PTEN编码蛋白对TGF-β1刺激大鼠肾成纤维细胞增殖和ColⅣ与FN分泌的抑制作用

目的：观察张力蛋白同源物基因（PTEN）编码蛋白对转化生长因子-β1（TGF-β1）刺激所致大鼠肾成纤维细胞增殖和Ⅳ型胶原（ColⅣ）、纤连蛋白（FN）分泌的影响。方法：用重组PTEN腺病毒转染体外培养大鼠肾成纤维细胞,倒置荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达,RT-PCR检测PTEN mRNA表达。转染36h后TGF-β1体外刺激,TGF-β1刺激24h后MTT法检测细胞增殖活力,免疫细胞化学法检测PCNA表达,ELISA法检测细胞上清中ColⅣ、FN水平。结果：PTEN腺病毒转染36h后可见明显绿色荧光蛋白表达,PTEN mRNA表达明显增多（P〈0.01）。PTEN腺病毒转染后给予TGF-β1刺激组较单纯TGF-β1刺激组平均光密度值（OD）显著降低（P〈0.01）,PCNA表达显著减少（P〈0.01）,且ColⅣ、FN的分泌水平明显下降（P〈0.05）。结论：PTEN基因编码蛋白能抑制TGF-β1刺激所致大鼠肾成纤维细胞增殖、PCNA表达及ColⅣ、FN分泌,可能具有抑制残肾纤维化、延缓残肾毁损速度的作用。     

血管内皮生长因子抑制肾小管上皮间充质转化及其与结缔组织生长因子和PI3K-Akt信号通路的关系

目的　探讨血管内皮生长因子（VEGF）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的肾小管上皮间充质转化（EMT）的作用,及其与结缔组织生长因子（CTGF）、PI3K-Akt信号通路的关系。 方法 （1）将体外培养的HK2细胞分为正常对照组、TGF-β1（5 μg/L,下同）组、VEGF组（100 μg/L,下同）、TGF-β1＋VEGF组。HK2细胞体外培养48 h,用免疫组化双染方法检测肾小管上皮细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和E钙黏蛋白的表达。（2）将体外培养的HK2细胞分为正常对照组、TGF-β1组、VEGF组、TGF-β1＋VEGF组、PI3K-Akt信号通路阻断剂LY294002组（25 μmol/L,下同）、TGF-β1＋LY294002组、VEGF＋LY294002组、TGF-β1＋VEGF＋LY294002组。HK2细胞体外培养48 h,用Western印迹和RT-PCR方法检测α-SMA和CTGF的表达;用ELISA方法检测培养上清中纤连蛋白（FN）和I型胶原（ColⅠ）的表达。 结果 免疫组化结果显示,TGF-β1组α-SMA表达比正常对照组增强,而E钙黏蛋白表达减弱; TGF-β1＋VEGF组α-SMA表达比TGF-β1组显著减弱,而E钙黏蛋白表达增强。 TGF-β1组α-SMA、CTGF蛋白和 mRNA及FN、ColⅠ表达比正常对照组显著增强（均P < 0.05）;TGF-β1＋VEGF组α-SMA、CTGF蛋白和mRNA及FN、ColⅠ表达比TGF-β1组显著减弱（均P < 0.05）;TGF-β1＋VEGF＋LY294002组α-SMA、CTGF蛋白和 mRNA及FN、ColⅠ表达比TGF-β1＋VEGF组显著增强（均P < 0.05）。 结论　VEGF能抑制TGF-β1诱导的体外培养的HK2细胞发生EMT,其机制可能与VEGF下调HK2细胞CTGF表达及减少细胞外FN、ColⅠ合成有关。VEGF的这种作用可能部分通过PI3K-Akt信号转导通路实现,其确切机制有待进一步研究。     

