小鼠bcl10基因敲除载体的构建

根据已知的cDNA序列设计引物，通过RT-PCR获得小鼠bcl10基因cDNA片段作为探针，用噬斑原位杂交法克隆129品系小鼠的bcl10基因组DNA，在亚克隆完成序列结构分析的基础上，利用常规分子克隆技术，构建完成了针对bcl10基因的替代型基因敲除载体。两条同源臂分别为bcl10基因exon3上游2.4kb和exon4下游4.5kb的基因片段。构建完成替代型小鼠bcl10基因敲除载体，为后续获得bcl10基因缺陷型胚胎干细胞系奠定了实验基础。     

人HOXA1 3'-非翻译区荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的:针对人同源异型盒A1(HOXA1)基因的3'端非翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)构建HOXA1的荧光素酶报告基因载体,对其克隆进行鉴定并挑选出正确的克隆,为后续功能研究提供基础。方法:PCR扩增包含HOXA1 3'-UTR的DNA片段,克隆至荧光素酶载体psiCHECK-2,构建HOXA1 3'-UTR荧光素酶报告基因载体,经Not I和Xho I双酶切后测序进行鉴定。结果:克隆获得的DNA片段大小及序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确。结论:成功构建了含hURAT1基因3'UTR区的荧光素酶报告载体,可用于后续功能研究。     

真核表达载体pEGFP-C3-MASH-1的构建

目的构建含小鼠MASH1基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MASH1，为进一步研究MASH1在间充质干细胞神经分化中的作用打下基础。方法应用RT-PCR方法从小鼠13．5d胚胎组织中扩增出两端带有HindⅢ和EcoRI酶切位点的MASH1cDNA编码片段，经回收、纯化、酶切后，依次连接到质粒pGEM-T和pEGFP-C3上。结果酶切及测序结果表明：重组质粒PEGFP-C3含有MASH-Ⅰ片段，方向及大小正确。结论成功构建了小鼠真核表达载体PEGFP-C3-MASH-Ⅰ。     

载脂蛋白M基因启动子的克隆及荧光素酶报告基因载体的构建

目的为深入研究载脂蛋白M(ApoM)基因的表达调控机制,对ApoM基因启动子序列进行克隆,并构建不同长度启动子荧光素酶报告基因载体。方法在NCBI人类基因组数据库中截取并下载ApoM基因转录起始位点5’侧翼区约2kb的基因组序列设计PCR扩增引物,从健康外周血中扩增获得该片段,以此序列为基础进行亚克隆,分别获得6条5’端不等、3’端平齐的片段,最后插入pGL3-Basic表达载体。结果获得了6条长度差别约为200bpApoM启动子片段,并构建了不同长度的pGL3-ApoM真核表达载体。结论上述载体的成功构建及序列分析为进一步研究ApoM基因的启动子活性及基因表达调控奠定了基础。     

小鼠CD1d2编码区基因的克隆与鉴定

目的:克隆小鼠CD1d2编码区基因。方法:提取小鼠胸腺组织总RNA,用RT-PCR技术扩增CD1d2cDNA,PCR产物连接pGEM-T载体,转化大肠杆菌,用限制性酶切反应和DNA测序对阳性克隆进行鉴定,用BLAST软件进行序列分析。结果:扩增出一条特异DNA条带,DNA序列测定表明获取了大小为1008bp的小鼠CD1d2基因编码区基因。结论:成功克隆了小鼠CD1d2编码区基因。     

利用CRISPR/Cas9n系统构建Asxl2基因敲除的NIH3T3稳定细胞系

摘要： 目的 利用 CRISPR/Cas9n 系统在 NIH3T3 小鼠胚胎成纤维细胞系中敲除 Asxl2 基因。方法 设计一对靶 向小鼠 Asxl2 基因第 5 个外显子的小向导 RNA （sgRNA）, 分别克隆进 pX462 载体。将测序鉴定正确的重组质粒转染 至 NIH3T3 细胞中, 利用有限稀释法得到单细胞, 通过培养获得单克隆细胞系。提取单克隆细胞系基因组 DNA, ge⁃ notyping PCR 扩增出靶位点附近的 DNA 片段并测序。利用 Western blot 方法检测细胞株中 Asxl2 的敲除效果。结 果 成功构建靶向 Asxl2 的 CRISPR/Cas9n 重组质粒。将 2 个重组质粒共转染 NIH3T3 细胞, 嘌呤霉素筛选后得到亚 克隆细胞系, 并且经 genotyping PCR 测序验证得到一株正确的单克隆细胞系。Western blot 证实敲除 Asxl2 后, 该 NIH3T3 细胞系中 Asxl2 蛋白表达缺失。结论 通过这个系统得到了靶向 Asxl2 的 CRISPR/Cas9n 重组质粒及稳定 敲除 Asxl2 的NIH3T3 细胞系。     

