MitoK_(ATP)-PKC通路对人体肺动脉平滑肌细胞电压门控钾通道的影响

目的 以人体肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)为研究对象,研究线粒体膜上ATP敏感的钾通道(MitoKATP)对HPASMCs膜电位及电压门控钾通道(KV1.5)表达的影响,以及蛋白激酶C(PKC)在其信号转导中的可能作用.方法 从人正常肺组织分离出HPASMCs进行培养.利用激光共聚焦显微镜技术检测细胞线粒体膜电位(ΔΨm),全细胞膜片钳技术记录细胞膜电流变化,Western blot检测KV1.5蛋白和PKC-α的表达情况.结果 ①Diazoxide组肺动脉平滑肌细胞PKC-α的表达比正常对照组明显增强(P<0.05);这种作用可被5-羟基癸酸盐(5-HD)的作用所逆转;单独应用5-HD,平滑肌细胞PKC-α的表达与对照组比较差异无显著性意义.② Diazoxide作用24 h可明显抑制Kv电流以及下调Kv1.5蛋白的表达(P<0.05);佛波酯(PMA) 作用24 h也可明显抑制Kv电流以及下调Kv1.5蛋白的表达(P<0.05),而加入R0-31-8220可以逆转PMA的这一作用;Diazoxide和PMA同时应用较其中之一单独应用对人肺动脉平滑肌细胞Kv电流和Kv1.5表达有更加明显的抑制作用(均P<0.05);Diazoxide与R0-31-8220同时应用则部分逆转了Diazoxide对肺动脉平滑肌细胞Kv电流和Kv1.5表达的抑制(均P<0.05).结论 MitoKATP的开放和ΔΨm的增加可抑制Kv通道的活性和表达,可能参与并影响了肺动脉高压的发生发展, PKC在其中可能起介导作用.     

线粒体ATP敏感钾通道对哮喘大鼠气道平滑肌细胞表型转化的影响

目的 研究线粒体ATP敏感钾通道(mitoKATP)对哮喘气道平滑肌细胞(ASMCs)表型转化的影响.方法 腹腔注射和雾化吸人制备哮喘大鼠模型.取哮喘及正常大鼠ASMCs,分为以下6组进行干预:正常对照组;正常+mi-toKATP开放剂diazoxide组;正常+mitoKATP阻断剂5-HD组;哮喘对照组;哮喘+diazoxide组;哮喘+5-HD组.激光共聚焦显微镜检测各组ASMCs R-123荧光强度以反映线粒体膜电位(△ψm),Western blot法检测各组细胞α一肌动蛋白(ractin)表达量.结果 ①与正常对照组比较.哮喘对照组R-123荧光强度明显增强,α-actin表达明显下调(均P<0.05).②diazoxide干预ASMCs 24 h后.正常及哮喘ASMCs R-123荧光强度均明显增强(均P<0.05);正常ASMCs α-actin表达量无明显变化(P>0.05).但哮喘ASMCs α-actin表达量明显增加(P<0.05).结论 diazoxide引起mitoKATP开放,并逆转哮喘ASMCs由收缩型向合成型发生的表型转化.     

色素上皮衍生因子对缺氧条件下H9C2心肌细胞保护作用

目的 探讨色素上皮衍生因子(PEDF)对H9C2心肌细胞在低氧无血清条件下的保护作用及其可能的机制.方法 体外培养H9C2细胞进行低氧无血清处理,将细胞分为对照组(H9C2)、缺氧组(缺氧+H9C2)、PEDF组(缺氧+H9C2+PEDF)、残粒体分裂抑制剂(Medivi-1)组(缺氧+H9C2+Mdivi-1).TUNEL染色检测H9C2心肌细胞凋亡率;Western blot检测动力相关蛋白1(Drp1)、活化半胱天冬酶-3(Cleaved-Caspase3)的蛋白水平;电镜及MitoTracker Red检测线粒体形态;采用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测线粒体膜电位,MitoSOXTM检测线粒体活性氧簇(ROS)水平.结果 缺氧诱导H9C2细胞线粒体分裂,缺氧组(6 h)与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),PEDF减少缺氧条件下线粒体分裂,PEDF组与缺氧组(6 h)比较差异有统计学意义(P＜0.05),PEDF和Mdivi-1可以减少缺氧条件下(24 h)细胞凋亡,与缺氧组(24 h)比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PEDF通过抑制缺氧条件下H9C2细胞线粒体分裂减少细胞凋亡.     