转化生长因子β1在大鼠腹膜间皮细胞中的促炎作用

目的 探讨转化生长因子β1（TGF-β1）在大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）中的促炎作用及机制。 方法 用TGF-β1（10 μg/L）刺激体外培养的RPMC,观察其对RPMC中单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）表达的影响。体外转染Smad7和pcDNA3空载体至RPMC后,观察 TGF-β1（10 μg/L）对RPMC MCP-1和p38表达的影响。用p38抑制剂SB203580（10 μmol/L）预处理RPMC后,加入TGF-β1（10 μg/L）,观察阻断p38信号通路对MCP-1表达的影响。 结果RT-PCR结果显示,3 h、6 h、12 h、24 h TGF-β1刺激组腹膜间皮细胞MCP-1表达均显著高于0 h对照组（P < 0.05）,6 h刺激组MCP-1表达达高峰（P < 0.01）。ELISA结果显示,6 h、12 h、24 h、48 h TGF-β1刺激组MCP-1表达增多（P < 0.05）,48 h表达达高峰（P < 0.01）。上调表达Smad7和p38抑制剂SB203580都能明显抑制TGF-β1刺激RPMC产生和分泌MCP-1的作用,与pcDNA3空载体组比较,Smad7治疗组MCP-1的表达显著下调（P < 0.05）;与TGF-β1刺激组比较,SB203580治疗组MCP-1的表达显著下调（P < 0.01）。TGF-β1能活化p38磷酸化的过程,上调Smad7可抑制TGF-β1对它们的激活反应;与正常对照组比较,TGF-β1刺激组磷酸化（p）-p38的表达显著上调（P < 0.05）;与TGF-β1刺激组比较,Smad7治疗组p-p38的表达显著下调（P < 0.05）。 结论 TGF-β1能促进RPMC MCP-1的表达,其促炎作用可能是通过激活p38MAPK信号通路介导的。     

醛固酮通过Smad2依赖的转化生长因子-β1途径刺激大鼠系膜细胞纤连蛋白合成

目的探讨醛固酮是否能够诱导纤连蛋白(FN)的合成,及可能的信号通路是否通过其核受体由Smad2依赖的TGF-β1途径介导。方法大鼠系膜细胞体外培养。Smad2的反义质粒由Smad2MH2功能区片段与表达绿色荧光蛋白的pEGF-C1真核质粒构建而成,运用脂质体的方法转染系膜细胞,由荧光显微镜观察细胞是否转染成功。分别用醛固酮(10-7mol/L)伴或不伴安体舒通(10-9mol/L)刺激系膜细胞,48h后收集培养上清液和各组细胞蛋白。FN、TGF-β1和Smad2的表达分别用ELISA和Western印迹的方法检测。结果醛固酮可以刺激大鼠系膜细胞TGF-β1表达升高[(134.2±13.9)%比对照组100%,P<0.05],FN合成增加[(74.2+15.0)比对照组(12.6+1.8)ng/ml,P<0.01]。先用安体舒通干预3h再加用醛固酮,则TGF-β1及FN的水平无显著变化。转染了Smad2的反义质村,醛固酮对FN的合成无显著影响,培养液中FN的浓度明显低于醛固酮刺激的未转染质粒组[(36.1±19.8)比未转染质粒组(72.3+16.6)ng/ml,P<0.05]。转染Smad2反义质粒的系膜细胞,其Smad2蛋白表达明显低于基础值[(69.1±8.6)%比基础值100%,P<0.01];而空载体pEGF-C1并不影响Smad2的表达。结论醛固酮通过核受体由Smad2依赖的TGF-β1途径诱导大鼠系膜细胞FN合成。该实验结果为临床上于预慢性肾脏病进展开辟了新的     

雷帕霉素抑制结缔组织生长因子诱导的成肌纤维细胞增殖及细胞外基质蛋白的分泌

目的 探讨雷帕霉素（RAPA）对于结缔组织生长因子（CTGF）生物学作用的影响及可能机制。 方法 分别用RAPA 20 μg/L 和40 μg/L预处理成肌纤维细胞（MyoF）30 min后再加入CTGF 100 μg/L,与单独加入CTGF（CTGF组）和未加任何刺激的MyoF（对照组）进行比较。采用BrdU掺入法检测细胞的增殖反应;用Western印迹法检测细胞上清中纤连蛋白（FN）的水平及细胞ERK1/2信号的磷酸化。 结果 与对照组相比,CTGF（100 μg/L）显著促进MyoF增殖（P < 0.01）,增加上清中FN的蛋白水平（P < 0.05）。与CTGF组相比,RAPA 20 μg/L及 40 μg/L 预处理可使细胞增殖率显著下降,分别下降了62% 和70%（均P < 0.05）,但两个剂量之间差异无统计学意义;使细胞上清中FN的蛋白水平分别下降了15%和44%,后者与CTGF组的差异有统计学意义（P < 0.05）。CTGF（100 μg/L ）刺激10 min可致MyoF的ERK1/2发生磷酸化,RAPA 40 μg/L预处理细胞30 min可显著降低CTGF诱导的ERK1/2磷酸化。以ERK1/2活化特异抑制剂PD98059（50 μmol/L）预处理30 min后,可以抑制CTGF诱导的细胞增殖效应（7%±5%比85%±7%,P < 0.01）和FN的分泌效应（1.0±0.1比1.6±0.3,P < 0.05）。 结论 RAPA具有部分抑制CTGF的促增殖和促细胞外基质分泌的作用,其作用可能通过抑制ERK1/2信号通路实现。     