pcDNA3.1(+)/GDF-5真核表达质粒的构建及其在小鼠骨髓基质干细胞的表达

目的:通过基因重组技术体外构建真核表达质粒pcDNA3．1( )／GDF-5,并检测其在小鼠骨髓基质干细胞中的表达。方法:提取孕14 d小鼠胚胎肢芽组织总RNA,RT-PCR扩增,将扩增产物GDF-5基因片断插入至pcDNA 3．1( )载体,并进行酶切鉴定及测序;脂质体介导pcDNA 3．1( )／GDF-5重组质粒瞬时转染小鼠MSC,RT-PCR和免疫细胞化学检测GDF-5的表达。结果:重组质粒双酶切图谱显示有5．4 kbp和1．6 kbp两条带;测序结果与Genbank中的序列完全相同;转染后RT- PCR显示实验组有一219bp特异性条带,免疫细胞化学检测发现实验组细胞胞浆内有棕色阳性染色,实验对照组和空白组均为阴性。结论:本实验成功构建pcDNA3．1( )／GDF-5真核表达质粒,转染小鼠MSC中有GDF-5表达,为进一步研究其在软骨发育机制和软骨骨组织工程领域提供了实验基础。     

新的含有11q13.5HERV-Wgag 序列的内含子转录子的鉴定

目的:鉴定位于染色体11q13.5的含有HERV-W gag序列的内含子转录子,探讨这一新的转录子对宿主基因PTD015选择性剪切的调控作用.方法:采用半巢式PCR和降落PCR扩增目的片段,克隆、测序、构建载体、转染JEG3细胞,采用实时PCR检测PTD015选择性剪切mRNA的水平.结果:鉴定了一个位于基因PTD015第二内含子上长1 739 bp的转录子,该转录子包含755 bp 11q13.5 HERV-W gag序列、527 bp 5′长末端重复序列和11q13.5 HERV-W 5′端457 bp片段.此内含子反义转录子质粒的转染使JEG3细胞PTD015选择性剪切mRNA的水平明显降低. 结论:源于基因PTD015第二内含子含有HERV-W gag序列的反义转录子可调节宿主基因PTD015的选择性剪切.     

基于双荧光素酶报告基因系统的人源SREBP1基因启动子的活性研究

目的 构建固醇调节元件结合蛋白 1（SREBP1）启动子双荧光素酶报告基因表达载体,为研究针对 SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定基础。方法 利用生物信息学软件,对SREBP1基因5′端上游5 000 bp序 列进行启动子预测与分析。应用 Gibson Assembly 方法构建启动子双荧光素酶载体,并将构建成功的 pGL3- SREBP1-pro重组质粒和内参质粒pRL-SV40共转染肝癌HepG2细胞并给予天然抑制剂大黄素,检测SREBP1转录活 性的抑制效果。结果 SREBP1基因5′端上游2 000 bp区域内有启动子特征序列,存在转录因子结合位点;重组质粒 经酶切及测序鉴定证实为阳性克隆,瞬时转染肝癌HepG2细胞后经双荧光素酶报告基因系统检测,所克隆的片段序 列具有启动子活性,该活性可被大黄素所抑制。结论 成功构建了pGL3-SREBP1-pro双荧光素酶报告基因表达载 体,并证实其活性,可为进一步用于针对SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定     

人血管内皮生长因子受体3胞外1-3区基因的克隆与表达载体的构建

目的构建人血管内皮生长因子受体(VEGFR)-3胞外1-3区基因原核表达体系。方法提取人胎盘组织上总RNA,经反转录制备cDNA;从Genebank获取该基因序列,设计引物进行聚合酶链反应(PCR)以扩增VEGFR-3胞外1-3区基因片段,回收和纯化PCR产物并将其插入pMD18T载体中进行克隆;测序正确后,将目的基因克隆入原核表达载体pBV220,对获得的原核表达质粒进行初步鉴定。结果构建了pBV220-VEGFR-3质粒表达载体,经DNA测序鉴定序列正确。结论应用基因工程技术,成功构建了VEGFR-3原核表达载体。