益智口服液对阿尔茨海默病大鼠不同脑区细胞凋亡的影响

目的：观察益智口服液对阿尔茨海默病（AD）大鼠不同脑区细胞凋亡的影响。方法：在大鼠CA₁区注入有活性的Aβ₁-40制备AD模型，将30只造模成功的成年雄性清洁级Wistar大鼠随机分为益智口服液组、褪黑素组和AD模型对照组(每组10只)，分别灌胃益智口服液、褪黑素和生理盐水。40 d后处死大鼠，用免疫组化等方法观察细胞凋亡百分率、线粒体膜电位、细胞色素C蛋白质表达变化。结果：与AD模型对照组比较，益智口服液组细胞凋亡百分率明显降低（P<0.05）、线粒体膜电位升高（P<0.05）、细胞色素C蛋白质表达降低（P<0.05）。结论：益智口服液可以通过升高线粒体膜电位、降低细胞色素C蛋白质表达改善AD鼠痴呆状况。     

缺氧对人肺动脉平滑肌细胞内活性氧及细胞色素C的影响及意义

目的观察缺氧对人肺动脉平滑肌细胞(hPASMCs)内活性氧(ROS)及细胞色素C表达的影响,探索缺氧性肺动脉高压的形成机制。方法购买hPASMCs,分别在常氧条件和缺氧条件下进行培养,连续细胞培养72h,并观察细胞增殖情况;使用CCK-8法分别于细胞培养后的1、24、48及72 h连续观察细胞增殖情况,使用分子探针对上述时间节点hPASMCs内的ROS水平进行检测,使用Westernblot检测hPASMCs内细胞色素C的表达水平。结果常氧组与缺氧组在1、24、48及72 h的培养过程中,其细胞增值水平的OD值分别为缺氧组(0.306±0.004、0.733±0.009、0.973±0.018和1.258±0.030)、常氧组(0.307±0.004、0.459±0.022、0.751±0.021和1.151±0.037),2组细胞的增殖水平差异有统计学意义(P<0.05),缺氧组的hPASMCs增殖水平明显高于常氧组;2组hPASMCs在1、24、48及72 h的培养过程中,其细胞内ROS荧光OD值差异分别为缺氧组(2.32±0.192、3.46±0.270、4.12±0.25...     

线粒体-细胞色素C途径在非酒精性脂肪肝大鼠肝细胞凋亡中的作用

目的 研究大鼠非酒精性脂肪肝形成中肝细胞凋亡以及线粒体-细胞色素C途径在其中的作用.方法 Wistar大鼠40只,随机分为正常对照组和高脂饲料2、4、8和12周组(其中每组各8只);HE染色光镜观察肝脏组织病理改变;采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(TUNEL)以及流式细胞仪检测肝细胞凋亡指数;激光共聚焦显微镜检测肝细胞线粒体膜电位;免疫组织化学检查caspase-3在肝脏表达分布,Western blotting检测细胞色素 C以及caspase-3含量变化.结果 高脂饮食组4～12周组肝细胞线粒体膜电位与对照组比较明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01);高脂饮食组肝细胞凋亡指数与对照组比较明显增加,随着脂肪肝的加重逐渐增高,差异有统计学意义(P＜0.01);高脂饮食组细胞色素C含量以及caspase-3蛋白表达随着时间延长逐渐增高,以12周增加明显,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 大鼠非酒精性脂肪肝引起的肝细胞损伤与肝细胞凋亡密切相关,线粒体-细胞色素C途径参与了其调控过程.     

一氧化氮对肝癌细胞线粒体膜通透性和胞浆中细胞色素C含量的影响

目的探讨一氧化氮(NO)对肝癌细胞线粒体膜通透性和胞浆中细胞色素C(cytC)含量的影响.方法用NO供体硝普钠(SNP)诱导SMMC-7721和HepG2肝癌细胞株凋亡,流式细胞术检测SMMC-7721和HepG2细胞凋亡率,MTT法观察肝癌细胞生长增殖情况,流式细胞术检测细胞线粒体跨膜电位变化,Western blot检测胞浆中cyt C含量的变化,同时应用线粒体膜通透性转变孔开放抑制剂CsA和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂BSO预处理细胞,并观察以上各指标的变化.结果 SNP能诱导人肝癌细胞SMMC-7721和HepG2凋亡,并可导致两株细胞线粒体跨膜电位下降,胞浆中cyt C含量增加,与SNP的作用时间成正比.CsA能够抑制SNP所致的肝癌细胞线粒体跨膜电位的下降及胞浆中cyt C含量的增加;而BSO则可促进线粒体跨膜电位下降,cyt C从线粒体释放到胞浆.结论 NO可能通过下调线粒体跨膜电位、开放线粒体膜通透性转变孔并释放线粒体cyt C,来诱导SMMC-7721和HepG2细胞凋亡.     