RhoA-Rock信号通路在转化生长因子β1诱导大鼠腹膜间皮细胞转分化中的作用

目的　探讨RhoA-Rock信号通路在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）转分化中的作用。 方法　体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞,静止24 h后,采用随机数字表法随机分为以下4组：正常对照组、TGF-β1（10 μg/L）刺激组、TGF-β1（10 μg/L）＋Y-27632（Rock特异性抑制剂,10 μmol/L）组（Y-27632预处理2 h）、Y-27632（10 μmol/L）组。用TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC不同时间,观察α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,E钙黏素（E-cadherin）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）的表达。RT-PCR法检测E-cadherin、α-SMA 和ColⅠmRNA表达。Western印迹法检测RhoA（包括总RhoA及活化的RhoA）、E-cadherin、α-SMA、ColⅠ和波形蛋白（vimentin）表达。活化的RhoA由膜蛋白提取试剂盒提取。 结果 （1）TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC能诱导RhoA活化,于10 min开始出现活性升高,为对照组的（2.57±0.52）倍（P < 0.05）;1 h达高峰,为对照组的（4.35±0.41）倍（P < 0.05）。（2）TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC能导致E-cadherin mRNA和蛋白表达下调,α-SMA、ColⅠmRNA和蛋白表达上调,呈时间依赖性。（3）Rock特异性抑制剂Y-27632能显著下调α-SMA、ColⅠmRNA的表达,较TGF-β1刺激组各降低了53.8%和55.7%（均P < 0.05）,并且能下调α-SMA、ColⅠ和vimentin蛋白的表达,较TGF-β1刺激组分别降低了42.6%、60.1%和58.1%（均P < 0.05）,但不能上调E-cadherin mRNA和蛋白的表达。 结论　TGF-β1可通过RhoA-Rock信号通路介导大鼠腹膜间皮细胞转分化,抑制该通路可作为防治腹膜纤维化的潜在靶点。     

PRS-CTGF-siRNA对TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞细胞外基质及VEGF表达的影响

目的 观察pRetro-Super(PRS)反转录病毒载体介导的表达人结缔组织生长因子(CTGF)小分子干扰RNA(siRNA)对体外培养的人腹膜间皮细胞(HPMC) 细胞外基质和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。 方法 根据siRNA靶序列要求及PRS反转录病毒载体特点分别设计4 对寡核苷酸，构建表达人CTGF基因siRNA 的PRS-CTGF-siRNA1～4重组反转录病毒载体。以脂质体2000将重组反转录病毒载体转染PT67包装细胞，继而感染HPMC。采用RT-PCR法检测mRNA表达及Western印迹法检测蛋白质表达。 结果 5 μg/L外源性转化生长因子β1（TGF-β1）刺激可诱导HPMC表达CTGF、纤连蛋白（FN）、I型胶原（Col I）、层粘连蛋白（LN）和VEGF明显增高； 而PRS-CTGF-siRNA 1～4组与TGF-β1刺激组比较，HPMC细胞内CTGF、FN、Col I、LN mRNA和蛋白表达和VEGF mRNA表达明显较低（P < 0.01），各干扰组对CTGF mRNA抑制率分别为 69.3％、22.2%、27.4%和38.8%，其中以PRS-CTGF-siRNA 1组最为明显；同时PRS-CTGF-siRNA 1组相对于TGF-β1刺激组，VEGF蛋白表达也明显较低（P < 0.01）；而PRS空载体组与TGF-β1刺激组比较，差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。 结论 PRS-CTGF-siRNA重组反转录病毒载体可明显抑制TGF-β1诱导的细胞外基质及VEGF表达的增加。     

白细胞介素1β通过植物血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1途径促进人肾小球系膜细胞摄取氧化低密度脂蛋白

