人脂联素基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：克隆人脂联素（adiponectin）基因，并在大肠杆菌宿主系统中高效表达出adiponectin蛋白进行鉴定。方法：从人皮下脂肪组织提取总RNA，确认其正确性后经RT-PCR扩增得到全长cDNA片段，此片段经纯化回收后克隆至pMD 18-T载体，经行DNA序列分析，进一步克隆构建到表达载体至pET-DEST42中，用IPTG在大肠杆菌中诱导表达。结果：含重组adiponeetin质粒的大肠杆菌经0．4mmol／L的IPTG诱导6h后有高表达。结论：adiponeetin基因的克隆构建和在大肠杆菌中的表达获得成功。     

脂联素原核表达载体PQE30/ADPN的构建及其表达与纯化

目的构建大鼠全长脂联素(fAd)和球状域脂联素(gAd)重组表达载体PQE30/ADPN,并在大肠杆菌宿主系统中表达出脂联素蛋白,对表达产物进行纯化和鉴定。方法将纯化的脂联素克隆产物与原核表达载体PQE30通过双酶切方法位点特异地连接在一起,再转化入大肠杆菌M15感受态细胞中,并用IPTG诱导表达,并通过亲和层析、去盐、去除内毒素等纯化蛋白。结果PCR获得长度分别为684bp(fAd)和402bp(gAd)的目的片段,经PQE30原核表达载体连接、筛选及序列分析后,证实所插入目的片段与GenBank中脂联素序列(序列号:NM_144744)完全一致;含重组脂联素质粒的大肠杆菌在30℃经0.5mmol.L-1IPTG诱导6h时,可溶性蛋白表达量最高。结论成功克隆大鼠脂联素基因,并在大肠杆菌中获得有效表达。     

人脂联素原核表达载体PQE30/ADPN的构建及在大肠杆菌中的表达

目的:构建人脂联素重组表达载体PQE30/ADPN,并在大肠杆菌宿主系统中表达出脂联素蛋白,对表达产物进行鉴定。方法:将构建好的人脂联素克隆载体PUC57/ADPN与原核表达载体PQE30通过双酶切方法位点特异地连接在一起,再转化入大肠杆菌JM109感受态细胞中。通过筛选得到含有人脂联素基因的重组载体PQE30/ADPN,并用IPTG在大肠杆菌M15中诱导表达。结果:PCR获得长度为753bp目的片段,经PQE30原核表达载体连接、筛选及序列分析后,证实所插入的目的片段与GenBank检索的人脂联素cDNA序列(Accession NM-004797)100%匹配;含重组Adiponectin质粒的大肠杆菌经0.4mmol/L的IPTG诱导6h后有表达。结论:应用并成功构建了人脂联素原核表达载体PQE30/ADPN,且在大肠杆菌中获得有效表达。     

人脂联素基因在L-02细胞中表达及其功能检测

目的:在人正常肝细胞株L-02中表达外源人脂联素蛋白,并观察其生物学活性。方法:采用脂质体法将成功构建的人脂联素真核表达质粒pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO-Adiponectin转染L-02细胞;免疫组织化学定位观察脂联素的表达;Western blot检测培养上清及细胞沉淀中脂联素水平;酶联免疫法测定培养基血糖。结果:构建的真核表达质粒能有效转染L-02细胞,并在培养上清及细胞沉淀中检测到脂联素蛋白,该重组蛋白能够降低高糖处理的L-02细胞的血糖水平。结论:重组人脂联素蛋白能在L-02中有效表达,该蛋白定位在细胞质,并且能分泌到胞外,表达产物经体外实验证实具有生物学活性。     

人脂联素cDNA的克隆及序列分析

目的：构建人脂联素cDNA的克隆并进行序列分析。方法：提取人脂肪组织总RNA，运用RT-PCR方法扩增人脂联素cDNA完全编码区，将扩增产物通过TA克隆技术克隆至pMD18-T载体，对重组质粒进行测序验证。结果：成功构建人脂联素cDNA的克隆，重组质粒(pMD18-T／ADPN)经测序与Genebank检索的脂联素cDNA序列进行对比证实为100％同源。结论：所构建的人脂联素cDNA克隆适于进一步的克隆表达。     

