紫杉醇对黑素瘤细胞A375体外抑制作用

目的:确定紫杉醇在体外对A375细胞凋亡的影响.方法:不同浓度紫杉醇分别作用A375细胞24 h、48 h和72 h后,用MTT法测定对细胞生长的抑制,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡的变化,Western blot检测生存素(Survivin)的表达.结果:紫杉醇呈剂量和时间依赖性抑制细胞增殖,但高浓度组(1000 nmol/L)与低浓度组(100 nmol/L)在促进细胞凋亡及周期阻滞方面均无明显差异(P>0.05).不同浓度紫杉醇作用细胞24 h后,Survivin表达逐渐升高,48 h后其表达逐渐减弱,至72 h与对照组相比无显著性差异.结论:紫杉醇对A375细胞的生长抑制作用在一定浓度范围内呈浓度时间依赖性,抑制Survivin的表达是紫杉醇诱导细胞凋亡的途径之一.Survivin的表达与瘤细胞对紫杉醇产生抗药性有关.     

内皮抑制素对黑素瘤A375细胞侵袭能力的影响

目的探讨内皮抑制素对体外培养的黑素瘤A375细胞核因子κB(NF-κB)和基质金属蛋白酶-9(MMP9)表达的影响。方法 CCK-8法检测内皮抑制素对A375细胞增殖的抑制作用;Transwell小室试验检测内皮抑制素对A375细胞侵袭能力的影响;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western-blot法分别检测内皮抑制素对A375细胞NF-κB,MMP9 mRNA和二者蛋白表达的影响。结果内皮抑制素对A375细胞增殖抑制作用呈时间-浓度依赖性;20μg/mL内皮抑制素作用A375细胞72h后:细胞穿膜数(21.5±7.3)低于对照组(56.8±6.2);胞内NF-κB,MMP9 mRNA以及二者蛋白表达水平均有明显下降,与对照组相比的差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论内皮抑制素可下调NF-κB和MMP9的表达,从而抑制黑素瘤浸润和转移。这为内皮抑制素临床治疗皮肤黑素瘤提供了部分理论依据。     

丹参酮ⅡA对黑素瘤细胞侵袭迁移能力的抑制作用及机制

目的 探讨丹参酮ⅡA对黑素瘤A375细胞侵袭转移的作用及趋化因子受体7(CXCR7)基因与蛋白表达的影响.方法 体外培养黑素瘤A375细胞,经1、2、4mg/L丹参酮ⅡA处理48 h后,细胞划痕实验和Transwell细胞体外侵袭实验分别测定细胞迁移和侵袭能力,实时荧光定量PCR和Western印迹分别检测A375细胞CXCR7 mRNA和蛋白的表达水平.结果 1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA处理A375细胞48 h后,Transwell细胞体外侵袭实验显示,每高倍(×200)视野下迁移穿过聚碳酸酯膜的细胞数分别为71.00±4.00、51.00±2.00、37.00±3.61,而细胞划痕实验显示,细胞迁移数分别为301±3.00、253.00±3.61、126.00±7.00,均显著低于对照组(105.33±6.51、332.00±6.24,均P＜0.05),且丹参酮ⅡA对A375细胞侵袭、迁移能力的抑制作用随丹参酮ⅡA浓度的升高而增强(均P＜0.05).实时荧光定量PCR及Western印迹显示,1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA组CXCR7 mRNA的相对表达量分别为0.63±0.04、0.44±0.02、0.31±0.01,蛋白表达水平分别为0.573±0.015、0.416±0.011、0.260±0.055,均显著低于对照组(1.00±0.02、0.9000±0.010,均P＜0.05),且丹参酮ⅡA对A375细胞CXCR7 mRNA和蛋白表达的抑制能力随丹参酮ⅡA浓度的升高而增强(均P＜0.05).结论 丹参酮ⅡA可通过下调CXCR7表达抑制黑素瘤A375细胞的侵袭迁移能力.     