目的 研究白细胞介素（IL）1β是否促进人肾小球系膜细胞（HMC）摄取氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）以及对其植物血凝素样受体（LOX-1）表达的作用,探讨IL-1β影响脂质摄取的可能作用途径。 方法 脂质化学染色、流式细胞计数观察IL-1β对HMC脂质摄取的影响,分析LOX-1受体的功能及IL-1β影响脂质摄取的可能作用途径。实时定量 PCR和Western印迹方法检测IL-1β对LOX-1表达的影响。 结果 油红“O”染色发现IL-1β增强HMC对Ox-LDL的摄取;流式细胞仪计数发现IL-1β呈剂量和时间依赖性促进HMC摄取荧光Dil标记的Ox-LDL（Dil-Ox-LDL）,抗LOX-1抗体部分阻断IL-1β诱导的HMC 对Ox-LDL的摄取,约为单纯IL-1β组的89.8%（P < 0.05）。5 μg/L IL-1β刺激HMC,LOX-1 mRNA于6 h达高峰,为对照的6.87倍,IL-1β剂量依赖性促进LOX-1 mRNA的表达,当刺激HMC 12 h,LOX-1 mRNA于10 μg/L组达高峰,为对照的6.57倍。IL-1β剂量和时间依赖性促进LOX-1蛋白的表达。5 μg/L IL-1β刺激HMC,LOX-1蛋白表达于24 h达高峰,为对照的1.88倍。10 μg/L 组刺激细胞24 h达高峰,LOX-1蛋白为对照的2.57倍。 结论 HMC基础状态下摄取Ox-LDL,IL-1β可能通过LOX-1途径增强对Ox-LDL摄取,促进细胞内脂质的摄取,加重细胞内脂质失调。     

褐藻多糖硫酸酯对转化生长因子-β_1孵育下人肾小球系膜细胞FN分泌的影响

目的:观察褐藻多糖硫酸酯(fucoidan,FPS)对转化生长因子-β_1(TGF-β_1)刺激下人肾小球系膜细胞(human mesangial cell,HMC)纤连蛋白(fibronectin,FN)分泌的影响,探讨其在慢性肾衰竭(chronic renal failure,CRF)防治中的意义。方法:体外培养HMC并鉴定,不同浓度的FPS分别孵育TGF-β_1作用下HMC 24 h、48 h、72 h,具体分组如下:模型组(TGF-β_14 ng/ml)、FPS高剂量组(TGF-β_14 ng/ml+FPS 100μg/ml)、FPS中剂量组(TGF-β_14 ng/ml+FPS 50μg/ml)、FPS低剂量组(TGF-β_14 ng/ml+FPS 25μg/ml)、正常对照组。Western-blot技术检测HMC FN蛋白表达,Real-time PCR技术检测HMC FN mRNA表达。结果:与正常对照组相比,TGF-β_1能明显诱导人肾小球系膜细胞FN蛋白及mRNA表达(P0.01);与模型组相比,FPS对TGF-β_1引起的HMG FN蛋白及mRNA高表达有明显拮抗作用,并与剂量有关(P0.05)。结论:FPS能拮抗TGF-β_1诱导的HMG FN蛋白及mRNA表达增加,减少病理状态下细胞外基质(extracelluar matrix,ECM)的产生,这可能是其防治CRF的作用机制。     

丝裂素活化蛋白激酶信号通路在人腹膜纤维化的作用

目的 探讨丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路对转化生长因子(TGF)β1致人腹膜间皮细胞(HPMC)高表达纤连蛋白(FN)、纤溶酶原激活物抑制物(PAI)1的调控作用。方法 采用胰蛋白酶消化法从人腹膜组织中分离间皮细胞,建立稳定的体外培养模型。用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)评估TGF-β1和细胞外信号调节激素(ERK)及p38阻断剂对HPMC的增殖作用。采用酶联免疫双抗夹心法检测HPMC培养液中FN、PAI-1的蛋白质水平。采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测HPMC细胞内FN、PAI-1mRNA的表达。结果 (1)TGF-β1能刺激HPMC增殖(P<0.05),且呈剂量时间依赖性,加ERK阻断剂组或p38阻断剂组较TGF-β1组有明显抑制作用(P<0.01)。(2)TGF-β1能引起HPMC FN、PAI-1蛋白水平显著增高(P<0.01);加ERK阻断剂组或p38阻断剂组能使上述高表达受到抑制(P<0.01)。(3)TGF-β1能使HPMC FN、PAI-1mRNA表达上调,加ERK阻断剂组或p38阻断剂组能使上调水平受到抑制。结论 MAPK对TGF-β1致人腹膜间皮细胞高表达FN和PAI-1起调控作用,为临床防治腹膜纤维化提供新的思路。     

