中草药鉴定种特异性DNA探针的筛选方法

基因芯片技术为中草药高效、并行、快速鉴定提供了可能.而中草药种特异性探针的筛选是中草药基因芯片鉴定技术开发的关健.文章结合当今中药鉴别芯片和其它物种鉴定芯片研究进展总结了几种适合中草药特异性探针筛选的方法.     

基因芯片技术在衰老机制和抗衰老中药研究中的应用

基因芯片又称DNA微阵列，属于生物芯片的一种，在20世纪90年代初由美国Affymetrix公司的Fodors等提出并开始研究，是在芯片片基上按照特定的排列方式，固定上大量DNA探针，形成一种DNA微阵列。微阵列包括上万种寡核苷酸或DNA样品，密集排列在硅片、玻片、聚乙烯或尼龙膜等固相支持物上。与Southern和Northern杂交技术的原理一样，芯片上的DNA短链根据碱基互补只能专一地与其相匹配的链结合，将样品DNA／RNA扩增，体外转录得来的cDNA用荧光分子标记后，与位于基因芯片上的探针杂交，当芯片上的DNA链与样品cDNA结合时就会被标记，然后激光聚焦荧光显微镜获取信息，由电脑系统处理、分析所得到的大量基因序列及表达信息。应用cDNA或寡核苷酸微阵列基因表达谱能对一个细胞的所有基因提供一个全面的描述，并能够解答不同发育阶段的具体信号。     

细胞周期相关基因微阵列在中药抑制肝癌细胞增殖作用机理研究中的应用

目的 :设计DNA微阵列并利用其研究中药抗肿瘤的分子机制。方法 :制备了包含有与细胞周期和DNA损伤调控检测相关的 2 4个基因的cDNA微阵列 ,选择了本实验室已证明对肝癌细胞有抑制效果的中药 ,通过流式细胞仪检测其对细胞周期的影响 ,提取药物作用后的RNA ,反转录后标记探针与微阵列杂交 ,检测中药作用细胞后对细胞周期及损伤检测相关基因转录的影响。结果 :4种中药作用SMMC 772 1后 ,细胞周期基因和损伤检测点基因均有不同程度改变 ,表现为部分上调 ,部分下调 ,这些和流式细胞术检测的结果是相符合的。结论 :DNA微阵列技术为中草药治疗癌症的研究提供了可供参考的分子生物学依据。     

中药DNA条形码分子鉴定技术的应用与展望

中药材品种广泛,存在多基原的情况,质量差异较大,使临床用药安全性和有效性难以得到保证。因传统中药鉴定方法的局限性,对准确鉴别多基原中药材带来了一定的挑战。为了保证中药临床用药安全有效可控,中药鉴定学已成为最重要的研究课题之一,也是当前中医药事业急需解决的关键技术要求。DNA基因鉴别是从基因层面对中药材进行快速、准确的鉴定,包括DNA分子标记法、核酸探针杂交法和DNA条形码技术,其中DNA条形码技术应用最为广泛。DNA条形码是利用标准的DNA片段对物种进行鉴定的技术,2015年版《中国药典》收载了DNA条形码技术指导原则,建立了动物类采用细胞色素C氧化酶亚基I(COI)序列为主,转录间隔区间(ITS)2为辅;植物类采用ITS2/ITS为主,叶绿体psb A-trn H为辅的中药材鉴定体系。该技术的广泛应用为中药鉴别提供更高效快速的方法,并且有效地应用于多基原中药材的鉴别中,使中药品种混乱现象得到极大改观。文章首先对DNA条形码技术的原理、目的及意义、标准片段的选择进行介绍,着重阐述该技术在中药鉴定中的应用以及存在的局限性,并提出展望,以期为中药材的鉴定研究提供参考。     

用抑制性差减杂交构建As2O3诱导的NB4 细胞凋亡相关基因文库

目的: 构建三氧化二砷(As_2O_3)诱导的急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞凋亡相关基因文库.方法:用含4 μmol·L~(-1)As_2O_3和正常培养基培养NB4细胞24 h,抽提总RNA,经逆转录酶合成双链cDNA,分别以砷诱导凋亡组和对照组作为tester和driver,进行双向抑制性差减杂交(supptess-ion sublxactive hybridization,SSH),筛选As_2O_3诱导的NB4细胞凋亡相关基因,将差异表达基因进行PCR扩增并与pGEM-Teasy克隆载体连接,转化DH5 α大肠杆菌,经蓝白斑筛选获得白色阳性克隆,PCR扩增出未知基因片段.结果:成功构建了分别代表在NB4细胞中表达上调和下调的基因文库.结论: 经双向抑制性差减杂交获得了NB4细胞差异表达基因文库,为克隆NB4细胞凋亡相关基因奠定了基础.     

