抗TNF-α人-鼠嵌合抗体的构建及表达

目的：构建和表达抗ＴＮＦ－α人－鼠嵌合抗体。方法：将抗ＴＮＦ－α鼠单抗Ｚ８的轻、重链可变区基因插入到含有人ｋ链和ＩｇＧ１重链恒定区基因的真核细胞表达载体中,分别构建轻、重链分开表达和共同表达的人－鼠嵌合抗体真核表达载体转染真核细胞,通过ＥＬＩＳＡ,ＲＴ－ＰＣＲ、免疫印迹检测ＴＮＦ－α的活性。用Ｌ９２９细胞检测嵌合抗体体外中和ＴＮＦ－α的活性。结果：ＥＬＩＳＡ鉴定结果表明该嵌合抗体与ＴＮＦ－α特异性     

抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体真核表达载体的构建及表达

目的:构建抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体真核表达载体,在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中获得稳定、高效表达,并对其生物学活性进行初步鉴定。方法:利用基因重组技术将本室前期构建的含有轻、重链嵌合基因的载体PMD18-T-VH和PMD18-T-VL双酶切获得重链、轻链基因后,克隆到前期改构的高效真核表达载体pCI-neo-M中,用脂质体法转染野生型CHO-K1细胞,在G418和氨甲喋呤(MTX)双筛选压力下筛选稳定高效表达细胞株,ELISA方法检测重组蛋白的表达,用Protein A HP Spin Trap纯化目的蛋白后进行SDS-PAGE和Western blot法检测,并通过体外中和实验检测其中和活性。结果:成功构建了抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体真核表达载体,转染CHO-K1细胞后经过3轮亚克隆筛选获得稳定表达抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体的细胞系,表达量约为1 mg/L,SDS-PAGE和Western blot法检测到目的蛋白的表达,微量细胞中和实验检测其中和活性,与亲本单克隆抗体(mAb)的中和活性相近。结论:抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体在CHO-K1细胞中成功表达,并具有良好的中和活性,为该抗体进一步的实验研究和临床应用奠定了基础。     

人-鼠嵌合抗体表达载体的构建和抗人HER2抗体的表达

目的 :构建表达人 鼠嵌合抗体的通用真核表达载体 ,用于以嵌合抗体的形式表达PCR获取的小鼠抗体可变区基因 ,以便将人 鼠嵌合抗体应用于临床治疗。方法 :用人Tac抗原信号肽以及人IgCκ基因和γ1CH基因 ,构建人 鼠嵌合抗体的表达载体 ,并转染真核细胞 2 93T进行表达。用RT PCR、FACS和ELISA进行抗体表达的鉴定。结果 :利用人Tac抗原信号肽以及人IgCκ基因和γ1CH基因 ,构建了用于表达人 鼠嵌合抗体的通用真核表达载体。用本研究设计的引物 ,扩增小鼠抗人HER2抗体的V区基因片段 ,酶切后先后插入所构建的载体的相应克隆位点 ,转染 2 93T细胞可将PCR获得的小鼠抗体V区基因片段表达为人 鼠嵌合抗体。用RT PCR、FACS和ELISA证实 ,本系统可表达嵌合抗体。结论 :构建了人 鼠嵌合抗体的真核表达载体 ,并证实了其可在 2 93T细胞中表达。     

构建hTNF-α/293基因细胞对人结肠癌细胞增殖影响的实验研究

目的通过体外实验研究观察稳定转染hTNF—α／293基因细胞对人结肠癌（LOVO）细胞生长增殖影响。方法采用RT—PCR和ELISA检测稳定转染hTNF-α／293基因细胞和Hek-293细胞mRNA和蛋白表达水平。观察体外培养中,hTNF—α／293基因细胞与LOVO细胞共同培养,于不同的时间点,采用噻唑蓝MTF法检测LOVO肿瘤细胞增殖的活性。结果重组质粒转染Hek。293细胞后,Western blot检测到了hTNF-α蛋白体外表达,检测表明hTNFα／293细胞组和hTNFα阳性组对共培养的LOVO细胞的增殖具有明显的抑制作用,且具有良好的量效关系。结论提示稳定转染hTNF—α/293对LOVO细胞增殖有明显抑制效应,且呈现出良好的数量依赖关系。由于TNF—α／293基因细胞可有效分泌hTNFα蛋白,并能分泌到细胞外。     