苦参碱抑制人恶性黑素瘤A375细胞株的侵袭

目的 探讨苦参碱对恶性黑素瘤细胞A375转移能力的影响及其作用机制。方法 采用MTT法和膜联蛋白-V-FITC/PI双染色法分别检测不同浓度苦参碱对A375细胞增殖和凋亡的影响,半定量RT-PCR分析经苦参碱干预后A375细胞乙酰肝素酶mRNA的表达变化,细胞黏附实验检测细胞黏附能力的改变,基质胶侵袭实验观察细胞侵袭能力的变化。结果 苦参碱浓度≥0.5mg/mL时可抑制A375细胞增殖并诱导细胞凋亡,其作用呈剂量依赖性;苦参碱浓度在0.125～0.5mg/mL时,能明显下调A375细胞乙酰肝素酶mRNA的表达,并能抑制细胞的黏附、侵袭能力(P<0.01),其抑制效应呈剂量依赖性,在不同浓度组间比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 苦参碱在体外能抑制A375细胞的黏附、侵袭能力。苦参碱抗肿瘤侵袭可能与抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡以及下调乙酰肝素酶的表达有关。     

LRP1促进黑素瘤A375细胞的转移

目的探讨低密度脂蛋白受体相关蛋白-1(low-density lipoprotein receptor-related protein-1,LRP1)与黑素瘤转移的关系。方法沉默黑素瘤细胞A375的LRP1基因,测试划痕实验和Transwell实验;利用免疫组织化学(IHC)检测组织芯片上正常皮肤组织和黑素瘤皮肤组织的LRP1蛋白表达情况。结果黑素瘤A375细胞中沉默LRP1基因后,黑素瘤A375细胞的迁移能力和转移能力减弱;组织芯片免疫组织化学结果发现LRP1蛋白在黑素瘤皮肤组织中相对于正常皮肤组织表达增高。结论 LRP1蛋白可以促进黑素瘤A375细胞的转移;LRP1蛋白可能成为黑素瘤潜在的肿瘤标记物以及黑素瘤诊断治疗的靶蛋白。     

沉默ATAD3A对黑素瘤A375细胞增殖、侵袭和迁移的影响及机制研究

【摘要】 目的 探讨沉默三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A）对黑素瘤A375细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法 2019年8 - 12月在重庆市渝北区人民医院收集经病理确诊的3例黑素瘤患者的黑素瘤组织及癌旁组织 ,应用Western印迹检测ATAD3A在上述组织中的表达。分别采用沉默ATAD3A慢病毒和空载慢病毒感染黑素瘤A375细胞系,构建沉默ATAD3A（shATAD3A）实验组和空载对照（shCtrl）组,经实时荧光定量聚合酶链反应（qRT?PCR）和Western印迹验证干扰效率。采用CCK?8实验、克隆形成实验比较两组细胞的增殖能力和克隆形成能力,采用Transwell细胞侵袭实验、划痕实验比较两组细胞的侵袭、迁移能力,采用Western印迹检测两组细胞自我更新相关蛋白（NANOG、SOX2、OCT4）和侵袭、迁移相关蛋白［基质金属蛋白酶2（MMP2）、波形蛋白、SLUG］的表达水平。两组间各指标的比较采用独立样本t检验。结果 Western印迹显示,相对于癌旁组织,ATAD3A在3例黑素瘤组织中高表达（t = 10.825,P < 0.001）。qRT?PCR和Western印迹显示,shATAD3A组A375细胞ATAD3A mRNA为0.230 ± 0.073,shCtrl组为1.000 ± 0.244,两组比较,t = 9.461,P < 0.001,蛋白表达水平分别为0.279 ± 0.267和0.867 ± 0.115,t = 8.595,P = 0.002, 表明成功构建沉默ATAD3A的黑素瘤A375细胞系。克隆形成实验和CCK?8实验显示,shATAD3A组克隆形成率低于shCtrl组（22.667% ± 2.510%比43.667% ± 5.030%,t = 6.464,P = 0.003）,且细胞增殖活性自第2天开始直至第4天均显著低于shCtrl组。划痕实验及Transwell细胞侵袭实验显示,与shCtrl组相比,shATAD3A组划痕愈合减慢,划痕愈合率自第12 h开始（32.920% ± 4.642%比49.302% ± 1.448%,t = 5.835,P = 0.004）至24 h明显降低,通过Transwell小室下室的侵袭细胞数减少（68.330 ± 13.050比234.330 ± 19.139,t = 12.411,P < 0.001）。Western印迹显示,shATAD3A组细胞NANOG、SOX2、OCT4、MMP2、波形蛋白、SLUG的表达水平均显著下降（P < 0.05或0.001）。结论 ATAD3A在黑素瘤组织中高表达,沉默ATAD3A能抑制黑素瘤A375细胞的增殖、侵袭和迁移能力。     

