RESISTANT MECHANISMS OF CISPLATIN IN HUMAN LUNG ADENOCARCINOMA CELL LINE A_(549)DDP

ＲＥＳＩＳＴＡＮＴＭＥＣＨＡＮＩＳＭＳＯＦＣＩＳＰＬＡＴＩＮＩＮＨＵＭＡＮＬＵＮＧＡＤＥＮＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＣＥＬＬＬＩＮＥＡ５４９ＤＤＰＺｈａｎＭａｏｃｈｅｎｇ詹茂程ＬｉｕＸｕｙｉ刘叙仪ＣａｉＰｅｎｇ蔡鹏ＸｕＧｕａｎｇｗｅｉ徐光炜ＳｃｈｏｌｏｆＯ...     

顺铂诱导A549细胞凋亡的研究

目的 探讨顺铂诱导肺癌细胞凋亡的规律，机制以及在肿瘤化疗中的作用。方法 应用形态学观察，琼脂糖凝胶电泳，原位DNA断裂点的末端标记法和流式细胞仪分析技术，检测顺铂诱导A549细胞的凋亡作用。结果 3mg/L顺铂诱导的细胞凋亡在12-72h持续存在并逐渐增强，呈时间依赖性；顺铂浓度分别为1、3、5、7mg/L时均诱导了细胞凋亡，呈浓度依赖性，在顺铂作用下，细胞被阻滞于G1期。结论 诱导细胞凋亡可能是顺铂抗肿瘤作用的重要机制。     

重组人血管内皮抑素逆转人肺腺癌A549/DDP细胞耐药性研究

目的探讨重组人血管内皮抑素(rh-ES)对A549/DDP细胞耐药性的逆转作用.方法采用人肺腺癌细胞株A549及耐药细胞株A549/DDP作为研究对象,以顺铂(DDP)与重组人血管内皮抑素两者联合及单独给药的方式分别作用于人肺腺癌细胞株A549及耐药细胞株A549/DDP,作用时间72 h,观察不同给药方式造成的同株细胞之间耐药性的不同及不同株细胞间耐药性的差别,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测重组人血管内皮抑素对A549/DDP细胞耐药性的逆转作用.结果DDP对A549细胞半数抑制浓度(IC50)为(0.72±0.05)μg/ml,对A549/DDP的IC50为(11.54±0.64)μg/ml.rh-ES联合DDP对A549/DDP的IC50为(2.0±0.1)μg/ml.逆转倍数(RF)为5.77,相对逆转率(RRR)为88.2%.结论重组人血管内皮抑素能逆转A549/DDP对DDP的耐药性.     

耐顺铂人肺腺癌细胞系A549^DDP耐药机理进一步探讨

应用递增浓度的方法建立了一株顺铂（ＣＤＤＰ）耐药细胞系Ａ５４９ＤＤＰ。用溴化乙啶荧光分光光度法测定细胞内Ｐｔ－ＤＮＡ链间交联物（ＩＣＬ）；用无焰原子吸收光谱法测定细胞浆内及细胞核内铂含量；用流式细胞法及荧光显微镜测定铂的外排速度。结果显示：耐药细胞Ａ５４９ＤＤＰ较亲代敏感细胞Ａ５４９对ＣＤＤＰ耐受性增加８．９倍，与亲代敏感细胞Ａ５４９相比，Ａ５４９ＤＤＰ胞浆内及核内ＣＤＤＰ积聚分别为亲代细胞的１６．９％与２４．３％，铂含量与ＣＤＤＰ浓度正相关；Ａ５４９ＤＤＰ外排ＣＤＤＰ的功能较Ａ５４９明显增强，ＩＣＬ形成量低８４．１％，而修复功能增强２倍。结果提示：Ａ５４９ＤＤＰ细胞内ＣＤＤＰ积聚减少和修复功能增强是ＣＤＤＰ的主要耐药机理。     