运用抑制性消减杂交技术构建糖尿病肾阳虚证DNA消减文库

目的:运用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建糖尿病(Diabetic mellitus,DM)肾阳虚证DNA消减文库。方法:选择汉族中医辨证为肾阳虚证的DM患者以及正常人做对照组,进行正向和反向消减杂交。用RsaⅠ酶切用硅胶法抽提基因组DNA成大小不等的片段,分别连接两种不同的接头,进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将PCR产物与U/A载体连接,经蓝白斑筛选及菌液PCR筛选出阳性重组质粒,构建DM肾阳虚证DNA消减文库。结果:用SSH方法筛选出DM肾阳虚证的差异DNA片段,经克隆及PCR筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了DM肾阳虚证的DNA消减文库。结论:SSH技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建DM肾阳虚证DNA消减文库,为进一步筛选和克隆DM肾阳虚证相关基因奠定了基础。     

糖尿病肾病肾阳虚证DNA消减文库的构建

目的：采用抑制性消减杂交技术(suppression subtractire hybridization，SSH)构建汉族人糖尿病肾病(dialbetic nephropth1y，DN)肾阳虚证DNA消减文库。方法：选择汉族人DN且中医辨证为肾阳虚证的患者以及正常人作为其对照组，进行正向和反向消减杂交。用硅胶法抽提血白细胞DNA，用RsaI酶切基因组DNA成大小不等的片段，分别与两种不同的接头连接，进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将PCR产物与U载体连接，经蓝白斑筛选后，再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒，构建DN肾阳虚证DNA消减文库。结果：用SSH方法筛选出了DN肾阳虚证的差异DNA片段，得到600个白色克隆，再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒，从而成功地构建了DN肾阳虚证的DNA消减文库。结论：SSH技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建。DN肾阳虚证DNA消减文库，为进一步筛选和克隆DN肾阳虚证相关基因奠定了基础。     

糖尿病肾病肾阴虚证DNA消减文库的构建

在多年糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)肾虚证的研究中,结果发现血管紧张素Ⅰ转换酶(angiotensin Ⅰ-converting enzyme,ACE)基因多态性与肾阴虚证密切相关[1].这提示肾阴虚证存在其相关基因.目前克隆疾病的相关基因有多种方法,其中抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)对研究复杂基因组的差异基因具有一定的优越性.目的:采用抑制性消减杂交技术(suppression sub-tractive hybridization,SSH)构建汉族人糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)肾阴虚证DNA消减文库.方法:选择汉族DN且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交.用硅胶法抽提血白细胞DNA,用RsaⅠ酶切基因组DNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建DN肾阴虚证DNA消减文库.结果:用SSH方法筛选出了DN肾阴虚证的差异DNA片段,得到586个白色克隆,再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了DN肾阴虚证的DNA消减文库.结论:SSH技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建DN肾阴虚证DNA消减文库,为进一步筛选和克隆DN肾阴虚证相关基因奠定了基础.     

糖尿病肾病肾阴虚证DNA消减文库的构建

在多年糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)肾虚证的研究中，结果发现血管紧张素Ⅰ转换酶(angiotensin Ⅰ—converting enzyme．ACE)基因多态性与肾阴虚证密切相关。这提示肾阴虚证存在其相关基因。目前克隆疾病的相关基因有多种方法，其中抑制性消减杂交(suppression subtractiv ehybridization。SSH)对研究复杂基因组的差异基因具有一定的优越性。目的：采用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridiration，SSH)构建汉族人糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)肾阴虚证DNA消减文库。方法：选择汉族DN且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组，进行正向和反向消减杂交。用硅胶法抽提血白细胞DNA。用Rsa Ⅰ酶切基因组DNA成大小不等的片段，分别与两种不同的接头连接．进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将PCR产物与U载体连接，经蓝白斑筛选后，再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒，构建DN肾阴虚证DNA消减文库。结果：用SSH方法筛选出了DN肾阴虚证的差异DNA片段，得到586个白色克隆，再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒，从而成功地构建了DN肾阴虚证的DNA消减文库。结论：SSH技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建DN肾阴虚证DNA消减文库．为进一步筛选和克隆DN肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

分子生物学技术在中药鉴定中的应用

本文总结了近年来分子生物学技术在中药鉴定,包括在动、植物药材鉴定方面的应用,并简述这些技术的原理和方法。将应用的分子生物学技术分为 3类：电泳技术、生物免疫技术和 DNA分子遗传标记技术 (1.基于 PCR反应的方法,包括随机扩增多态 DNA、任意引物聚合酶链反应、微卫星 DNA、扩增片段长度多态和毛细管 PCR; 2.限制性片段长度多态和 PCR产物的 RFLP分析; 3.DNA测序; 4.高特异性 PCR鉴别; 5.DNA芯片或基因芯片鉴别 )。本文可供中医药工作者作参考。     