CCL18趋化性细胞因子对A375黑素瘤细胞株增殖和侵袭的影响

目的 探讨CCL18对A375黑素瘤细胞株增殖、侵袭及血管增殖的影响.方法 提取成人外周血单核细胞,IL-4诱导48 h后,与A375黑素瘤细胞株共培养,通过MTT法检测CCL18对A375增殖的影响;通过趋化试验及重组基底膜侵袭实验,测定CCL18对肿瘤细胞的趋化能力及侵袭作用的影响.通过将A375黑素瘤细胞株接种于鸡胚尿囊膜,测定不同情况下CCL18对肿瘤血管生成的影响.结果 IL-4诱导单核细胞组、非诱导单核细胞组呈现促进A375细胞增殖的作用,而CCL18与对照组比较差异无统计学意义.IL-4诱导单核细胞组及CCL18重组细胞因子组与对照组比较均对肿瘤细胞存在趋化作用,并促进肿瘤细胞的侵袭(P＜0.05);IL-4诱导组及CCL18组在鸡胚尿囊膜试验中可促进肿瘤血管的生成(P＜0.05).结论 CCL18具有促进A375黑素瘤细胞株侵袭及血管增殖的作用.     

p62基因对黑素瘤A375细胞生物学特性的影响

目的研究p62基因在黑素瘤A375细胞生长增殖及细胞周期调控等方面的作用。方法取对数生长期的A375细胞,用干扰p62基因表达的siRNA慢病毒载体转染细胞;MTT法检测转染及正常A375细胞的平均OD值;流式细胞术检测两组的细胞周期分布。结果转染组的平均OD值较正常组小(P0.05);转染组的G0/G1期比例(0.73±0.01)较正常组(0.64±0.02)高(P=0.002);转染组的凋亡率(0.10±0.02)较正常组(0.03±0.01)高(P=0.004)。结论干扰p62表达后,细胞周期阻滞于G0/G1期,p62在维持细胞周期和肿瘤细胞凋亡中起着重要的作用。     

过表达RhoD对人黑素瘤A375细胞骨架和迁移侵袭的影响

目的：探讨RhoD对人黑素瘤细胞株A375细胞骨架、迁移和侵袭能力等的影响及作用机制。方法实验分为A375?RhoD组和A375?增强型绿色荧光蛋白（EGFP）组,分别用携带RhoD的慢病毒载体和阴性对照慢病毒载体转染。罗丹明标记鬼笔环肽染色观察细胞骨架,Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭能力,流式细胞仪检测细胞周期,Western印迹法检测丝切蛋白、磷酸化丝切蛋白、Diaph2和RhoD的表达。结果与A375?EGFP组细胞相比,A375?RhoD组细胞体积增大,应力纤维变细,软弱无力,黏着斑增多;丝状伪足形成增加;皱褶缘和板状伪足无明显变化。Transwell迁移实验显示,A375?EGFP组和A375?RhoD组平均每200倍视野下穿膜细胞数分别为152.67±11.23和72.67±5.03,两组间差异有统计学意义（t =11.25,P <0.05）。Transwell人工基底膜侵袭试验显示,A375?EGFP组和A375?RhoD组平均每200倍视野下穿膜细胞数分别为78.33±12.34和9.00±1,两组间差异有统计学意义（t=9.70,P<0.05）。A375?EGFP和A375?RhoD两组间G1期、S期和G2期细胞所占百分比差异均无统计学意义（P>0.05）。Western印迹结果显示,A375?RhoD组细胞可在RhoD的刺激下激活下游信号效应分子Diaph2,促进其表达,而A375?EGFP组未能激活,两组间丝切蛋白和磷酸化丝切蛋白表达差异不显著。结论 RhoD过表达可能通过下游效应分子Diaph2调节细胞骨架进而抑制A375细胞的迁移和侵袭能力。     