二氮嗪预处理对培养H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的 探讨线粒体KATP(Mito-KATP)通道特异性开放剂二氮嗪预处理在H9C2心肌细胞缺氧、复氧损伤中的作用及其机制.方法 将培养的H9C2心肌细胞随机分为5组,即(Ⅰ)对照组;(Ⅱ)缺氧/复氧组;(Ⅲ) 二氮嗪(DZ)预处理组;(Ⅳ) 二氮嗪加ROS清除剂2-巯基丙酰氨基乙酸(MPG)预处理加缺氧/复氧组;(Ⅴ) 二氮嗪加PKC的特异性抑制剂氯化白屈菜赤碱(CH)预处理加缺氧/复氧组.对照组常规培养;缺氧/复氧组缺氧培养100min,复氧30min;其余各组则加入相应的药物预处理10min,DZ、MPG和CH的终浓度分别为200、400mmol/L和2mmol/L,更换无血清培养基培养20 min,然后再缺氧100min,复氧30 min.采用Hoechst33258染色、JC-1荧光标记和Western blotting等方法分别检测H9C2心肌细胞的凋亡率、线粒体膜电位变化和细胞色素C的释放量.结果 二氮嗪预处理能减少缺氧/复氧损伤后H9C2心肌细胞的凋亡率(P＜0.01);阻止线粒体膜电位的下降(P＜0.01);减少线粒体释放细胞色素C(P＜0.01);预处理过程中加入MPG、CH在一定程度上可抑制二氮嗪预处理的心肌保护效应.结论 缺氧/复氧损伤可通过降低H9C2心肌细胞线粒体膜电位,引发线粒体释放细胞色素C,从而诱导心肌细胞的凋亡.开放Mito-KATP通道能减轻H9C2心肌细胞的缺氧/复氧损伤,其机制可能与开放Mito-KATP通道、释放信号分子ROS和激活PKC有关.     

依达拉奉对海马神经元缺血缺氧损伤后线粒体膜电位的影响

目的 探讨缺血缺氧损伤后依达拉奉对海马神经元线粒体膜电位的影响.方法 原代培养海马神经元细胞,建立缺血缺氧损伤模型,分为正常细胞组、缺血缺氧组、依达拉奉干预组(分别给予1、10、100、300 μmol/L依达拉奉干预)和阳性参照药维生素C干预组,将各组海马神经元细胞用线粒体膜电位敏感性染料Rhodamine-123 进行染色后,激光共聚焦显微镜分别检测线粒体膜电位.结果 与缺血缺氧损伤组比,加入100 μmol/L和300 μmol/L依达拉奉可以显著提高损伤海马神经元的线粒体膜电位,达到正常神经元线粒体膜电位的82%和87%.100 μmol/L和300 μmol/L依达拉奉组之间对线粒体膜电位的的稳定作用没有统计学差异(P>0.05).结论 缺血缺氧损伤后海马神经元线粒体膜电位下降,依达拉奉能够促进线粒体膜电位的恢复,起到神经保护作用.     

腺苷A2A受体激活抑制低氧性肺动脉平滑肌细胞增殖的机制

目的 研究腺苷A2A受体(adenosine A2A receptor,A2AR)激活对低氧肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)增殖的影响及其作用机制.方法 体外培养SD大鼠PASMCs,经免疫组化鉴定,离体培养分7组:①正常对照组(control group);②低氧组(chronic hypoxia,CH);③CH+线粒体敏感性钾通道(MitoKArP)开放剂diazoxide组;④CH+MitoKATP阻断剂5-HD组;⑤CH+A2AAR特异性激动剂CGS21680组;⑥CH+CGS21680+diazoxide组;⑦CH+CGS21680 +5-HD组.CCK-8染色法检测CGS21680对离体大鼠PASMCs增殖的影响,实时荧光定量法检测CGS-21680对大鼠PASMCs腺苷A2A受体基因表达的影响.结果 低氧使CCk-8吸光度(absorbance,A)值升高(P＜0.01),CGS-21680干预使低氧下A值明显下降,且CGS-21680和5-HD协同作用下效果更明显.Real-time RT PCR显示低氧和CGS-21680干预组A2A AR表达显著升高(P＜0.01),且以CGS-21680联合5-HD组升高最明显.结论 A2AAR激活剂CGS-21680抑制低氧PASMCs增殖,可能与阻断MitoKATP通道开放有关.     

