MTT法测定不同实验条件下的杀伤活性。结果　 (1)以重组白细胞介素 2 (rIL 2 )、抗CD3单克隆抗体、抗CD2 8重链单域抗体 (VH)预刺激Jurkat及PBMC细胞比单纯用scBsAb激活效应细胞杀伤活性高 ;(2 )以Jurkat细胞或PBMC细胞作为杀伤细胞可得到相似的杀伤活性 ,最高杀伤率均在 75 %左右 ;(3)杀伤活性与scBsAb的浓度、作用时间及效靶比有关。对于Jurkat细胞 ,在抗体终浓度为 2 1μg ml,反应时间为 4 8h ,效靶比为 10∶1时达到最大杀伤率 74 .8% ;对于PBMC细胞 ,在抗体浓度为 2 0 μg ml,反应时间为 72h ,效靶比为 1∶1时达到最大杀伤率73.1%。 (4 )多因子联合应用能有效提高杀伤活性。结论　scBsAb在体外能够有效介导效应细胞杀伤肿瘤细胞 ,有明显的抗癌作用 ,具有潜在的应用前景。     

Generation and characterization of a novel tetravalent bispecific antibody that binds to hepatitis B virus surface antigens

Hepatitis B virus (HBV) infection is a worldwide public health problem affecting about 350 million people. HBV envelope contains three surface antigens, called pre-S1, pre-S2 and S. For the prophylaxis of HBV infection, only an anti-S monoclonal antibody was tested for the protective efficacy against HBV infection, but it was shown to be incomplete. In addition, some immune escape mutants carrying mutations on the S antigen were reported. Therefore, a multivalent bispecific antibody rather than a single monoclonal antibody would be more beneficial for the prophylaxis of HBV infection. We have generated a novel tetravalent bispecific antibody with two binding sites for each of the S and pre-S2 antigens. Each of the antigen-binding sites was composed of a single-chain Fv (ScFv). The tetravalent antibody was generated by constructing a single gene encoding a single-chain protein. This protein consisted of an anti-S ScFv whose carboxyl end was tethered, through a 45 amino acid linker, to the amino terminus of anti-preS2 ScFv that in turn was joined to the hinge region of human γ1 constant region. The single-chain protein was expressed in Chinese hamster ovary cells and secreted in culture supernatant as a homodimeric molecule. The tetravalent bispecific antibody showed both anti-S and anti-pre-S2 binding activities. In addition, the binding affinity of the bispecific antiboy for HBV particles was greater than that of either parental antibody. The tetravalent bispecific antibody is a potentially useful reagent for the prevention and treatment of HBV infection.