槲皮素对人黑素瘤A375细胞增生和凋亡的影响

目的探讨槲皮素对体外培养人黑素瘤A375细胞增生和凋亡的影响。方法 CCK8法检测0、20、40、80、160μmol/L浓度槲皮素作用于A375细胞24、48和72 h后细胞增生水平。用0、20、40、80、160μmol/L浓度槲皮素作用24 h后,以Annexin-V/PI法观察A375细胞凋亡,分别测定Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9的活性,并以蛋白印迹法(Western blot)检测p53,Bax及Bcl-2的基因蛋白水平。结果与空白对照组比较,20、40、80、160μmol/L槲皮素作用24、48和72 h后均对A375细胞的增生有抑制作用,且有时间、浓度依赖性。0、20、40、80、160μmol/L槲皮素在作用24 h时,A375细胞早期凋亡率由(3.02±0.49)%分别上升至(11.20±1.68)%、(12.44±1.68)%、(24.55±0.58)%和(47.68±0.79)%,各组与对照组相比差异均有统计学意义(P0.05或0.01),80、160μmol/L作用组的Caspase 3,Caspase8,Caspase 9活性升高,且与对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05或0.01)。p53及Bax的蛋白水平随药物浓度的增加而升高,Bcl-2的蛋白水平随药物浓度增加而降低。结论槲皮素对黑素瘤A375细胞具有抑制增生和诱导凋亡的作用,其作用机制可能与调节p53及Bcl-2/Bax基因有关。     

RNAi沉默c-Met基因对黑素瘤A375细胞生物学行为的影响

目的探讨c-MetshRNA表达载体对人黑素瘤A375细胞增殖、侵袭能力的影响。方法以pGenesil-1质粒为载体,以c-Met为靶基因,构建shRNA表达载体,并将其转染至体外培养的人黑素瘤A375细胞中。倒置相差显微镜下观察经干扰后瘤细胞的形态学变化;采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法分别检测转染细胞c-Met基因和蛋白的表达水平;四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测转染后细胞的生长活力;Transwell小室法测定转染细胞体外侵袭能力。结果构建了pGenesil-1-c-MetshRNA重组质粒,并成功转染A375细胞。转染后A375细胞缩小,变圆。RT-PCR显示转染后c-Met mRNA的表达显著降低,以48h为著,下降近64%;Western blot证实转染后蛋白的表达下降近65%;MTT法显示细胞的活力降低为(68.25±4.4)%;Transwell小室测定转染细胞体外侵袭能力明显下降。结论 pGenesil-1-c-MetshRNA重组质粒明显下调c-Met在黑素瘤细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞增殖及其侵袭能力。     

HINT1对人黑素瘤细胞A375增殖和凋亡的影响

目的 探讨HINTl基因对人黑素瘤细胞A375增殖、凋亡的影响及其作用机制.方法 应用构建的peDNA.3.1/mye-His(-)A-HINTl真核表达载体,建立稳定转染且能高表达HINTI的A375细胞模型.用M1rr法检测细胞增殖活性变化,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率,TUNEL法检测细胞凋亡.分光光度法检测Caspase 3,Caspase 8及Caspase 9的相对活性.Western印迹法检测bcl-2、bax、细胞色素C及p53的表达.结果 与空载体-A375及未转染A375细胞相比,HINT1-A375细胞生长速度明显减慢(P<0.05);Gl期细胞增多(73.17%±3.99%,F=25.65,P<0.05),S期细胞减少(16.75%±1.62%.F=75.48,P<0.01),细胞出现明显的晚期凋亡(23.57%±9.58%,F=11.71,P<0.01). TUNEL法显示凋亡阳性细胞百分比(12%±1%)显著增高(F=358.02,P<0.01);Caspase 9(0.45±0.03,F=135.62,P<0.01)和Caspase 3表达(0.46±0.04,F=90.28,P<0.01)升高.凋亡相关蛋白bax、细胞色素C及p53表达增加,bel-2表达降低.结论 高表达H1NT1可抑制A375细胞的增殖,促进其凋亡,细胞周期出现G_1期阻滞,提示HINT1可能是人黑素瘤的抑癌基因.     