缬沙坦对肝纤维化大鼠脂联素及脂联素受体2表达的影响

目的探讨血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂缬沙坦对肝纤维化大鼠脂联素(ADN)及ADN受体2(AND-R2)表达的影响。方法选36只雄性Wistar大鼠分为对照组、模型组、药物组,用四氯化碳(CCl4)背部皮下注射法制备大鼠肝纤维化模型,药物组于造模开始每只大鼠缬沙坦灌胃(30 mg·kg-1·d-1),8周末处死。肝组织苏木素-伊红(HE)染色和Masson染色,进行肝纤维化分期。酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血清ADN、肿瘤坏死因子(TNF)-α、转化生长因子-β1(TGF-β1)的浓度,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测肝组织中ADNm RNA(ADN-R2)m RNA水平,蛋白印迹法检测肝脏ADN、ADN-R2、Ⅰ型胶原表达水平。结果 (1)模型组大鼠造模成功,药物组肝组织纤维化程度较模型组明显减轻;(2)模型组较对照组血清脂联素水平降低,TNF-α、TGF-β1水平增高(P<0.01),药物组较模型组ADN增高(P<0.01)、TNF-α和TGF-β1水平下降(P<0.01或<0.05);(3)肝脏ADN和ADN-R2m RNA水平模型组较对照组明显下降(P<0.01),药物组较模型组增高(P<0.05);(4)模型组较对照组ADN、ADN-R2蛋白表达减少,Ⅰ型胶原蛋白增高(P<0.01),药物组较模型组ADN蛋白表达增高(P<0.01),ADNR2蛋白表达增高(P<0.05),Ⅰ型胶原蛋白下降(P<0.05)。结论血管紧张素受体拮抗剂缬沙坦可能通过增高大鼠ADN、ADN-R2的表达,减少TNF-α、TGF-β1水平,减轻肝脏炎症,发挥抗肝纤维化作用。     

2型糖尿病大鼠脂联素受体基因表达的相关性研究

目的研究2型糖尿病大鼠骨骼肌和肝脏脂联素受体的表达变化。方法将20只健康雄性SD大鼠随机分为糖尿病组(DM组)和对照组(NC组),每组10只,分别饲以高脂饲料和普通饲料。第13周末DM组大鼠一次性腹腔注射2%链脲佐菌素(STZ)溶液(STZ 25mg/kg,以0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制,pH=4.4),NC组腹腔注射等体积的无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。第14周末进行葡萄糖耐量试验(OGTT)筛选成模大鼠,第25周末处死所有大鼠,取血检测空腹血糖、甘油三酯、胆固醇、脂联素、胰岛素水平,并计算胰岛素敏感指数(ISI),使用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法分别检测2组大鼠骨骼肌和肝脏组织中脂联素受体(AR)mRNA表达水平。结果 DM组大鼠空腹血糖、甘油三酯、胆固醇、胰岛素水平高于NC组,脂联素水平和ISI低于NC组(P<0.05);DM组大鼠骨骼肌中AR1mRNA和肝脏组织中AR2mRNA的表达水平低于NC组(0.64±0.25与1.36±0.30,0.93±0.18与1.52±0.21;P<0.05),AR1和AR2表达水平分别与空腹血糖、甘油三酯、胆固醇、胰岛素、脂联素、ISI相关。结论 2型糖尿病大鼠AR mRNA的表达水平显著降低,与胰岛素敏感性密切相关。     

咖啡豆提取物对肥胖大鼠血清瘦素、脂联素水平及脂联素受体表达水平的影响

目的 研究咖啡豆提取物对高脂饮食肥胖大鼠的瘦素(Leptin,LP)、脂联素(APN)及脂联素受体表达的影响。方法 给予高脂饲料建立SD大鼠肥胖模型,灌胃给予咖啡豆提取物(800,267,133 mg·kg^-1),连续6周。测量大鼠体质量及脂体比,测定大鼠血浆总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、血清LP、APN;检测肝组织脂联素受体表达。结果 与正常对照组相比,给予高脂饲料6周的大鼠体质量明显增加(P<0.01),提示SD大鼠肥胖模型建立。与模型组比较,咖啡豆提取物给药后大鼠体质量、脂体比和LP水平下降(P<0.01或P<0.05),血清APN水平、APN受体的mRNA和蛋白表达显著增加(P<0.01或P<0.05)。结论 咖啡豆提取物对高脂饮食肥胖大鼠的体质量具有改善作用,作用机制可能是升高血清APN水平,降低LP水平及上调肝脏脂联素受体的mRNA和蛋白表达。     

