保定市1株新型HIV-1重组毒株的近似全长基因组鉴定分析

目的?对保定市新发现的1株pol区不能明确分型的HIV-1毒株（BD226AJ）进行近似全长基因组扩增,并分析其亚型、重组模式和基因特点。方法?提取患者血浆中HIV-1RNA并逆转录为cDNA,使用近末端稀释法分2段对其进行近似全长基因组扩增并测序。使用jpHMM和SimPlot 3.5软件对近似全长基因组序列进行重组模式和重组断点分析,采用MEGA 6.0软件分片段构建Neighbor-joining系统进化树进一步确认重组断点的准确性。构建该近似全长基因组序列及各亚型片段Neighbor-joining系统进化树,分析该毒株的亲本来源。结果?经过近似全长基因组扩增、测序、序列拼接后,获得1条长度为8830 bp的HIV-1近似全长基因组序列。重组分析结果显示,该序列是由CRF01_AE和B亚型重组形成的,其近似全长基因组序列被3个断点分成了4个亚型片段,分别为ICRF01_AE（HXB2, 823—4224 nt）、ⅡB（HXB2,4225—5991 nt）、ⅢCRF01_AE（HX B2,5992—9295 nt）、ⅣB（HXB2,9296—9406 nt）。各亚型基因片段的系统进化树分析进一步表明该序列的可能亲本来源为CRF01_AE和B亚型。HIV BLAST的结果显示,该序列与CRF112_01B的相似性为96%,系统进化树分析进一步验证该序列与北京市男男性行为者（men who have sex with men,MSM）中的CRF112_01B序列聚集。结论?本研究在保定市MSM人群中发现了1例由CRF01_AE和B亚型重组的新型重组毒株CRF112_01B,提示HIV-1 CRF112_01B已通过MSM人群传入河北,并开始在保定市传播,因此加强该亚型或者类似新型毒株的监测,对有关部门采取针对性防控措施和遏制新型重组毒株在本地区的传播和流行具有重要意义。     

一株HIV-1 CRF65-cpx新型重组毒株的检出及基因重组序列分析

目的 对广西边境某市1例经异性接触感染HIV-1的患者血清样本进行近全长基因组序列扩增和分析,以期了解其重组模式和基因序列的特征.方法 采用RT-PCR和巢式PCR方法,对研究对象血清样本的病毒RNA进行逆转录、扩增、测序,分析基因重组断点并确认重组模式,并构建亚型系统进化树.结果 测序结果显示,毒株序列全长为8900...     

CRF07-BC亚型HIV的gag-pol区基因序列分析

目的对2株人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)CRF07-BC亚型病毒的完整gag基因和部分pol基因进行基因重组和耐药位点突变分析。方法从确诊的HIV感染者的全血样本中提取基因组DNA,经套式聚合酶链反应(Nested-PCR)扩增后,将扩增产物进行纯化和测序,然后将所得序列进行系统进化树和氨基酸变异分析。用Simplot软件进行序列重组分析以确定重组断点区域,并分析其pol基因的耐药位点突变。结果在所研究的基因区段内,2份样本均未发现重组断点的变化,在蛋白酶区(PR)出现2个次要耐药相关突变,而未发现主要耐药相关突变。结论所研究的2株HIV-1CRF07-BC亚型病毒与在我国新疆地区广泛流行的CRF07-BC模式毒株非常接近,且不存在天然耐药的情况,适于抗逆转录类药物的应用。     

1例输入性HIV-1 G亚型毒株的检出及基因组序列分析

目的 对1例输入性HIV-l G亚型感染者病毒基因组进行序列测定,并进行系统进化分析.方法 采集在本地区艾滋病监测中发现的1例HIV-1 G亚型感染者的血清,提取病毒RNA,利用反转录巢式-PCR技术扩增并测定病毒近似全长基因序列.结果 获得此毒株近似全长基因组序列,长度为8695 bp.重组分析结果显示,此毒株序列中...     