辛伐他汀对缺氧黑素瘤细胞A375增殖凋亡及迁移的影响

目的 探讨辛伐他汀对缺氧黑素瘤细胞A375增殖、凋亡、迁移调控的分子机制.方法 在常氧或缺氧环境下体外培养A375细胞,细胞分为辛伐他汀处理的辛伐他汀组与二甲基亚砜处理的对照组,通过CCK-8细胞计数试剂盒检测细胞活力,Annexin V/PI凋亡实验检测细胞凋亡,插入式细胞培养皿transwell迁移实验检测细胞迁移.RT-PCR法、Western印迹法检测辛伐他汀组与对照组细胞低氧诱导因子(HIF)-1α、生存素、细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子(P27),以及沉默缺氧A375细胞的HIF-1α后的生存素、p27 mRNA与蛋白表达水平.结果 常氧或缺氧环境下,辛伐他汀组与对照组A375细胞增殖活力、凋亡细胞比例、细胞迁移数组间差异均有统计学意义(F值95.84、37.22、177.5,均P＜0.001),缺氧对照组A375细胞的增殖活力(1.391±0.129)、细胞迁移数(322.550±26.226)均高于常氧对照组(0.807±0.049、125.583±17.256)、缺氧辛伐他汀组(0.685±0.417、115.167±12.050)(P＜ 0.001);缺氧对照组细胞凋亡比例(6.167％±2.714％)均低于常氧对照组(11.833％±2.483％)、缺氧辛伐他汀组(17.833％±2.714％)(P＜0.01).缺氧辛伐他汀组HIF-1αmRNA与蛋白水平、生存素mRNA与蛋白水平均低于对照组(P＜ 0.05);P27mRNA与蛋白水平均高于对照组(P＜0.05).沉默缺氧A375细胞中HIF-1α后,生存素mRNA与蛋白水平均低于对照组(t值为5.346、8.281,P＜0.05),P27 mRNA与蛋白水平高于对照组(t值为31.37、9.954,P＜0.01).结论 辛伐他汀可抑制缺氧A375细胞的增殖及迁移,促进凋亡,其机制可能与HIF通路有关.     

内皮素3对恶性黑素瘤A375细胞上皮基质转化的影响

目的 研究内皮素-3（ET-3）对人恶性黑素瘤（MM）A375细胞上皮基质转化（EMT）的影响。方法 体外培养A375细胞,分别设立3组：空白对照组、100 nmol/L ET-3组、100 nmol/L ET-3和100 μmol/L BQ788（内皮素受体B阻断剂）组。采用Transwell小室检测细胞转移,细胞爬片技术检测细胞形态变化,实时PCR和Western印迹检测上皮基质转化相关分子上皮细胞钙黏蛋白、波形蛋白及转录因子（Twist、 Slug）表达情况,使用方差分析及Scheffe法对结果进行分析。结果 各干预条件中,与空白对照组比较,ET-3可以促进A375细胞的转移,BQ788可阻断该效应（3组穿膜细胞数分别为4.200 ± 0.837、9.400 ± 0.548、3.400 ± 0.894,F = 88.44,P < 0.01）;ET-3 可以促进A375细胞由上皮型向成纤维细胞样形态转变,促进A375上皮细胞钙黏蛋白表达下调（3组分别为0.330 ± 0.002、0.280 ± 0.007、0.420 ± 0.008,F = 329.98,P < 0.01）,波形蛋白表达上调（0.830 ± 0.014、1.160 ± 0.003、0.750 ± 0.030,F = 262.94,P < 0.01）,而BQ788可阻断这种效应。ET-3可以促进上皮基质转化相关转录因子Slug mRNA（F = 376.94,P < 0.01）及Twist mRNA（F = 215.62,P < 0.01）及其蛋白水平（FSlug = 288.87,P < 0.01;FTwist = 156.96,P < 0.05）上的表达上调。结论 ET-3/ETRB通过上调波形蛋白,下调上皮细胞钙黏蛋白的表达,并上调转录因子（Twist、 Slug）的表达,促进黑素瘤A375细胞上皮基质转化。     