奥美拉唑逆转人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP耐药性的研究

目的:探讨液泡ATPase[vacuolar (H+)-ATPase, V-ATPase]非特异性抑制剂奥美拉唑(omeprazole ,OME)逆转人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP的耐药性及可能的作用机制.方法:以非细胞毒性浓度4 μg/mL的OME预处理A549/DDP细胞24 h,再用2 μg/mL顺铂(cisplatin, DDP)处理 A549/DDP细胞.MTT法检测细胞的增殖抑制率,激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)法间接检测细胞内pH值的变化,FCM法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和PTEN的表达,RT-PCR法检测V-ATPase 、Bcl-2和PTEN mRNA的表达.结果:OME具有逆转A549/DDP细胞耐药性的作用,逆转倍数为1.45 (P<0.01);OME预处理后A549/DDP细胞内pH值明显降低,Bcl-2蛋白表达下降,PTEN蛋白表达增加(P<0.01).V-ATPase在亲本A549及A549/DDP细胞中相对表达量分别为0.88±0.00和0.99±0.00 (P<0.01);A549/DDP细胞中V-ATPase在有无OME预处理的情况下的相对表达量分别为1.09±0.00和1.05±0.02,差异无统计学意义.Bcl-2 mRNA相对表达量下降(P<0.01),PTEN mRNA相对表达量增加(P<0.01).结论:V-ATPase在A549/DDP细胞中高表达,OME能部分逆转A549/DDP耐药性,其作用机制可能与上调PTEN和下调Bcl-2 表达有关.     

顺铂诱导人肺腺癌A549细胞系多重抗药性的形成

目的建立人肺腺癌的多重抗药细胞系－Ａ５４９／ＤＤＰ。方法采用恒定药物浓度,周期性作用的体外诱导法、ＭＴＴ法、光镜、电镜、活细胞计数法和免疫组化法进行研究。结果Ａ５４９／ＤＤＰ对顺铂抗药,对卡铂和鬼臼乙叉甙产生交叉抗药。Ａ５４９／ＤＤＰ的细胞形态发生了改变,但其体外细胞群体生长倍增时间与Ａ５４９的无差异。Ａ５４９／ＤＤＰ细胞ｂｃ１－２基因表达较Ａ５４９的增强。结论Ａ５４９／ＤＤＰ是抗药性能稳定的多重抗药细胞系,ｂＣ１－２基因过度表达可能是其多重抗药的机理之一。     

吴茱萸碱逆转人肺癌细胞株Ａ５４９／ＤＤＰ耐药机理的实验研究

目的　观察吴茱萸碱逆转人肺腺癌耐药株Ａ５４９／ＤＤＰ细胞耐药性的效果并探讨其与阻断ＮＦ κＢ信号传导通路的相关性。方法　采用ＭＴＴ法检测单用吴茱萸碱、顺铂（ＤＤＰ）以及两药联用在不同时间对Ａ５４９／ＤＤＰ细胞的增殖影响,计算ＩＣ５０及耐药逆转倍数。流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。ＲＴ ＰＣＲ检测各组ＭＤＲ１、ＮＦ κＢ、Ｂｃｌ-２、ＭＭＰ-２和ＶＥＧＦ的ｍＲＮＡ表达。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测各组细胞的ｐＩκＢ-α、pＩＫＫα蛋白表达水平。结果　吴茱萸碱０.１２５ｍｇ／Ｌ、０.２５ｍｇ／Ｌ针对Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对ＤＤＰ的耐药逆转倍数分别为３.６６８和１1.４８。ＲＴ ＰＣＲ显示在吴茱萸碱作用下检测基因的ｍＲＮＡ表达随着吴茱萸碱浓度的增加和时间的延长其表达逐渐下降。当吴茱萸碱与ＤＤＰ联用时,可明显提高Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对化疗药的敏感性,凋亡细胞显著增加（Ｐ＜０.０５）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法结果提示Ａ５４９／ＤＤＰ细胞中ｐＩκＢ-α的表达水平随着吴茱萸碱作用时间的延长逐渐下降,ｐＩＫＫα表达则无显著变化。结论　吴茱萸碱可以通过抑制ＩκＢ-α的磷酸化阻断ＮＦ-κＢ信号通路,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖,增加耐药细胞对ＤＤＰ的敏感性。     