基于二代测序技术建立覆盖我国主要流行亚型的HIV-1近全长基因组测序方法北大核心CSCD

目的 基于二代测序技术建立一种适合我国主要流行亚型的HIV-1近全长基因组扩增和测序方法,并优化建立标准检测流程,为HIV-1的全基因组序列鉴定和相关系统进化分析等应用提供重要技术手段。方法 基于我国HIV-1主要流行亚型设计扩增引物,通过扩增两段交叉重叠的基因序列获得HIV-1近全长基因组。并通过使用不同反转录试剂与扩增试剂以及尝试不同反应体系和反应条件,分析对HIV-1近全长基因组扩增的效果以及进行二代测序所获序列质量的影响。结果 本研究基于二代测序技术建立的HIV-1近全长基因组扩增和测序方法可成功扩增我国主要HIV-1流行亚型CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B、CRF55_01B,进行二代测序所获基因组序列的平均比对率为95.18%(89.74%~99.16%),平均覆盖率为94.96%(83.58%~99.98%),平均测序深度为5323.10×(3026.68×~6790.57×)。进一步分析不同亚型毒株每个基因位点的测序深度覆盖图,发现CRF08_BC亚型与CRF105_0108亚型的毒株测序深度分布均匀,均高于6000×,其他亚型的毒株样本在6672~8196 bp之间有部分基因位点的测序深度较低。优化和建立的标准检测流程可成功扩增病毒载量大于104copies/mL的样本并获得准确的近全长基因组序列。结论 本研究基于二代测序技术建立了一种HIV-1近全长基因组扩增与测序方法,该方法可成功扩增我国主要流行亚型毒株,为我国应用HIV-1基因组序列开展艾滋病精准防控工作提供了重要技术支撑。     

云南省20个HIV-1独特型重组毒株近全长基因序列特征分析

目的研究云南省目前主要流行的艾滋病病毒1型(HIV-1)的独特型重组(URFs)毒株的分子变异特点。方法收集2012-2014年云南省14个地市,800例在定点医院随访的HIV感染者或艾滋病患者的血样及流行病学调查信息,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法,分别扩增HIV-1的3′半分子和5′半分子。测序后,序列应用contig软件校对拼接,获得约9.0kb的近全长基因组,后用Genotyping、MEGA 6.06和BLAST工具软件确定毒株亚型,挑出新型独特型重组毒株,分析云南省HIV-1独特型重组毒株的基因变异及重组进化情况。结果共获得800例样本的103条近全长基因组,分析后挑出独特型重组毒株20个,分别来自于昆明、德宏、红河、昭通、大理和西双版纳地区。20个毒株之间的平均基因距离为(0.204±0.015),分别与来自泰国、印度、越南和日本的国际参考株的平均基因距离较为接近。云南省HIV-1独特型重组株呈现3种基因重组模式,主要为以C亚型为骨架的11株,其次是CRF0l_AE为骨架的7株,和B(B′)为骨架的2株。从重组区域上看,env、nef和rev基因是最易发生重组的基因区域。结论在2012-2014年间,云南省的HIV-1毒株呈现高度重组进化趋势,出现了大量的独特型重组毒株,且这些毒株与一些东南亚国家的毒株表现出高度同源性,其重组的类型和模式比较复杂,并且在全省范围内广泛传播开来,应密切监测流行趋势变化。     

上海市男男性行为者中感染HIV-1的CRF01_AE毒株传播簇分析

目的了解上海地区男男性行为者(MSM)中,感染艾滋病病毒1型(HIV-1)的CRF01_AE重组型的流行情况、成簇特性,为HIV防控工作提供科学数据。方法从2009-2013年每年新诊断的MSM HIV-1感染者血浆样本中提取RNA,并对HIV-1 pol基因片段进行反转录和巢式PCR扩增、DNA测序和亚型分析。对CRF01_AE重组型序列进行系统进化学和社会人口学信息分析。结果 1262名MSM感染者中,CRF01_AE重组型感染782人(62.0%),其序列在系统进化树上形成6个流行簇。使用不同参数界定传播簇并进行比较,选择以Bootstrap≥90%及基因距离≤0.03作为传播簇的界定标准,形成112个传播簇,其中由10条及以上序列形成的传播簇有5个;年龄、文化程度、婚姻状况、性病史和CD4+T淋巴细胞计数与样本的成簇性有统计学关联。结论 CRF01_AE重组型毒株是上海市MSM HIV-1感染者中的优势传播株,具有较强的成簇性,并且与相关的社会人口学和流行病学背景相关。     