线粒体动力学与心肌细胞能量代谢的研究进展

 【摘要】线粒体是一种高度动态变化的细胞器,通过不断地融合 分裂维持线粒体网络的稳态,线粒体融合 分裂的动态平衡对心肌细胞能量代谢和收缩功能的维持起着至关重要的作用。线粒体动力学在心血管疾病中的作用机制尚不明确,越来越多的证据表明,线粒体动力学变化参与扩张型心肌病、缺血 再灌注损伤、心力衰竭等心血管疾病的病理过程。本文围绕线粒体融合 分裂失衡与心肌细胞能量代谢的关系作简要综述。     

GDP对大鼠脑线粒体呼吸氧耗的抑制作用及其对膜电位的影响

目的 通过观察二磷酸鸟苷(guanosine diphosphate, GDP)对大鼠脑线粒体呼吸氧耗作用的量-效关系及对膜电位的影响,探讨脱偶联蛋白(uncoupling proteins, UCPS)活性改变与线粒体呼吸氧耗和膜电位的关系.方法 应用差速离心法提取大鼠脑线粒体,分别在不同浓度GDP干预下采用Clark氧电极法测定线粒体呼吸氧耗并计算Ⅲ态呼吸(state 3 respiration, ST3)、Ⅳ态呼吸(state 4 respiration, ST4)、呼吸控制率(respiratory control rate, RCR)、氧化磷酸化效率(oxidative phosphorylation, OPR)和采用Rhodamine123法测定线粒体膜电位(MMP).结果 大鼠脑线粒体ST3、ST4、RCR、OPR随GDP的浓度改变而改变;当GDP的浓度为0～1.4 mmol/L时,呈剂量依赖关系;当GDP达到1 mmol/L时抑制作用最明显,抑制率达51.3%;大于或小于1 mmol/L时其抑制率均降低;在GDP对呼吸氧耗抑制率最高时MMP最高.结论 UCPS的抑制剂(GDP)可直接抑制分离的大鼠脑线粒体呼吸氧耗和MMP,并呈一定的量-效关系,提示UCPS活性改变可影响线粒体呼吸氧耗和MMP.     

线粒体脑肌病中线粒体DNA的部分缺失

在2例Kearns－Sayre综合征（KSS）和2例慢性进行性眼外肌麻痹（CPEO）患者的骨骼肌线粒体DNA（mtDNA）中发现存在单一的大片段缺失突变。缺失的长度2．5～5．5kb，突变只发生在部分线粒体DNA中，突变型mtDNA占全部mtDNA的60．5％～84．6％。在10例其它的线粒体脑肌病患者骨骼肌标本和外周血标本及数例正常骨骼肌和胎肝标本的mtDNA中均未发现缺失突变。上述发现支持mtDNA的缺失突变为KSS和CPEO主要病因的观点。     

Mutations in the D-loop region of mitochondrial DNA in g astric cancer

Objective: To investigate the mutations in the D-loop region of mitochondrial DNA (mtDNA) in gastric cancer.Methods: The mtDNA of D-loop region was amplified by PCR and ,sequenced in 20 samples from gastric cancer tissue and adjacent normal membrane. Results: There were 7/20(35% ) mutations in the mtDNA of D-loop region in gastric cancer patients. There were four microsatellite instabilities among the 18 mutations. Nine new polymorphisms were identified in 20 patients. Conclusion: The mtDNA of D-loop region might be highly polymorphoric and the mutation rate is high in patients with gastric cancer.     

几种不同提取线粒体的方法对线粒体含量及活性的影响

目的比较几种不同的提取线粒体的方法对线粒体蛋白浓度及活性的影响。方法采用蔗糖密度梯度离心法、普利莱试剂盒提取方法和Pierce线粒体提取试剂盒方法分别提取线粒体,测定提取得到的线粒体蛋白浓度、污染情况和活性。结果同样数量的细胞采用普利莱法提取得到的线粒体蛋白浓度高于其他2种方法所提取的线粒体蛋白浓度(P<0.05);采用Westernblotting的方法测定提取的线粒体发现采用普利莱法提取得到的线粒体中胞质蛋白污染较其他2种方法提取得到的线粒体少,线粒体纯度高;测定线粒体中细胞色素C和ATP含量后发现同样采用普利莱法提取得到的线粒体活性最高。结论普利莱法提取线粒体的方法优于蔗糖密度梯度离心法和Pierce线粒体提取试剂盒方法。     