人参单体Rh2诱导人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡的体外研究

背景与目的肺癌已成为人类癌症主要死亡原因之一.从植物中开发抗肿瘤药物是国内外抗肿瘤新药开发的一个热点.本研究的目的是观察人参单体Rh2诱导人肺腺癌A549/DDP细胞系凋亡的作用,并探讨其可能的分子机制.方法体外培养的人肺腺癌A549/DDP细胞经不同浓度梯度的人参单体Rh2干预,分别应用MTT实验观察其对细胞增殖的影响,用流式细胞术检测细胞周期、凋亡指数及相关基因表达的改变,以及用双抗体夹心ELISA法测定细胞上清液sApo-1/Fas浓度变化.结果①人参单体Rh2可抑制A549/DDP细胞的生长,并呈剂量、时间依赖作用.②人参单体Rh2处理A549/DDP细胞24 h,实验组凋亡指数显著高于对照组(P＜0.001),G0/G1期细胞比例显著高于对照组(P＜0.01),S期细胞比例显著低于对照组(P＜0.01),G2/M期细胞比例与对照组比较无显著性差异(P＞0.05).③实验组p53、Fas阳性表达率显著高于对照组(P＜0.01,P＜0.001),Bcl-2阳性表达率显著低于对照组(P＜0.001).④实验组A549/DDP细胞培养上清液于不同时间sApo-1/Fas含量均显著低于对照组(P＜0.05).结论人参单体Rh2具有诱导人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡的作用,其分子机制可能是上调p53和Fas及下调Bcl-2的表达、通过Fas/FasL系统途径诱导细胞凋亡.     

人肺腺癌细胞株A549和A549/DDP的比较蛋白质组学研究

目的:比较人肺癌细胞株A549和顺铂(cisplatin,DDP)耐药细胞株A549/DDP中的蛋白表达差异.方法:DDP诱导A549细胞建立DDP耐药细胞株A549/DDP.应用蛋白质组学技术分离鉴定A549和A549/DDP细胞中差异表达的蛋白质,通过real-time PCR、蛋白质印迹法和免疫细胞化学法对部分差异蛋白进行验证;应用生物学信息检索分析差异蛋白的功能.结果:A549和A549/DDP细胞中有8个蛋白质点的表达差异＞5倍,分别为POTE、FH (fumarate hydratase)、PDE (phosphodiesterase)、AKR1C1 (aldo-keto reductase family 1,member C1)、DDH2 (dihydrodiol dehydrogenase 2)、S100A10、prefoldin subunit 2和核内转运蛋白,这些蛋白与细胞代谢、凋亡、增殖、解毒和信号转导等有关.Real-time PCR、蛋白质印迹法和免疫细胞化学法验证结果与蛋白质组学研究结果一致.结论:鉴定得到的A549和A549/DDP细胞中的差异蛋白为研究肺癌细胞DDP耐药提供新依据.     

全反式维甲酸对人肺癌细胞诱导凋亡的作用

目的:研究全反式维甲酸(ATRA)对肺癌细胞生长的影响及其凋亡作用.方法:应用MTT法检测ATRA对体外培养人肺癌细胞株细胞A549的抑制率,光镜及透射电镜、流式细胞仪等检测ATRA对A549细胞诱导凋亡的作用.结果: 不同浓度的ATRA对A549细胞的增殖均有抑制作用,且量效关系明显.但大剂量主要导致细胞死亡,以10-5mol*L-1的ATRA作用效果最好,经10-5mol*L-1 ATRA作用7d后,A549细胞增殖抑制率达到60%.光镜及透射电镜下可见细胞恶性表型向正常表型发生逆转,并可观察到凋亡小体.流式细胞仪分析结果显示,ATRA处理组细胞周期延迟,G1期比例明显升高,S、G2期比例下降.结论:ATRA可抑制肺癌细胞的增殖,并诱导癌细胞凋亡.     