CRF01_AE CRF07_BC和B''''亚型HIV-1 pol基因及耐药特征分析

目的 研究中国部分地区新发现未经抗病毒治疗的艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1)感染者的耐药情况,及不同亚型毒株pol基因的多态性对耐药突变产生的影响.方法 选取2005-2006年湖南、云南、四川和新疆4省(自治区,下同)当年确认的部分样本,进行核酸扩增及测序,利用系统进化及重组分析的方法确定亚型;根据美国斯坦福大学HIV-1耐药数据库,分析不同亚型毒株蛋白酶基因和逆转录酶基因的多态性和耐药突变情况;利用荷兰乌得勒支大学Vijver等人使用的一种遗传障碍定量方法,计算并比较不同亚型间耐药突变产生的遗传障碍.结果 共得到84份样本PR基因区(1-99氨基酸)和RT基因区(1-272氨基酸)的序列,亚型分析显示:84份样本中B'亚型13份,01AE重组亚型27份,07BC重组亚型44份,其中18份样本在蛋白酶基因区的第10位和第71位存在次要耐药突变;来自云南省和湖南省的3份样本中,存在逆转录酶抑制剂相关耐药突变,分别是A62V、V179D和G190A.三种亚型在逆转录酶基因区的2个非核苷类抑制剂相关耐药突变位点V106M和V108I的遗传障碍存在差异,有显著的统计学意义(P＜0.001).结论 4个地区未冶疗感染者中耐药发生的水平较低.遗传障碍的比较,CRF01AE、CRF07BC与B'亚型病人经治疗后主要耐药突变的发展模式应基本一致.     

重庆市HIV-1流行毒株的基因序列测定和亚型分析

目的对重庆市流行的艾滋病（AIDS）病毒1型（HIV-1）进行分子流行病学调查,为艾滋病预防控制策略的制定提供依据.方法用套式聚合酶链反应（nested-PCR）对31份重庆市HIV-1抗体阳性者外周血单个核细胞（PBMC）中前病毒DNA的膜蛋白基因的C2-V3区,及其邻区300个核苷酸序列进行测定和分析.结果31份标本中有21份扩增阳性并得到相应序列,扩增率为67.6%.经过基因离散率计算和系统树分析后证实：1份标本为CRF01-AE流行重组毒株,20份标本为HIV-1 BC重组毒株.结论目前重庆市HIV-1 BC重组病毒为优势流行株,为有效控制HIV流行,需要重点在吸毒人群中开展行为干预措施.     

福建省HIV-1新型独特重组毒株的鉴定分析

目的了解福建省1型艾滋病病毒(HIV-1)新型重组毒株的出现和传播情况,为艾滋病防治提供有针对性的科学依据。方法对2015年福建省HIV-1分子流行病学调查发现的未明确分型样本进行流行病学特征分析,分三段nested-聚合酶链反应扩增,获得HIV-1近全长基因片段序列。利用MEGA构建系统进化树,Simplot进行重组断点分析,最后通过Recombinant Drawing工具绘制重组镶嵌模式图。结果福建省56份未明确分型样本主要来自沿海经济较发达地区,且集中在文化程度较低的青壮年男性人群,主要以性传播为主。亚型分析显示,其中38份为CRF01-AE/CRF07-BC混合亚型,9份为01B/01-AE/07-BC混合亚型,9份为CRF55-01B/CRF07-BC混合亚型。对3株HIV-1近全长基因序列进行重组分析显示:XM03025是以CRF07-BC为骨架,在1916-2186bp、2786-5526bp、8726-8776bp、9216-9366bp处分别插入4个CRF01-AE的片段;XM03050是以CRF07-BC为骨架,在4916-6256bp处插入1个CRF01-AE片段;而XM06004是以CRF01-AE为骨架,在6490-6680bp、6920-8290bp、8950-9190bp处分别插入3个CRF07-BC片段。经鉴定该三株为新的独特重组型毒株。结论福建省已出现新的独特型重组毒株,并有可能在局部传播流行;应密切监测其流行趋势变化,并积极采取精准干预加以防控。     

黑龙江省服刑人员HIV-1nef基因分析

目的研究黑龙江省服刑人员中HIV-1感染者病毒流行株的起源及其序列变异特征。方法采集黑龙江省16例感染HIV-1服刑人员的抗凝全血,分离血浆,用巢式聚合酶链反应对HIV-1附属基因(nef)进行扩增,并直接进行序列测定。应用BioEdit和MEGA软件进行序列及系统发育分析。结果系统进化树显示12例体内HIV的nef区序列属于泰国B亚型,3例属于重组型BC,1例属于重组亚型AE。各隔离株nef区的组内基因距离为13.53%。按传播途径分组,各组基因距离差异无统计学意义(P>0.05),表明nef区序列变异可能与传播途径无关。与国际标准株(HBX2)进行比较时,可发现某些nef序列的氨基酸变异。但是,大多数序列还是有较好的保守性。结论本组HIV-1病毒株可能有共同的起源,本文所讨论的氨基酸序列有望对nef功能区的未来研究提供参考信息。     