苦参素对人肾小球系膜细胞磷酸化信号传导和转录激活因子3及其蛋白抑制剂表达的影响

目的 观察苦参素对脂多糖（LPS）诱导下人肾小球系膜细胞（HMC）增殖时磷酸化信号传导和转录激活因子3（p-STAT3）、活化的信号传导和转录激活因子3蛋白抑制剂（PIAS3）蛋白和mRNA表达的影响,并探讨其相互关系。 方法 体外培养HMC,并分为对照组、LPS模型组及苦参素干预组。培养12、24、48 h时以MTT法检测HMC的增殖情况;ELISA法检测细胞上清Ⅳ型胶原蛋白（ColⅣ）含量;同时收集同时间点细胞,采用Western印迹法检测p-STAT3和PIAS3的蛋白表达;实时荧光定量PCR法检测STAT3和PIAS3的mRNA表达。 结果 LPS组细胞增殖较对照组显著加快（P < 0.01）,ColⅣ的表达显著高于对照组 （P < 0.01）。苦参素干预后细胞增殖和ColⅣ的表达显著低于模型组（P < 0.01）。LPS诱导 12 h时细胞p-STAT3表达开始上调,各时间点p-STAT3表达量显著高于对照组（P < 0.01）。苦参素干预后,与同时间点LPS模型组相比显著下调（P < 0.01）。LPS诱导下PIAS3各时间点表达量显著下调（P < 0.01）。苦参素干预后,与同时间点LPS模型组相比均显著上调（P < 0.01）。 结论 苦参素对LPS诱导HMC增殖过程中p-STAT3蛋白及mRNA表达有下调作用,对PIAS3有上调作用。苦参素可能影响HMC增殖过程中JAK-STAT信号传导通路。     

己酮可可碱对高糖诱导肾小球系膜细胞结缔组织生长因子表达信号通路的影响

目的 探讨高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞结缔组织生长因子（CTGF）表达的变化及其作用通路,并且研究己酮可可碱（PTX）对CTGF表达的影响。 方法 体外培养大鼠系膜细胞,观察不同浓度的高糖在不同时间对系膜细胞转化生长因子β（TGF-β）、CTGF、 p-Smad2/3、Smad7及纤连蛋白（FN）表达的影响;并在高糖培养液中加入TGF-β中和抗体及不同浓度的PTX观察其对上述各指标表达的影响。 结果 高糖可以诱导系膜细胞TGF-β、CTGF mRNA及蛋白表达增加（均P < 0.05）,且呈时间、剂量依赖性,同时伴有p-Smad2/3蛋白表达的增加及Smad7蛋白表达的减少。阻断TGF-β可使高糖诱导的CTGF mRNA及蛋白表达分别下降86.4%及91.8%（均P < 0.05）。PTX可以抑制高糖诱导的系膜细胞CTGF mRNA及蛋白表达,随着PTX浓度的增加其抑制作用更为显著（P < 0.05）,但对于TGF-β的表达没有影响。结论 高糖可通过TGF-β-Smads通路使CTGF mRNA表达增加进而影响其蛋白表达。PTX可以有效的抑制CTGF的表达而对于TGF-β的表达没有直接的抑制作用。     

megsin基因转染对高糖环境中系膜细胞胞外调节蛋白激酶表达的影响

目的 观察megsin基因转染对高糖环境中小鼠肾小球系膜细胞血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）、磷酸化胞外调节蛋白激酶1/2（pERK1/2）、转化生长因子β1（TGF-β1）的表达及Ⅳ型胶原水平的影响;探讨megsin基因对细胞外信号调节激酶（ERK）通路的作用。 方法 将小鼠肾小球系膜细胞分为7组：低糖组（A组,5.5 mmol/L）、高糖组（B组,30 mmol/L）、高糖+空质粒组（C组）、高糖+megsin质粒组（D组）、高糖+megsin质粒+ERK通路抑制剂组（E组）、高糖+ megsin siRNA组（F组）和低糖+甘露醇组（24.5 mmol/L甘露醇,G组）。分别在培养12、24、48 h后,采用Western印迹法测定各组系膜细胞megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表达,放射免疫测定法（RIA）测定各组细胞上清液中Ⅳ型胶原浓度。 结果 与A组相比,高糖刺激可上调系膜细胞megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表达及上清液Ⅳ型胶原的水平（均P ＜ 0.05）,且有一定的时间依赖性。转染megsin基因可进一步上调高糖环境下系膜细胞PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1、Ⅳ型胶原的表达（均P ＜ 0.05）。应用ERK通路抑制剂后,与D组相比系膜细胞megsin 和PDGF-BB的表达无明显变化（均P ＞ 0.05）,而pERK1/2、TGF-β1及Ⅳ型胶原的表达则明显降低（均P ＜ 0.05）。转染megsin siRNA对系膜细胞megsin基因进行干扰后,系膜细胞PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表达及Ⅳ型胶原的含量较B组下调（均P ＜ 0.05）。 结论 高糖环境下,转染megsin基因可使小鼠系膜细胞megsin、PDGF-BB表达增高,其可能部分通过ERK通路使TGF-β1表达上调及Ⅳ型胶原合成与分泌增加。megsin siRNA干扰可使上述指标下调,megsin基因可能在糖尿病肾病发病中起重要作用。     