透明质酸寡糖调节A549/DDP多药耐药作用的研究

目的:通过研究透明质酸寡糖对人肺腺癌细胞系A549/DDP的P糖蛋白和多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药蛋白(LRP)表达的影响,探讨透明质酸在引起肿瘤细胞多药耐药中的作用.方法: 将CD44单抗或透明质酸寡糖与A549/DDP细胞共培养48小时,放免法检测培养基中细胞所分泌透明质酸的含量,流式细胞仪检测经上述处理的A549/DDP表面MDR1 、MRP、LRP的表达率,MTT法检测在不同浓度顺铂作用下,各组细胞的存活率.结果: 经透明质酸寡糖处理后A549/DDP,分泌透明质酸较未处理组明显减少(P<0.05);且细胞表面与多药耐药相关的MDR1 、MRP、LRP的表达率均降低(P<0.05).另外,处理后的细胞,在不同浓度顺铂作用时,细胞凋亡率明显增加.结论: 体外条件下,透明质酸寡糖能逆转A549/DDP的耐药.     

DNA损伤修复与肺癌顺铂耐药机制的研究进展

肺癌是目前世界上致死率最高的恶性肿瘤,化疗是治疗的主要手段之一,肺癌的化疗是以铂类为基础的联合化疗,其中,顺铂是有效并广泛应用的一线药物,但是由于耐药问题的存在使其疗效不尽如人意。顺铂是一种细胞周期非特异性细胞毒药物,其主要作用靶点是DNA,因此DNA损伤修复功能的异常是顺铂耐药的主要机制之一。本文主要综述了与肺癌顺铂耐药相关的DNA损伤修复异常,包括核苷酸切除修复异常、碱基错配修复异常、DNA双链断裂损伤修复异常及跨损伤修复。     

人肺腺癌A549/DDP耐药细胞减弱顺铂诱导的细胞凋亡

目的：探讨人肺腺癌Ａ５４９／ＤＤＰ耐药细胞的多药抗药机理。方法;应用形态学观察、琼脂糖凝胶电泳、原位ＤＮＡ断裂点的末端标记法观察细胞亡的状况,用免疫组化法检测ｂｃｌ－２基因的表达。结果：癌细胞在顺铂作用下产生了典型的凋亡形态学改革。３μｇ／ｍｌ,５μｇ／ｍｌ,７μｇ／ｍｌ顺铂作用４８小时,Ａ５４９细胞ＤＮＡ裂解片断呈现典型的阶梯状排列条喧,而在５μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ顺铂作用４８小时,Ａ５４９／     

PTEN及mTOR在人肺腺癌培美曲塞耐药株A549/PEM中的表达

目的:应用高浓度反复间歇法建立人肺腺癌A549培美曲塞耐药细胞株A549/PEM,探讨PTEN、mTOR在人肺腺癌亲本株A549及培美曲塞诱导人肺腺癌耐药株A549/PEM中的表达变化.方法:采用终浓度为500ng/ml的培美曲塞反复间歇冲击建立人肺腺癌A549培美曲塞耐药细胞株A549/PEM,MTT法检测细胞耐药性.RT-PCR、Western blot分别检测PTEN、mTOR在A549及A549/PEM细胞的mRNA及蛋白表达变化.结果:A549/PEM耐药指数为26.87±1.81,较亲本株A549升高约27倍.RT-PCR检测mRNA表达示A549/PEM的PTEN及mTOR基因表达与A549相比均表达上调(P=0.023;P ＜0.01);Western blot检测蛋白表达示A549/PEM的PTEN及mTOR蛋白表达与A549相比均表达上调(P＜0.01;P =0.04).结论:高浓度反复间歇法可成功建立人肺腺癌A549培美曲塞耐药细胞株模型;PTEN、mTOR表达变化可能与培美曲塞获得性耐药相关.     