从噬菌体环肽库中筛选TNF-α表位模拟肽的研究

目的：用具有中和活性的抗TNF—α单抗(mAb)J1D9筛选噬菌体环七肽库，从中获得可模拟TNF—α表位的短肽。方法：筛选TNF—α表位模拟肽，并用夹心ELISA法鉴定阳性克隆。结果：对环七肽库进行3轮筛选后，随机挑选20个噬菌体克隆，经ELISA鉴定出9个阳性克隆。DNA序列分析后，推导的氨基酸序列共3种：c—RRPAQSG—c、c—NKHNRKI—c和c—RGMSRKI—c。结论：筛选的环七肽克隆展示肽具有TNF—α的抗原性，为TNF—α表位模拟肽。     

TNF受体封闭肽对大鼠腹腔巨噬细胞功能的影响

目的：观察TNF受体封闭肽在体外对大鼠腹腔巨噬细胞功能的影响。方法：用NBT的方法检测呼吸爆发；用RT—PCR检测大鼠腹腔巨噬细胞IL-1β mRNA和TNF-α mRNA水平；用Western blot检测大鼠腹腔巨噬细胞NF-kBp65核转位。结果：TNF受体封闭肪可完全拮抗TNF-α诱导大鼠腹腔巨噬细胞呼吸爆发，明显抑制TNF-α诱导的IL-1βmRNA和TNF-αmRNA的转录，使腹腔巨噬细胞TNF-α诱导的NF-kBp65核转位明显减少。结论：TNF受体封闭肽在体外能有效抑制TNF-α诱导的大鼠腹腔巨噬细胞功能。     

小鼠SLC基因真核表达载体的构建及其趋化活性鉴定

目的：克隆小鼠次级淋巴样组织趋化因子(secondary lymphoid-tissue chemokine，SLC)基因，并构建真核表达载体。在体内外检测该表达载体表达产物的免疫趋化功能。方法：用RT—PCR从C57BL／6小鼠胸腺组织中克隆小鼠SLC基因，构建真核表达载体pcDNA3．1—msLC。在体外，用基因枪转染小鼠黑色素瘤B16F10细胞；RT—PCR检测转染细胞有SLC的表达；利用趋化小室法，检测表达产物针对淋巴细胞的趋化活性。在体内，用基因枪通过小鼠皮肤局部转染SLC基因，观察转染局部淋巴细胞的浸润。结果：克隆的基因经测序证实，为小鼠SLC基因Scya21b型。转染SLC基因的B16F10细胞体外培养48h后，RT—PCR检测到SLC的表达，同时培养基上清具有针对淋巴细胞的趋化活性。通过基因枪局部转染小鼠皮肤，24h后皮肤病理检查显示，局部皮内有明显的淋巴细胞浸润。结论：从小鼠胸腺组织中克隆到小鼠SLC基因，构建的真核表达载体pcDNA3．1—mSLC在体内外均可以表达，并具有针对淋巴细胞的趋化活性。     

TNF-α对小鼠腹腔渗出细胞抗真菌活性的影响

目的：研究TNF—α对小鼠腹腔渗出细胞的激活和杀菌活性的效应。方法：以IL-12、IL-18、IFN—γ、TNF-α及抗体诱导小鼠腹腔渗出细胞和巨噬细胞，应用ELISA法测定细胞因子变化，Griess反应法测定培养上清液中NO的含量，检测巨噬细胞内新型隐球菌菌落数。结果：IL-12和IL-18联合应用协同诱导腹腔渗出细胞产生TNF—α，且能被IFN—γ抗体所抑制。IFN—γ、TNF-α协同诱导巨噬细胞产生NO和增强其杀伤新型隐球菌活性。结论：TNF—α在细胞因子相互调节诱导增强巨噬细胞杀真菌活性中起重要作用。     