整合素连锁激酶介导转化生长因子β1上调肾小管上皮细胞表达纤连蛋白的研究

目的 研究转化生长因子β1（TGF-β1）诱导肾小管上皮细胞合成纤连蛋白（FN）与整合素连锁激酶（ILK）表达的关系.方法 培养人肾小管上皮细胞（HKC）,用蛋白印迹方法检测TGF-β1诱导HKC合成FN和表达ILK的作用.通过基因转染的方法,将含人野生型ILK基因的表达质粒pCMV-wtILK和无激酶活力的人ILK基因表达质粒pCMV-kdILK转染HKC细胞,观察ILK过度表达和抑制ILK活力对TGF-β1诱导的HKC合成FN的影响.结果 TGF-β1能够刺激HKC合成FN,其作用呈剂量依赖性.TGF-β1刺激8 h即可上调HKC细胞ILK的表达,与TGF-β1所致的FN合成的增加相一致.转染pCMV-wtILK质粒的HKC细胞,其FN的表达呈增加趋势.转染pCMV-kdILK抑制ILK的活力能够显著拮抗TGF-β1刺激HKC表达FN的作用.结论 TGF-β1刺激肾小管上皮细胞FN合成与其所致的ILK表达密切相关.抑制ILK的活力能够拮抗TGF-β1导致的FN合成.     

虫草多糖对转化生长因子β1诱导人近端肾小管上皮细胞间充质转分化的影响

目的 探讨虫草多糖（Cp）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导人近端肾小管上皮细胞间充质转分化的影响。 方法 用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测不同浓度的Cp(0、0.01、0.1、1、5、10 g/L)对人近端肾小管上皮细胞(HK-2) 增殖的作用。用不同浓度的 TGF-β1（0、0.1、0.5、1、5、10 μg/L）作用HK-2细胞48 h及5 μg/L的TGF-β1作用不同时间（0、12、24、48和72 ｈ），以实时定量PCR和Western印迹方法检测α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、钙黏蛋白（E-cadherin）、纤连蛋白（FN）的表达。用递增浓度的Cp(1、5、10 g/L)预处理HK-2细胞24 h后，观察其对TGF-β1效应的干预作用。 结果 Cp以剂量依赖方式促进HK-2细胞增殖（P < 0.05）。TGF-β1无论在转录水平还是蛋白水平皆能诱导HK-2细胞 α-SMA、FN表达上调，而下调E-cadherin表达。分别用1、5、10 g/L Cp预干预24 h后，同单独5 μg/L TGF-β1刺激组相比，上述因子表达被不同程度逆转。在转录水平，α-SMA mRNA表达被抑制率分别为37.98%、68.08%、84.36%；FN mRNA表达被抑制率分别为46.97%、63.82%、81.85%；E-cadherin mRNA表达分别增加0.67倍、2.69倍、5.43倍（均P < 0.05）。在蛋白水平，α-SMA蛋白表达被抑制率分别为33.40%、47.75%、68.50%；FN蛋白表达抑制率分别为16.26%、65.92%、80.30%；E-cadherin蛋白表达分别增加1.33倍、3.19倍、4.29倍（均P < 0.05）。Cp能明显拮抗 TGF-β1 诱导的HK-2细胞的表型改变。 结论 Cp能有效阻止TGF-β1诱导的人近端肾小管上皮细胞发生转分化。     