脂联素单链抗体基因的克隆及表达

目的 克隆人脂联素单链抗体基因并进行表达。方法提取分泌抗脂联素单克隆抗体杂交瘤细胞株的总RNA,通过RT-PCR技术,扩增VH和VL,与质粒pUC19载体连接,形成克隆,并对其进行鉴定分析。结果抗体重、轻链可变区扩增拼接后的重、轻链各约为340bp、350bp,基因全长约710bp,将拼接产物插入pUC19质粒中转化大肠杆菌JM109,得到数个克隆,经酶切分析约含710bp片段,与拼接结果基本相同,经测定特异性较好,与其他杂蛋白及载脂蛋白没有交叉反应。结论抗人脂联素单链抗体基因的克隆和表达较为成功。     

糖尿病患者血清脂联素与白介素-6水平检测及临床意义

目的:探讨糖尿病患者血清脂联素(APN)与血清白介素-6(IL-6)水平检测及临床意义。方法:选择2014年1月—2015年12月收治的100例糖尿病患者作为观察组,选取健康体检人员100例作为对照组,采用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)检测两组血清IL-6和血清APN水平,观察并记录观察组治疗前后以及对照组的APN、IL-6、空腹血糖(FPG)、餐后2小时血糖(2hPG)水平,观察两组胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、同型半胱氨酸(Hcy)、血脂各指标的检查结果,并探讨APN与IL-6的相关性。结果:糖尿病患者治疗后IL-6、FPG、2hPG水平均明显降低,而APN水平明显升高,治疗前后比较,差异有统计学意义(P<0.05);观察组血清总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、HOMA-IR、Hey水平较对照组明显升高,组间比较,差异有统计学意义(P<0.05);两组高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。IL-6水平与FPG、2hPG呈正相关(r=0.209,P<0.05;r=0.277,P<0.05)。APN水平与FPG、2hPG水平呈负相关(r=-3.127,P<0.05;r=-2.967,P<0.05)。血清IL-6与APN水平呈负相关。APN指标与血清Hey、HOMA-IR呈负相关,P<0.05;而Hcy与HOMAIR呈正相关。结论:血清IL-6水平与血清APN水平呈负相关,APN可抑制IL-6对血管内皮细胞的损伤。     

栎精对葡萄糖-6-磷酸酶基因表达及活性的影响

目的：探讨栎精对葡萄糖-6-磷酸酶基因表达及活性的影响。方法：将原代培养的大鼠肝细胞在含有25mmol／L的葡萄糖和不同浓度的栎精培养16h后提取RNA，以半定量RT—PCR方法检测葡萄糖-6-磷酸酶的催化亚基（G6PC）和转运亚基（G6PT）的mRNA水平，并应用葡萄糖双脱氢酶偶联法测定葡萄糖-6-磷酸酶的活性。结果：25mmol／L葡萄糖能够使G6PC和G6PT的mRNA水平升高2倍左右（P〈0．05），不同浓度的栎精可抑制G6PC和G6PT的转录及酶的活性。结论：栎精能够抑制体外葡萄糖-6-磷酸酶基因的表达及其活性。     

葡萄糖和木糖醇对葡萄糖6磷酸酶基因表达的调节作用

目的:探讨葡萄糖以及木糖醇对葡萄糖6磷酸酶基因的表达调控机制。方法:将原代培养的大鼠肝细胞在不同浓度葡萄糖和木糖醇的培养液中培养4h后提取RNA,以半定量RT-PCR方法检测细胞葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基(G6PC)和6磷酸葡萄糖转运亚基(G6PT)的mRNA水平。结果:高浓度的葡萄糖可使肝细胞G6PC和G6PT的mRNA水平升高。25mmol/L的葡萄糖能够使G6PC和G6PT的mRNA升高2倍以上(P<0.05)。小剂量的木糖醇能够促进G6PC和G6PT的转录,当木糖醇浓度>5mmol/L时这种促进作用逐渐消失甚至表现为抑制作用。结论:葡萄糖能够明显的促进葡萄糖6磷酸酶基因的转录,该酶在糖尿病的发生发展中起着重要的作用。     