丹参酮ⅡA对黑素瘤A375细胞CXCR7及VEGF表达的影响

目的观察丹参酮ⅡA对黑素瘤A375细胞CXCR7及VEGF表达的影响,探讨其抗肿瘤的作用机制。方法体外培养黑素瘤A375细胞,经4组不同浓度丹参酮ⅡA(0,1,2,4mg/L)作用后,ELISA法检测培养液中VEGF浓度,Real time-PCR法及Western blotting法分别检测其对CXCR7和VEGF mRNA及蛋白表达的影响。结果丹参酮ⅡA处理黑素瘤A375细胞48h后,培养液中VEGF浓度随丹参酮ⅡA浓度的升高而降低,CXCR7及VEGF mRNA及蛋白表达随丹参酮ⅡA浓度的升高而降低,差异具有统计学意义(P0.05)。结论丹参酮ⅡA能抑制黑素瘤肿瘤细胞内VEGF及CXCR7的转录和蛋白的表达,提示丹参酮ⅡA可能具有潜在的抗肿瘤作用。     

罗格列酮对人黑素瘤细胞株A375体外侵袭能力的抑制及相关机制

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）配体罗格列酮对人黑素瘤细胞体外侵袭能力的影响及机制。方法 体外培养人黑素瘤细胞株A375;噻唑蓝法（MTT）检测罗格列酮对A375细胞的增殖抑制率;RT-PCR、Western印迹检测罗格列酮对黑素瘤侵袭相关基因基质金属蛋白酶2（MMP2）、组织金属蛋白酶抑制剂2（TIMP2）表达的影响。Matrigel侵袭实验检测罗格列酮对黑素瘤细胞体外侵袭能力的影响。结果 MTT结果显示,在24 h干预点,罗格列酮浓度为10、25 μmol/L 时,对A375细胞增殖抑制率分别为（4.86 ± 0.31）%、（5.15 ± 0.52）%,细胞毒性作用不明显。罗格列酮能在mRNA和蛋白水平下调MMP2的表达（P < 0.01）,并上调TIMP2 mRNA的表达（P < 0.01）。侵袭实验显示,对照组、10 μmol/L罗格列酮组、25 μmol/L罗格列酮组穿过Transwell小室膜的A375细胞数依次为210.7 ± 14.9,154.1 ± 7.7,87.3 ± 8.1,差异有统计学意义（P < 0.01）。结论 罗格列酮能抑制人黑素瘤细胞株A375的转移,可能与其下调MMP2的表达有关。     

青海枸杞多糖对人黑素瘤细胞A375增殖与凋亡的影响

目的观察青海枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide,LBP)对人黑素瘤(malignant melanoma,MM)A375细胞增殖与凋亡的影响。方法传统水提法制备枸杞多糖粉末,体外模型培养A375细胞,分别用0mg/m L(即对照组),5mg/m L,10mg/m L,15mg/m L浓度的枸杞多糖处理A375细胞后,倒置显微镜观察细胞形态,CCK-8法检测各组细胞的吸光度值、计算出相应的增殖抑制率,以及流式细胞仪检测Annexin V-PI染色后细胞凋亡率、Fluo4 AM检测细胞内钙离子浓度变化。结果与0mg/m L组比较,各给药组的A375细胞形态发生变化;增殖抑制率、凋亡率、细胞内钙离子浓度均随枸杞多糖浓度的增高逐渐增高,且与0mg/m L(即对照组)比较差异有统计学意义(P0.05)。结论枸杞多糖能够抑制人黑素瘤A375细胞的增殖,促进其凋亡。     