线粒体靶向MPG基因重组体对人非小细胞肺癌多药耐药细胞A549/DDP增殖的抑制作用

背景与目的：多药耐药是影响肺癌化疗效果的重要因素。本研究拟构建线粒体靶向人N-甲基化嘌呤DNA糖基化酶（MPG）基因真核表达载体,观察其在稳定转染的人非小细胞肺癌多药耐药细胞线粒体内的表达情况,并研究其对多药耐药细胞增殖的抑制作用。方法：应用重叠延伸剪接技术重组锰超氧化物歧化酶（MnSOD）线粒体靶向序列-MPG融合基因（mito—MPG）;构建pCMV—Script／mito MPG重组真核表达载体：脂质体将其转染至人非小细胞肺癌多药耐药细胞A549／DDP;G418筛选稳定表达的转染细胞：RT—PCR检测mito—MPG基因mRNA的表达水平;分离线粒体蛋白后应用Western blot检测MPG在线粒体内的表达水平：台盼蓝拒染法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期分布。结果：构建的融合基因经过DNA测序分析;构建的重组载体经限制性酶切分析及DNA测序分析证实为pCMV-Script／mito-MPG重组真核表达载体：转染pCMV-Script／mito—MPG载体组（MPG组）检测到mito—MPG mRNA的表达。转染pCMV—Script载体组（P组）及未转染组（C组）细胞内则未检测到;MPG组细胞线粒体内检测到MPG,P组及C组则未检测到;MPG组细胞增殖能力明显下降,P组及C组细胞增殖能力无明显差异．倍增时间分别为72．6h（C组）、73．5h（P组）、98．9h（MPG组）;分裂增殖指数分别为51.3％（C组）、54_3％（P组）、26．1％（MPG组）,MPG组出现亚二倍体峰。结论：成功构建了线粒体靶向人MPG基因表达载体。MPG在MnSOD线粒体靶向序列的引导下．顺利地进入了A549／DDP细胞线粒体内,并导致其增殖能力下降．部分细胞死亡。     

番荔枝内酯单体squamocin诱导人肺腺癌A549细胞凋亡的实验研究

目的 观察番荔枝内酯单体squamocin对人肺腺癌A549细胞的体外增殖抑制及诱导凋亡的作用,并探讨squamocin诱导肿瘤细胞凋亡的机制。方法 MTT法检测不同浓度的squamocin对人肺腺癌A549细胞体外增殖的影响;流式细胞仪检测squamocin干预在不同时间点对人肺腺癌A549细胞凋亡率的影响;Western blotting检测squamocin干预前后细胞凋亡相关蛋白caspase-3、Bax和Bcl-2的表达情况。结果 MTT法显示,squamocin对人肺腺癌A549细胞的体外抑制作用随着squamocin浓度的增加和作用时间的延长而增强,24、48、72h半数抑制浓度（IC50）分别为16.54、9.28、6.17μg／ml;流式细胞仪检测显示,在24、48、72h实验组人肺腺癌A549细胞凋亡率之间及其与阴性对照组比较,差异均有统计学意义（P＜0.01）,其中实验组72h的细胞凋亡率最高,为（51.87±1.79）％Western blotting显示,squamocin干预后细胞凋亡相关蛋白caspase-3和Bax表达上调,Bcl-2表达明显下调。结论 squamocin可诱导人肺腺癌A549细胞凋亡,这可能与squamocin上调细胞凋亡相关蛋白caspase-3、Bax表达以及降低抑制细胞凋亡基因Bcl-2表达有关。     

The role of DNA repair pathways in cisplatin resistant lung cancer

Platinum chemotherapeutic agents such as cisplatin are currently used in the treatment of various malignancies such as lung cancer. However, their efficacy is significantly hindered by the development of resistance during treatment. While a number of factors have been reported that contribute to the onset of this resistance phenotype, alterations in the DNA repair capacity of damaged cells is now recognised as an important factor in mediating this phenomenon. The mode of action of cisplatin has been linked to its ability to crosslink purine bases on the DNA, thereby interfering with DNA repair mechanisms and inducing DNA damage. Following DNA damage, cells respond by activating a DNA-damage response that either leads to repair of the lesion by the cell thereby promoting resistance to the drug, or cell death via activation of the apoptotic response. Therefore, DNA repair is a vital target to improving cancer therapy and reduce the resistance of tumour cells to DNA damaging agents currently used in the treatment of cancer patients. To date, despite the numerous findings that differential expression of components of the various DNA repair pathways correlate with response to cisplatin, translation of such findings in the clinical setting are still warranted. The identification of alterations in specific proteins and pathways that contribute to these unique DNA repair pathways in cisplatin resistant cancer cells may potentially lead to a renewed interest in the development of rational novel therapies for cisplatin resistant cancers, in particular, lung cancer.     