人乳头状瘤病毒(HPV)16L1病毒样颗粒蛋白与HPV16L1基因联合免疫的体液免疫反应及其抗体的体外中和实验

目的用含有编码人乳头状瘤病毒(HPV)16L1和HPV16L1病毒样颗粒(VLP)蛋白联合免疫小鼠,与用HPV16L1重组表达质粒比较,观察VLP蛋白免疫对免疫小鼠产生抗体的增强作用,以及抗体的体外中和作用,寻找研制HPV16感染的预防性疫苗的有效途径。方法将c57BL／6小鼠,随机分为4组：Ⅰ组：pcDNA-L1(100μl/鼠),Ⅱ组：pcDNA—L1(70μl/鼠) HPV16K1 VLP,Ⅲ组：pcDNA3.1(100μl/鼠)空质粒,Ⅳ组：PBS缓冲液。质粒免疫3次,间隔3周。ELISA法检测其血清抗体,红细胞凝集实验和HPV16病毒样颗粒结合抑制实验体外检测抗体的中和活性。结果pcDNA-L1 HPV16L1 VLP较pcDNA—L1免疫组,3次免疫后的抗体水平均增高,尤其以第2次和第3次免疫后的抗体水平增加更显著。pcDNA—L1 HPV16L1 VLP联合免疫组血清的抑制活性高于pcDNA—L1免疫组,且．He[a细胞结合抑制实验染色呈阴性。结论HPV16L1 VLP联合免疫可以增加目的抗原的中和抗体产生,可能是HPV16有效预防性疫苗研制的更有希望的策略。     

Ⅰ型人免疫缺陷病毒gag-gp120嵌合基因核酸疫苗的构建与鉴定

目的：构建含Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)gag—gp120嵌合基因核酸疫苗的表达质粒。方法：将gag和gp120连接后的嵌合基因插入到真核表达载体pVAX1中，构建真核表达质粒pVAXGE。用脂质体法将构建的重组质粒转染Hela细胞72h后，取转染的Hela细胞进行RT—PCR检测和和Dot—ELISA分析。结果：重组质粒转染细胞的总RNA中，可扩增出目的基因的转录产物。Dot-ELISA的结果显示，目的基因在Hela细胞内得到表达。结论：成功地构建了表达gag—gp120嵌合基因的核酸疫苗质粒，为HIV—1核酸疫苗的制备奠定基础。     

人/鼠嵌合模型中人重组α-病毒疫苗的免疫学作用评价

目的 建立人／鼠嵌合模型(Trimera)，并研究重组α-病毒在此模型中对人黑色素瘤的免疫学作用。方法 构建人／鼠嵌合模型并用流式细胞术进行鉴定。构建重组病毒和重组质粒并在体外转染鉴定其表达。疫苗免疫动物后检测特异抗体滴度和细胞毒T淋巴细胞活性。结果 FACS分析发现，人白细胞占Trimera小鼠腹腔淋巴细胞的88．84％，脾脏中为57％。免疫后的小鼠腹腔细胞在效／靶比为100：1时，细胞毒T淋巴细胞的杀伤率达到70％，psMART2a/MAGE-3和pCI-neo／MAGE-3免疫小鼠的杀伤率为分别为50％和30％左右。ELISA结果显示，重组病毒MAGE-3／SFV和重组质粒pSMART2a／MAGE-3免疫小鼠后产生的MAGE-3特异抗体的效价均达到1：512，重组质粒pCI-neo／MAGE-3免疫动物后的抗体效价为1：256。结论 成功建立了人／鼠嵌合模型，并在动物体内有效激发了针对人黑色素瘤MAGE-3蛋白的初次免疫应答；重组α-病毒疫苗和基于α-病毒复制酶的基因疫苗免疫效果要好于常规基因疫苗。     

抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体的表达及体外对癌细胞浸润的抑制效应

目的 制备抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体。方法从分泌抗人组织蛋白酶B单克隆抗体的杂交瘤细胞株提取总RNA，通过RT-PCR扩增单克隆抗体VH和VL的DNA片段，对其进行序列分析，证实具有小鼠可变区完整的结构，利用基因工程技术将它们分别和人Ig的Cγ1和Ck恒定区基因连接组建人鼠嵌合轻链和重链Fab抗体，并克隆到pcDNA3真核细胞表达载体。将重组体转染到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，通过G418筛选、ELISA检测和Western blot鉴定，分离纯化抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体，用于体外抑制癌细胞浸润的试验。结果得到分泌抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体的中国仓鼠卵巢细胞克隆(O62A2)，分泌的抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体在体外能抑制癌细胞浸润。结论人-鼠嵌合抗体的成功表达，将有可能用于组织蛋白酶B过度表达的有关疾病的治疗。     