肿瘤相关巨噬细胞对皮肤恶性黑素瘤细胞A375生物学行为的影响

目的 探讨肿瘤相关巨噬细胞对皮肤恶性黑素瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响。 方法 取对数生长期人单核细胞株U937,采用佛波酯诱导48 h后,分为3组, Mφ组（继续用佛波酯诱导48 h）、M1组（用25 mg/L LPS诱导48 h）、M2组（用15 μg/L IL-4诱导48 h）。酶联免疫吸附试验检测各组巨噬细胞上清中IL-12p70和IL-10表达水平。建立巨噬细胞与恶性黑素瘤A375细胞体外共培养体系,分别设单独培养组、Mφ组（A375细胞和Mφ巨噬细胞共培养）、M1组（A375细胞和M1型巨噬细胞共培养）、M2组（A375细胞和M2型巨噬细胞共培养）,分别运用噻唑蓝法、Transwell小室法观察不同激活途径的巨噬细胞对A375细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为的影响。 结果 增殖实验显示,共培养48、72 h后Mφ巨噬细胞、M2型巨噬细胞显著促进A375细胞的增殖,M1型巨噬细胞抑制A375细胞的增殖,各处理组间两两比较,差异有统计学意义（均P < 0.05）,共培养24 h后各组间两两比较A375细胞增殖率差异无统计学意义（P > 0.05）。侵袭实验显示M2组和Mφ组穿过Transwell膜的A375细胞数量（147.00 ± 7.92、113.22 ± 8.15）较单独培养组（84.11 ± 6.07）明显增加（P < 0.05）,M1组穿膜细胞（56.44 ± 7.55）明显减少（P < 0.05）。迁移实验显示M2组和Mφ组穿过Transwell膜的A375细胞数量（198.33 ± 8.22、156.00 ± 8.83）较单独培养组（123.89 ± 7.01）明显增加（均P < 0.05）,M1组穿膜细胞（97.11 ± 6.75）明显减少（P < 0.05）。 结论 IL-4激活的M2型巨噬细胞对A375细胞的增殖、侵袭和迁移可能起促进作用;脂多糖激活的M1型巨噬细胞对A375细胞的增殖、侵袭和迁移可能起抑制作用。佛波酯诱导的巨噬细胞更倾向于M2型巨噬细胞表型。     

siRNA抑制生存素基因对恶性黑素瘤细胞A375凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制恶性黑素瘤细胞株A375生存素基因表达后,对A375细胞凋亡的影响。方法 构建针对凋亡抑制基因生存素的siRNA真核表达载体pU-生存素-siRNA,用电穿孔法转染A375细胞,采用蛋白质印迹技术检测生存素的表达,并用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果 转染pU-生存素-siRNA后,生存素在A375细胞中的表达(0.24±0.02)较对照组(0.98±0.21)明显下降,试验组细胞的凋亡率(83%)较对照组(28%)明显增加。结论 通过RNA干扰技术可抑制生存素的表达,诱导A375细胞的凋亡增加。     

姜黄素联合热疗对人黑素瘤A375细胞毒性的实验研究

目的从细胞水平探讨姜黄素联合热疗治疗人恶性黑素瘤的可行性。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法检测不同处理因素对人恶性黑素瘤A375细胞增殖活性的影响,流式细胞仪检测A375细胞的凋亡情况。结果 30μmol/L姜黄素联合热疗的细胞抑制率高于单纯姜黄素组和热疗组,差异具有统计学意义(F=5.47,P0.01);A375细胞增殖抑制率与姜黄素浓度呈正相关(rs=0.95);30μmol/L姜黄素联合热疗组细胞早期凋亡率高于单纯姜黄素组和热疗组,差异具有统计学意义(H=15.37,P0.01)。结论姜黄素联合热疗对人恶性黑素瘤A375细胞的毒性起协同相加作用,细胞毒性与姜黄素的剂量成明显剂量-效应关系。