HIV-1的基因重组：分子机制及生物学特征

基因重组是导致HIV—1多态性不断增加的重要进化机制。重组发生在病毒基因组的逆转录过程中，通过模板选择来实现。新的重组病毒可能具有传播优势，从而成为流行重组形式（circulatingrecombinant forms，CRFs）。全世界现已发现43种CRFs，此数量还会不断增加。HIV-1基因重组将有利于病毒复制和传播的突变联合起来，使病毒能更快地逃避药物选择和宿主免疫压力。因此，基因重组在HIV-1的分子进化、适应宿主和逃避药物治疗等方面都是不可或缺的部分。目前对HIV-1基因重组产生和发展的机制及重组毒株的生物学特征了解得还不是很清楚。本文对HIV-1基因重组的分子机制及其对传播及致病特征的影响进行综述。     

CCR5反义RNA重组表达载体的构建及鉴定

目的构建趋化因子受体CCR5反义RNA真核表达载体以用于抗HIV-1的研究.方法用RT-PCR从健康人外周血单个核细胞(PBMCs)中获得趋化因子受体CCR5翻译起始区的基因片段,用基因重组技术将此目的基因以正、反两个方向定向插入到逆转录病毒载体pLXSN.用PCR、内切酶分析及序列测定鉴定.重组载体用脂质体转染剂(lipofectAMINE)转染PA317包装细胞,建立稳定表达重组假病毒颗粒的包装细胞系.结果从正常人PBMCs中获得的目的基因成功地构建了CCR5反义RNA重组表达载体,重组载体已在PA317细胞中得到整合.结论构建的CCR5正、反义RNA表达载体可有效地感染PA317细胞并在基因组中整合,为进一步研究CCR5反义RNA的抗HIV-1的作用奠定了基础.     

福建省肠道病毒71型分离株（2010FJLY008）全基因组核苷酸序列分析

目的了解肠道病毒71型在福建省的遗传背景,追踪EV71流行过程中可能发生的变异。方法对2010年福建1例手足口病患儿标本中分离到的1株肠道病毒71型分离株（2010FJLY008）进行全基因组核苷酸序列测定,并对基因组序列进行同源性比较及遗传进化分析。结果2010FJLY008株全长7 403bp,核苷酸及编码氨基酸序列同源性比较,均与08年阜阳流行株Fuyang17.08 2同源性最高,整个基因组核苷酸同源性为98.2%,氨基酸同源性为99.5%;全长基因组核苷酸序列遗传进化分析及VP1区基因遗传进化分析,与Fuyang17.08 2株进化关系较为接近,同属于C4a基因亚型。结论2010年福建省EV71型病毒流行株（2010FJLY008）在病毒基因组结构、基因组核苷酸同源性比较、编码氨基酸同源性比较、全长基因组核苷酸序列遗传进化分析及VP1区基因遗传进化分析等方面,均与2008年阜阳流行株（Fuyang17.08 2）关系密切,未产生明显的抗原漂移及变异。     

武汉市HIV-1相关基因序列分析及亚型分布

目的研究武汉市HIV感染人群中的HIV毒株的亚型分布特点和流行规律。方法采集武汉市60名已被确认为HIV-1感染者的抗凝全血样品,提取前病毒DNA,用巢式聚合酶链反应方法（nested-PCR）扩增病毒膜蛋白env基因的C2-V5区及gag基因的部分区段,对PCR纯化产物直接测序,并应用GCG软件对序列进行分析。结果通过PCR扩增得到60份样品的结果,其中env基因序列45份、gag基因序列52份。依据env和gag区基因序列,与HIV-1各个亚型国际参考株比较,通过系统进化分析,最后确定武汉市样品分属5个亚型,分别为HIV-1B亚型中的泰国B（B’）亚型32份,流行重组型CRF07-BC12份,流行重组型CRF01-AE9份,A亚型1份和C亚型6份。结论武汉市存在多种HIV-1亚型,应加强对HIV-1毒株亚型变异的监测,及时调整防治策略。     