人重组TNF-α突变体471蛋白的初步纯化及生物学活性

目的：在利用原核表达系统表达重组人突变体471 TNF—α蛋白的基础上，对该蛋白进行初步纯化及生物学活性检测。方法：利用最佳发酵和表达条件，诱导基因重组的人突变体471 TNF—α工程菌表达目的蛋白。收集菌体，经超声破碎，分离人突变体471 TNF—α的包涵体，并观察变性剂及蛋白浓度对蛋白折叠的影响。采用MTT比色法检测并比较人野生型及突变体471 TNF—α的生物学活性。结果：在适当的变性与复性条件下，已成功地将突变体471 TNF—α折叠并聚合形成具有生物学活性的三聚体。突变体471 TNF—α对L929的细胞毒活性高于野生型TNF—α的15倍。结论：原核表达系统中表达的人突变体471 TNF—α经复性处理后具有显著的生物学活性，为进一步进行动物实验及临床研究奠定了基础。     

氯霉素乙酰基转移酶双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的 建立氯霉素乙酰基转移酶（chloramphenicol acetyltransferase,CAT)双抗体夹心ELISA的实验室检测方法。方法 从质粒pBLCAT6经PCR扩增CAT基因序列，插入到原核表达质粒pGEX-2T中，在大肠埃希菌DH5α中诱导表达；以纯化的融合蛋白GST-CAT为抗原免疫实验用兔，得到的CAT抗血清进行生物素标记，并在此基础上利用生物素链和亲和素放大系统建立双抗体夹心ELISA法，构建不同YY1结合位点突变的HPV16LCRCAT报道质粒，体外瞬时转染真核细胞，提取胞质蛋白，以建立的方法进行CAT表达检测。结果 SDS-PAGE显示表达的GST-CAT融合蛋白相对分子质量约为54000；制备的CAT抗血清可有效地识别原核及哺乳动物细胞表达的CAT蛋白；在不同启动子及调节序列的控制下，利用建立的CAT检测技术证明在瞬时转染的细胞中可诱导2-8倍的CAT表达增强。结论 建立的双抗体夹心ELISA方法可敏感地反映上游序列的启动子活性，以及启动子调节序列变化对启动子活性的影响，使CAT作为报道基因的研究更为简单化。     

抗TNF-α人单链抗体的分离纯化及鉴定

目的对通过大容量抗体库中筛选到的4株抗TNF-人单链抗体进行分离纯化及鉴定。方法采用硫氰酸盐洗脱ELISA法评估阳性克隆的亲和力;亲和层析柱纯化抗体;通过ELISA检测抗体的特异性结合活性;用L929细胞检测其体外中和TNF-α的活性。结果用硫氰酸盐洗脱法测定4个噬菌体抗体的相对亲和力与其相应的可溶性抗体相对亲和力相一致;SDS-PAGE电泳结果表明,单链抗体得到成功纯化;ELISA结果表明,纯化的抗体能够特异性结合人TNF-α;体外中和试验证明筛选到的单链抗体能中和TNF-α对L929细胞的毒性。结论从人源大容量噬菌体抗体库中能够筛选到具有中和活性的抗TNF-α人单链抗体。     