汉坦病毒S基因在大肠埃希菌中的克隆及表达

目的：在大肠埃希菌中克隆和表达汉坦病毒SEO型及HTN型S基因。方法：PCR扩增汉坦病毒SEO型L99株及HTN型Z10株S基因读码区，前者经EcoRI及XhoI双酶切，后者经SacI及XhoI双酶切，将两者定向克隆入pET32a（＋），转入感受态E．coli Top10。获取重组质粒，经PCR、双酶切及序列分析鉴定后，转入E．coli BL21感受态。经IFTG诱导表达，其产物经SDS-PAGE和Western-blot检测。结果：SEO型L99株及HTN型Z10株S基因正确克隆于pET32a（＋），目的蛋白的分子质量约为67．1ku，表达量占菌体总蛋白的40％以上，Western-blot有特异性条带。结论：SEO型及HTN型汉坦病毒S基因在大肠埃希菌中获得表达，为其后的应用奠定了基础。     

大肠杆菌偏嗜性人胰岛素样生长因子1基因的克隆及表达

目的：提高以大肠杆菌为工程菌制备重组人胰岛素样生长因子1（rhIGF-1）的产率。方法：依据大肠杆菌遗传密码子使用频率表，人工合成3条DNA单链，PCR拼接扩增出适于在大肠杆菌中表达的人IGF-1基因。将此基因克隆入pGEM-T载体进行DNA序列分析后亚克隆入表达载体pBV220，诱导表达，表达产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定，酶联免疫分析（ELISA）检测表达产物中rhIGF-1的含量。结果：经基因改造后．rhIGF-1主要以包涵体的形式存在于碎菌后的沉淀中，其产率较改造前提高近4倍。结论：所构建的大肠杆菌偏嗜性人IGF-1基因可显著提高rhIGF-1的产率。     

突变型人白细胞介素-2基因在大肠杆菌中的表达

目的：建立突变型人白细胞介素-2（rhIL-2）基因大肠杆菌表达系统，为rhlL-2的生产及临床应用奠定基础。方法：自人胎盘组织中提取总RNA，逆转录PCR（RT-PCR）扩增突变型人IL-2基因cDNA，通过对下游引物的设计将编码125位半胱氨酸（c125）的密码子TGT更改为编码丝氨酸的密码子TCT。构建表达型重组质粒pBV-IL-2，温度诱导表达．表达产物行SDS一聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）及WesternBlot鉴定。结果：DNA序列分析证实，重组质粒pBV-IL-2含有突变型人IL-2编码序列及正确的开放读码框架。SDS-PAGE显示，诱导表达碎菌后的沉淀中有分子质量大小约为16．5ku的外源蛋白产生。经Western印迹（WesternBlot）证明为rhlL-2。结论：成功构建了突变型人白细胞介素-2大肠杆菌表达系统。表达产物主要以包涵体的形式存在于碎菌后的沉淀中。     

重组人甲状旁腺激素相关蛋白1-141的表达和生物活性测定

目的：建立表达及纯化重组人甲状旁腺激素相关蛋白1-141（rhPTHrP1-141）的方法。方法：将已构建好的表达载体pQE-30Xa／hPTHrP1-141重组质粒转化大肠杆菌M15[PREP4]，IPTG诱导表达，Western Blot鉴定表达产物。金属螯合亲和层析去除杂蛋白后，超滤离心进一步纯化目的蛋白。使用UMR106细胞测定所制备的rhPTHrP1-141对cAMP生成的刺激作用。结果：SDS-PAGE可见与预期大小相符的蛋白条带，Western Blot证实该条带即为rhPTHrP1-141。目的蛋白经纯化后，能刺激UMR106细胞内cAMP浓度升高，有剂量依赖关系。结论：成功建立了rhPTHrP1-141的制备及纯化方法，PTHrP1-141的表达量可达到60mg／L培养基。表达产物经体外实验证实具有生物活性。