survivin反义寡核苷酸提高人肺腺癌A549耐药细胞系对顺铂敏感性的研究

目的探讨存活素反义寡核苷酸(ASODN)体外转染对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/ CDDP凋亡及其对顺铂(CDDP)敏感性的影响。方法常规体外培养A549/CDDP细胞,以脂质体包裹的survivin ASODN转染细胞,采用RT-PCR法和免疫细胞化学法检测survivin mRNA及蛋白表达。通过形态学观察、DNA琼脂糖凝胶电泳、caspase-3酶活性及细胞凋亡率(AI)的测定,评价细胞凋亡程度。采用MTT法测定细胞存活率和生长抑制率,计算半效抑制浓度(IC_(50))及耐药倍数(RI)。结果转染组survivin mRNA及蛋白表达下调明显,分别达41．56%和0．864±0．045,与其他各组比较,差异均有统计学意义(P＜0．05)。细胞形态学显示有细胞凋亡改变,表现为细胞核固缩、核边集和核碎裂等;DNA凝胶电泳可见DNA梯形条带;ASODN转染组细胞凋亡率和caspase-3相对活性分别增高至34．03%和1．1298±0．2502,而ASODN+CDDP组增高更为明显,分别达65．85%和1．6805±0．2758,与其他各组比较,差异均有统计学意义(P＜0．05)。ASODN转染组和ASODN+CDDP组生长抑制率分别增高至59．3%和83．7%(P＜0．05);而ASODN转染组细胞对CDDP的IC_(50)由对照组的(225．03±10．59)μmol/L减低至(158．84±4．26)μmol/L,RI由11．9减至8．4。结论survivin ASODN通过下调survivin的表达,自身诱导了细胞凋亡,并逆转细胞对CDDP诱导的细胞凋亡的耐受,降低凋亡阈值,从而增强了人肺腺癌细胞对CDDP的敏感性。     

Rb94对人肺腺癌细胞系A549放射增敏作用的实验研究

目的 构建人视网膜母细胞瘤基因(Rb94)真核表达载体,观察其对人肺腺癌细胞系A549的放射增敏作用并探讨其机制.方法 构建重组表达质粒pIPES-Rb94,经脂质体转染A549细胞、G418筛选获得稳定转染的细胞系.细胞计数法绘制生长曲线、计算细胞倍增时间;实时RT-PCR检测hTERT、Bcl-2mRNA的表达;成克隆实验检测pIRES-Rb94对A549细胞放射敏感性影响,计算放射增敏比(SER);流式细胞仪分析细胞周期.结果 成功构建pIRES-Rb94质粒,转染A549细胞后获得稳定转染细胞系pIRES-Rb94-A549.与A549细胞相比,pIRES-Rb94-A549细胞倍增时间延长(31.5h:39.5 h;t=5.15,P<0.01);hTERT、Bcl-2 mRNA表达下降(0.02:1.00;t=18.99,P<0.01;0.01:1.00;t=13.73,P<0.01);G2+M期细胞增加(35.91%:4.53%;t=36.78,P=0.00),G0+G1期和S期细胞减少(47.02%:74.07%;t=11.71,P=0.00和17.07%:22.32%;t=2.30,P<0.05);由D0值计算的SER为1.30.结论 Rb94对A549细胞具有明显放射增敏作用,其机制可能是G2+M期阻滞作用以及下调hTERT、Bcl-2 mRNA表达,并可能通过调节细胞周期来影响细胞增殖.