基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达和活性研究

目的　在CHO细胞中表达基孔肯亚病毒人 鼠嵌合抗体 ,并对其活性进行分析。方法以质粒pcDNA5 /FRT为骨架 ,应用pCI dhfr1(本室构建并保存 )的dhfr基因和hCMV启动子及SV4 0polyA ,构建了含有共扩增基因的哺乳动物双启动子表达载体 ,RT PCR克隆具有中和活性鼠源单克隆抗体的轻重链可变区基因 ,与人IgG1轻重链恒定区基因融合后亚克隆到表达载体pA的多克隆位点 ,构建了表达质粒pA HL ,脂质体转染CHO(dhfr )细胞 ,撤掉胸腺嘧啶和次黄嘌呤并不断提高MTX的浓度 ,筛选表达量高的克隆 ,扩大培养、收集上清 ,并纯化 ,纯化的嵌合抗体进行SDS PAGE、Western印迹、抗原结合活性和微量细胞中和实验。结果　在MTX的浓度为 2× 10 -7mol/L时 ,获得稳定表达细胞株 ,表达量为 5mg/L。结论　成功地在CHO(dhfr )细胞表达了具有中和活性的基孔肯亚病毒人 鼠嵌合抗体 ,为制备抗基孔肯亚病的被动免疫制剂奠定了良好的基础。     

抗RSV人-鼠嵌合抗体的构建及表达

用RT PCR法克隆抗RSV 鼠单抗4C2 的轻、重链可变区基因, 构建了轻、重链分别表达的载体pAG4622_4C2 和pAH4604 4C2, 及轻、重链同时表达的载体pdHL4C2, 分别转染SP2/0 细胞和DHFR- CHO细胞, 检测培养上清中的嵌合抗体表达。结果在pdHL4C2 转染的CHO 细胞中检测出了可与表达RSVG/F糖蛋白的143TK 细胞结合的人 鼠嵌合抗体     

稳定高效表达TNF—α基因及其突变体的H22肿瘤细胞株的建立

目的 建立转染3种TNF－α基因（分泌型TNF－α突变体、跨膜型TNF－α突变体和野生型TNF－α的H22细胞株,以比较不同类型TNF－α的杀瘤效应。方法 采用逆转录病毒载体,将3种TNF－α基因导入小鼠H22肿瘤细胞中,用Southern印迹、RT－PCR、流式细胞术和生物学活性检测等方法,从基因的整合、RNA转录、蛋白的表达及其生物学活性4个方面,对转染细胞进行检测鉴定。结果 3种TNF－α基因匀在H22名得到有效表达,并具有生物学活性。结论 获得3种稳定高效表达TNF－α的H22肿瘤细胞株,为进一步研究跨膜型和分泌型TNF－α体内的抑瘤效应建立了良好的实验模型。     

人乳头瘤病毒16型修饰后E6E7基因免疫原性增强

利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus type 16,HPVl6)E6E7融合基因(fmE6E7)，研制治疗HPVl6相关疾病的DNA疫苗。用PCR扩增fmE6E7基因后，插人真核表达质粒获得pVRl012-fmE6E7，瞬时转染Cos-7细胞，免疫荧光法检测证实其表达后，在C57BL／6小鼠后腿肌肉进行裸DNA免疫，5lCr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性Cytotoxic T lymphocyte，CTL)，间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体。研究表明修饰后的中国地方株E6E7融合基因可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应，与单独野生型E7基因免疫相比，E6E7融和基因可更好的活化CTT反应。表明修饰后消除转化活性的中国地方株E6E7融合基因可作为HPVl6治疗性DNA疫苗的靶基因。     

重组腺病毒△N IkBα的构建及其对A549细胞中NF-kB活性的抑制

目的：探讨△N IkBα基因对NF—kB活性的调节作用。方法：构建去除Ser^32和Ser^36磷酸化位点的IkBα重组腺病毒——Ad—△N IkBα。A549细胞分为3组：即LPS组、Ad—LacZ LPS组和Ad—△N IkBα LPS组．LPS组单纯用内毒素(LPS)激活NF—kB；Ad—LacZ LPS组及Ad—△N IkBα LPS组在用LPS前2d，分别感染Ad—LacZ和Ad—△N IkBα。用western blot、电泳迁移率变动分析(EMSA)和ELISA法分别检测LPS刺激后5h，细胞总蛋白中NF—kB的活性和培养上清中TNF—α及IL-6的含量。结果：Ad—△N IkBα LPS组NF—kB的活性，TNF—α和IL-6的含量，均显著低于LPS组及Ad—LacZ LPS组。结论：突变后的IkBα可明显抑制NF—kB活化，减少TNF—α和IL-6的释放，有望成为一种强有力的抗炎治疗制剂。