黄芪对人肾小管上皮细胞细胞外基质分泌的影响及其机制探讨

目的：探讨黄芪对人肾小管上皮细胞细胞外基质分泌的影响及甚可能机制。方法：将体外培养的人肾小管上皮（HK-2）细胞株转板至细胞融合并同步后,分为空白对照组、转化生长因子-β（TGF-β1）刺激组（5ng／ml）、TGF-β1加黄芪100μg／ml组、TGF-β1加黄芪1mg／ml组。作用24h后半定量逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）检测纤维连接蛋白（FN）及纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）mRNA;酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测上清液中FN的含量;westernblot检测PAI-1的表达。结果：（1）HK-2细胞表达少量FN和PAI-1;（2）HK-2细胞在5ng／ml TGF-β1．刺激下分泌FN、PAI—1mRNA及FN、PAI-1蛋白表达明显增加,与空白对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）;（3）HK-2细胞在TGF-β1和不同浓度的黄芪作用后,可使FN、PAI-1mRNA及蛋白表达减少,与TGF-β1组比较差异有统计学意义（P〈0．01）,尤以黄芪1mg／mi组为甚。结论：TGF—β1可促进HK-2细胞分泌FN和PAI—1,黄芪可部分拮抗TGF-β1的上述效应。这可能是黄芪预防或改善肾小管间质病变的作用机制之一。     

ERK1/2信号通路在甲状旁腺激素致人近曲小管上皮细胞分泌纤溶酶原激活物抑制剂1中的作用

目的 从体外观察ERK信号通路在甲状旁腺激素（PTH）致人近曲小管上皮细胞（HK-2）合成纤溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）中的作用。 方法 以HK-2细胞株为研究对象,用不同浓度PTH（10-8、10-9、10-10、10-11、10-12 mol/L）作用细胞48 h,以及10-10 mol/L PTH作用细胞不同时间（12、24、36、48、72 h）,分别用RT-PCR法检测PAI-1 mRNA表达,Western印迹法检测PAI-1蛋白表达。以10-10 mol/L PTH作用细胞48 h,分别观察细胞ERK1/2抑制剂预处理前后磷酸化（p）ERK1/2、PAI-1mRNA及蛋白的变化情况。 结果 10-12 mol/L PTH可促进细胞在基因及蛋白水平合成PAI-1,随着PTH浓度逐渐上升,PAI-1mRNA及蛋白浓度均相应增加,以10-10 mol/L PTH组刺激作用最显著,分别为对照组的4.01倍和3.81倍（均P < 0.01）。但随着PTH浓度进一步增加,PAI-1mRNA及蛋白浓度却随之下降。10-10 mol/L PTH作用细胞,12 h时有少量PAI-1表达,72 h时达峰值,并呈时间依赖性,分别为0 h组的4.06倍和4.03倍（均P < 0.01）。10-10 mol/L PTH作用细胞48 h,有大量的p-ERK1/2合成（P < 0.01）,经ERK1/2抑制剂预处理后,PAI-1及ERK均显著下降（均P < 0.01）,但仍高于对照组（均P < 0.05）。 结论 ERK信号通路部分参与PTH致HK-2细胞合成PAI-1的作用。     

高糖通过转化生长因子β1-Smad信号传递途径诱导肾小管上皮细胞转分化

目的 通过观察高糖对肾小管上皮细胞转分化(EMT)的作用，探讨其与转化生长因子β1 (TGF-β1)的关系及糖尿病肾病肾小管间质纤维化的发病机制。 方法 以人肾小管上皮细胞株HKC细胞和高表达Smad7蛋白的HKC转染细胞株为研究对象。蛋白印迹法检测高糖(葡萄糖浓度分别为25和50 mmol/L)对α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E钙黏蛋白 (E-cadherin)和纤连蛋白(FN)表达的影响。酶联免疫吸附(ELISA)法检测TGF-β1的水平。Boyden小室检测HKC细胞的迁移能力。抗TGF-β1抗体中和实验分析高糖对肾小管EMT作用及与TGF-β1的关系。 结果 持续的高糖作用(96 h)能够导致HKC表达α-SMA蛋白，其中25和50 mmol/L的葡萄糖分别增加表达α-SMA 2.8倍和8.2倍；降低E-cadherin的表达；刺激合成FN。25和50 mmol/L的葡萄糖刺激HKC 12 h后，细胞培养上清液中TGF-β1浓度分别为(408.5±198.6)和(939.3±311.8) ng/L，呈剂量依赖性。抗TGF-β1抗体能够显著抑制高糖导致的HKC高表达α-SMA蛋白和FN及降低E-cadherin表达的作用。高表达Smad7蛋白的HKC转染细胞株在高糖的持续作用下，不能表达α-SMA和FN蛋白，E-cadherin也未见降低。细胞迁移实验表明，25和50 mmol/L高糖能够增加HKC迁移至Boyden小室膜下侧面的细胞数[(12.4±3.7)和（18.6±4.4)细胞/HP）]，与正常对照组[(3.0±0.8)细胞/HP]差异有统计学意义(P < 0.01)。抗TGF-β1多克隆抗体能够部分抑制高糖(50 mmol/L)造成的HKC细胞向Boyden小室膜下侧面的迁移[(11.9±5.2)细胞/HP]。高表达Smad7蛋白的HKC转染细胞株在高糖培养条件下迁移至Boyden小室膜下侧面的细胞数[（4.3±1.2）细胞/HP]与正常对照组差异无统计学意义。 结论 高糖能够诱导肾小管EMT，此作用与高糖刺激该细胞合成TGF-β1有关，阻止Smad信号途径能够拮抗TGF-β1介导的肾小管EMT的作用。     