湖北地区人类免疫缺陷病毒-1主要流行株外膜蛋白基因V3-V4区序列变异分析

目的 分析湖北地区HIV-1主要流行株外膜蛋白V3-V4区序列特征,了解其流行特点和变异规律.方法 对湖北地区HIV-1主要流行区域进行流行病学调查,应用套式PCR对102例HIv-1感染者的env基因V3-V4区进行扩增,对阳性扩增样本进行基因测序和序列分析.比较基因距离的差异用卡方检验;基因距离的变异性分析使用描述性分析法.结果 湖北地区共发现4种HIV亚型和重组亚型,其中B'亚型占82.69%,B'/C重组毒株、CRF01_AE重组毒株各占7.69%,C亚型占1.92%.湖北地区HIV-1B'亚型与来源于云南和河南等地的HIV-1B'亚型代表株之间的基因距离分别为7.08±2.19和7.88±2.28.其流行时间约为10年;氨基酸序列变异分析显示,HIV-1B'亚型毒株env基因V3、C3、V4区域均发生不同程度变异,其中以V4区的变异程度最大,V3环顶端四肽表现为GPGR、GPGK、GPGQ和GQGR,分别占46.5%、30.2%、13.6%和9.3%;V3环辅助受体预测显示,其中16.28%为CCR5型,13.95%为CXCR4型,69.77%无法预测;糖基化位点分析显示.湖北地区HIV-1主要流行株env V3-V4区9个糖基化位点有8个存在不同程度丢失.结论 B'亚型仍是湖北地区HIV优势流行株,与来源于云南和河南等地的毒株有较高同源性.     

全长乙型肝炎病毒基因组的扩增及序列分析

目的 建立一种全长乙型肝炎病毒(HBV)基因组扩增及序列分析的新方法。方法 在HBV负链开环缺口处设计引物，使用TaKaRa LA Taq^TM DNA聚合酶进行扩增，聚合酶链反应产物克隆后进行全长序列测定。结果 用此方法成功获得HBV全基因组DNA序列。将已知序列的HBV全基因组重组质粒作为模板进行敏感性和保真性测定，其敏感性为10^2个初始模板，核苷酸的人为突变率为1．2bp／kb。结论 此方法可用于大规模HBV全基因组扩增和序列分析，为HBV的基础和临床研究提供了一种新方法。     

九江市HIV-1流行毒株基因序列测定和亚型分析

目的了解九江市艾滋病病毒1型(HIV-1)流行毒株的亚型分布情况。方法对采集的6份九江市HIV-1感染者的血浆样品进行RT-PCR扩增,获得gag基因的核酸片断进行核苷酸序列分析。结果在6份样品中发现B’亚型HIV-1毒株4株,B亚型和A/E重组亚型HIV-1毒株各1株。结论HIV-1流行毒株亚型在九江市分布情况复杂,防控形势严峻。     

2013-2022年江苏省柯萨奇病毒A6型全基因组序列特征分析

目的 研究江苏省2013-2022年分离到的柯萨奇病毒A6型(CV-A6)全基因组序列特征及对全基因组各编码区进行遗传进化分析,以期从分子流行病学特征的角度解释CV-A6取代肠道病毒A71和柯萨奇病毒A16成为江苏省引起手足口病(HFMD)主要病原的原因。方法 选取2013-2022年间江苏省地区流行的35株CV-A6毒株进行全基因组测序,采用DNASTAR、MEGA7.0和Similarity plots3.5.1等软件对获取的全基因组序列进行比对、相似性分析、系统进化分析和基因重组分析,对P1编码区和3D区主要氨基酸变异位点进行分析。结果 35株CV-A6江苏毒株的全基因组核苷酸和氨基酸序列相似性分别为87.5%～99.6%和97.0%～99.8%,与CV-A6原型株Gdula/USA/1949的全基因组核苷酸序列相似性仅为80.3%～81.0%,氨基酸序列相似性为94.7%～95.3%。基于VP1序列的系统进化树结果显示,2013-2022年江苏省有34株CV-A6分离毒株分属于D3a基因亚型,1株分属于D2基因亚型;基于3D区进化树划分不同重组模式,2013-2022年江苏省流...     

中华按蚊防御素基因 cDNA序列和基因组序列的克隆及鉴定

目的 克隆中华按蚊防御素基因全长cDNA序列及基因组序列,并对其进行鉴定和生物信息学分析。方法 根据已发表的埃及伊蚊和冈比亚按蚊等的防御素基因序列设计引物,提取中华按蚊总RNA并构建其基因组文库,分别进行多轮RT-PCR和巢式PCR扩增,将所得片段进行克隆、测序,并应用相关生物信息学软件对序列进行鉴定和分析。结果 从中华按蚊基因组文库中扩增出完整的防御素基因组序列(由两个外显子和一个内含子组成)以及5′端和3′端的非编码序列(UTR)片段,总长度为2 256 bp;从中华按蚊总RNA中扩增出大小为324 bp的cDNA片段,经测序证实为中华按蚊防御素基因全长cDNA序列,其开放阅读框共编码107个氨基酸,成熟肽部分具有40个氨基酸残基。结论 首次克隆出中华按蚊防御素基因全长cDNA序列及基因组序列,为进一步的功能研究奠定了基础。