鱼藤酮致线粒体氧化损伤的作用和机制

鱼藤酮是线粒体呼吸链上复合体I的经典抑制剂之一。大量的研究表明当鱼藤酮作用于活体的动物或细胞 时,可导致线粒体功能紊乱、ROS生成增加,蛋白质、脂质、核酸遭受氧化损伤。以线粒体与ROS的生成、鱼藤酮促 线粒体ROS生成机制、鱼藤酮促DNA损伤机制为中心,阐述鱼藤酮致线粒体氧化损伤的相关作用和机制;同时探讨 鱼藤酮作用下线粒体DNA(mtDNA)的损伤及其可能存在的mtDNA突变。     

Impairment of Myocardial and Skeletal Mitochondria in Mice with Viral Myocarditis and Their Correlation

In order to investigate the impairment of mitochondrial membrane phospholipid local- ization and DNA3867 (mtDNA3867) deletion and the correlation between cardiac and skeletal muscle cells in mice with viral myocarditis, 50 BALB/c mice were divided into two groups randomly. In ex- perimental group (n=40), the mice were intraperitoneally injected with 0.1 mL Eagle liquid with CVB3 (TCID50=108), while in the control group (n=10), the mice were subjected to equal volume of Eagle liquid. The impairment of mitochondrial membrane phospholipid localization and mtDNA3867 deletion rate of cardiac and skeletal muscle were detected separately at day 3, 11 and 24 after injec- tion. The correlation of mitochondrial membrane phospholipid localization and mtDNA3867 deletion rate between cardiac and skeletal muscle cells cells was analyzed using Spearman method. At the day 3 after injection, in both cardiac and skeletal muscle cells, mtDNA3867 deletion rate was significantly higher in experimental group than in control group (P<0.05), but the localization of mitochondrial membrane phospholipid showed no difference between two groups (P>0.05). At day 11 after injec- tion, the mtDNA3867 deletion rate of both cells in experimental group was increased to the peak level (P<0.05), and the impairment of mitochondrial membrane phospholipid localization of both cells also increased markedly in experimental group as compared with control group (P>0.05). At the day 24 after injection, the impairment of mitochondrial membrane phospholipid localization and mtDNA3867 deletion of both cells showed a recovery tendency, but still severer than those at the day 3 after injec- tion (P<0.05). The impairment of mitochondrial membrane phospholipid localization and mtDNA3867 deletion were consistent and synchronistic between cardiac and skeletal muscle cells, and showed good correlations (P<0.05). The impairment of mitochondria plays an important role in the patho- genesis of viral myocarditis, and the skeletal muscle cells might act as a peripheral "window" to re- flect the mitochondrial damage of cardiac myocytes.     

白血病线粒体DNA突变的研究

目的：研究mtDNA突变与白血病发生、发展的关系。方法：测定26例成人白血病患者的骨髓和口腔上皮正常组织的mtDNA基因组全序列。结果：发现26例白血病病人中11例有突变(42．3％),突变类型均为碱基替代突变,其中3例突变位于Cytb基因(其中有1个是异质性突变),2例位于D—loop,其他6例分别位于复合物Ⅰ(ND1、ND2、ND4、ND5、ND6)基因和12sRNA基因。结论：线粒体突变特别是在基因Cytb的突变可能在白血病的发生发展过程中起重要作用。     

线粒体脑肌病研究进展

线粒体脑肌病是一组由于线粒体DNA实变导致的线粒体结构和功能异常．从而累及中枢神经系统和肌肉组织的疾病．其临床表现复杂多样．主要依据临床症状、生化检测、电生理、影像学检查及骨骼肌活检结果来进行诊断，目前仍缺乏有效的治疗手段。     

肥厚型心肌病患者心肌线粒体DNA的大片段缺失

目的：研究肥厚型心肌病与线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）缺失的关系。方法：应用ＬｏｎｇＰＣＲ技术扩增１例肥厚型心肌病（ＨＣＭ）患者心肌标本和血细胞ｍｔＤＮＡ。结果：在心肌ｍｔＤＮＡ中发现至少５ｋｂ缺失，而血细胞中未见缺失。结论：这支持ｍｔＤＮＡ缺失是心肌病的一个重要病因，且具有组织差异性。