饰胶蛋白聚糖与转化生长因子β1对大鼠肾系膜细胞生长及相关信号途径的影响

目的探讨饰胶蛋白聚糖（DCN）与转化生长因子β1（TGF-β1）对大鼠肾系膜细胞（MsC）生长及相关信号途径的影响。方法经脂质体介导将DCN基因转染体外培养的大鼠肾MsC,经筛选和鉴定后,收集阳性细胞克隆的培养上清（DCN上清）。采用流式细胞仪检测经TGF-β1（2μg/L）和（或）DCN上清作用后MsC细胞周期的变化。采用Western印迹法分别检测两者单独或联合作用后,MsC磷酸化丝裂原活化蛋白激酶（p-MAPK）、磷酸化Smad2 （p-Smad2）和p21蛋白表达情况。采用免疫共沉淀方法检测阳性细胞克隆上清中DCN与TGF-β1的结合情况。结果TGF-β1或DCN上清单独作用时均可抑制MsC的增殖,G_2-M期细胞数分别为对照组的81%及86.5%,而两者共同作用时G_2-M期细胞数与对照组差异无统计学意义。经TGF-β1和DCN上清单独作用12 h后,p-ERK1/2表达为对照组的4.4、3.7倍和3.2、3.7倍;p-SAPK/JNK表达为对照组的2.0、1.5倍和1.9、1.5倍;而两者共同作用组p-ERK1/2和p-SAPK/JNK表达与对照组差异无统计学意义。TGF-β1单独作用12 h后,MsC p-Smad2的表达为对照组的2.6倍,而DCN单独作用组及2者联合作用组其表达与对照组差异无统计学意义。DCN单独作用12 h后p21蛋白的表达为对照组的2.6倍,而TGF-β1单独作用及2者联合作用组其表达与对照组差异无统计学意义。阳性细胞克隆上清中DCN可以直接与TGF-β1结合。结论TGF-β1与DCN单独作用均可抑制MsC增殖及激活MAPK信号途径,但2者共同作用时其作用相互抵消。TGF-β1激活Smad信号途径作用可被DCN阻断;DCN上调p21蛋白作用可被TGF-β1阻断。2者通过不同信号分子抑制细胞生长,其作用可能与两者相互结合有关。     

syndecan-4对碱性成纤维细胞生长因子诱导人肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质分泌的影响

目的 研究syndecan-4对碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导人肾小球系膜细胞(HMC)增殖及细胞外基质（ECM）分泌的影响,并探讨syndecan-4-蛋白激酶Cα（PKCα）途径在其中的作用。 方法 免疫荧光方法观察syndecan-4在HMC上的表达。筛选有效的syndecan-4-siRNA转染HMC,噻唑蓝（MTT）比色法检测HMC在bFGF不同作用时间下的增殖差异;ELISA法检测细胞上清液中的Ⅰ、Ⅳ型胶原和纤连蛋白（FN）含量;荧光定量PCR观察syndecan-4和PKCα含量的变化。 结果　syndecan-4蛋白在HMC有表达。bFGF可促进HMC的增殖及FN、Ⅳ型胶原的分泌,使得每百万看家基因中PKCα拷贝数明显增加。转染syndecan-4 siRNA后,显著降低了HMC的增殖速度（48~60 h时点,P < 0.01）、ECM分泌（FN：24 h时点,P < 0.01,48~96 h,P < 0.05;Ⅳ型胶原：72~96 h时点,P < 0.05）及PKCα含量 （0 h时点,P < 0.05,12 ~48 h时点,P < 0.01）。 结论 syndecan-4参与调控bFGF诱导HMC的增殖及ECM分泌过程。syndecan-4-PKCα途径可能在其中扮演重要作用。