动物类中药DNA条形码鉴定研究进展

DNA基因鉴定是近年来应用在中药鉴定中较为重要的分子生物技术,该技术能够很好地从基因层面上鉴别药材,具有较高的准确性。DNA基因鉴定包括DNA分子遗传标记,核酸探针杂交,DNA条形码分子鉴定法等,其中发展最快的为DNA条形码分子鉴定法。DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术,是传统形态鉴别方法的有效补充。由于不同物种的DNA序列是由腺嘌呤(A),鸟嘌呤(G),胞嘧啶(C),胸腺嘧啶(T)4种碱基以不同顺序排列组成,因此对某一特定DNA片段序列进行分析即能够区分不同物种。Hebert等在2003年提出了通过测定线粒体细胞色素C氧化亚基I(COI)基因序列来鉴定动物的种类。陈士林等则在大量实验的基础上提出了鉴别动物的基因以COI基因为主,ITS2基因为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系。大量的实验表明,通过DNA条形码来鉴别动物具有准确性、可行性、简便性、通用性,为鉴别动物物种及发现新物种提供了新的方法,为鉴别动物药材的真伪提供了科学的依据。但由于该技术是通过基因进行鉴定,对实验材料及提取方法有较高要求,对一些年代较久的动物药材,其DNA降解较为严重,为DNA提取技术提出了较高的要求;该技术只能鉴别其来源是否准确却不能鉴别其药用部位是否准确,这就需要结合其他鉴别方法来准确鉴别其药用部位。本文通过综合国内外对DNA条形码的研究,为日后的研究和应用提供理论依据。     

DNA条形码等分子鉴定技术与动植物类中药材的鉴定

中药材鉴定是控制中药质量、确保用药安全与效果的首要环节。DNA分子鉴定是从基因层面上进行中药材鉴别的手段,准确率高。DNA分子鉴定包括电泳技术、免疫技术、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单重复序列(ISSR)及DNA条形码等,以DNA条形码应用最为广泛。DNA条形码是基因组中相对较短的、可用于物种鉴定的特异性基因片段。植物类中药材的条形码多选用核基因和叶绿体基因DNA片段,如叶绿体psbA-trnH基因、内转录间隔区(ITS)、叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基(rbcL)和RNA转录体Ⅱ型内含子剪切酶基因(matK)等;动物类中药材的条形码多来自核基因和线粒体基因DNA,主要有线粒体细胞色素C氧化酶亚基1(COⅠ)、核糖体RNA(rRNA)和线粒体细胞色素b基因(CytB)等。综述动植物类中药材DNA分子标记与鉴定技术应用进展,并探讨DNA条形码在药用动植物类中药材鉴定中存在的局限性及发展前景,为中药质量控制提供参考。     

《中国药典》中蕲蛇饮片分子鉴定方法的研究和探讨

目的：运用多种分子鉴定方法,从技术要求和标准编写方面对蕲蛇饮片现行质量标准提出建议。方法：本研究选取蕲蛇所在蝰科Viperidae蝮亚科Crotalinae的7个近缘物种和9种常见的蕲蛇伪品物种作为研究对象,采用DNA 条形码技术扩增16S rRNA序列,运用电泳检视法,根据扩增条带的有无评价模板DNA的质量;16S rRNA序列扩增产物通过双向测序,运用BioEdit软件拼接,双端对齐后剪切比对,利用MEGA 5.1软件构建邻接（NJ）系统发育树;采用蕲蛇饮片现行标准方法进行同步鉴别。结果：16S rRNA序列的电泳检视结果可有效评价蕲蛇样品的模板DNA质量,避免由于模板DNA质量不佳导致的假阴性结果的可能性;基于16S rRNA条形码序列建立的NJ树可以鉴别蕲蛇饮片及其混淆品;蕲蛇饮片现行标准方法专属性良好。结论：DNA条形码方法、现行标准方法以及NJ树三者相互结合,从不同角度对蕲蛇饮片进行真伪鉴别,有效弥补蕲蛇饮片现行标准方法的不足,为其他中药品种的分子鉴定技术的质量标准制定提供了参考。     

应用PCR-RFLP方法鉴定梅花鹿茸与马鹿茸

目的 建立一种应用限制性片段长度多态性技术鉴别梅花鹿茸与马鹿茸的方法。方法 提取各种鹿茸样品的基因组DNA,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对正品鹿茸的特异性片段进行扩增,鉴别鹿茸的真伪,然后对正品鹿茸利用动物通用引物进行PCR扩增,并通过限制性片段长度多态性分析进一步对正品鹿茸的种属来源进行确证。结果 通过对特异性片段的PCR扩增,可将梅花鹿茸及马鹿茸与驯鹿、麋鹿、新西兰鹿等伪品鹿茸加以区分,通过对限制性内切酶Msp I 进行酶切后的片段长度进行分析,可进一步区分梅花鹿茸与马鹿茸。结论 本实验建立了一种基于限制性片段长度多态性技术快速、准确的鉴别鹿茸真伪及种属鉴定的方法,为解决中药易混品种难以鉴定的问题提供了又一个新方法。     

药用植物羌活种子DNA条形码鉴定研究

基于ITS2条形码对药用植物羌活种子进行分子鉴定,以确保基原正确。该研究对药用植物羌活种子进行形态特征比较,每份样品进行3次随机取样,对每次取样的单粒种子提取基因组DNA,PCR扩增,双向测序并拼接获得ITS2序列。通过遗传距离法、建树法,并结合中药材DNA条形码鉴定系统(www.tcmbarcode.cn)进行基原鉴定。结果显示,羌活与宽叶羌活种子形态特征相似,难以明显区分。经分子鉴定,27份种子样品有24份样品为2010年版《中国药典》规定的羌活正品基原种子,包括13份羌活种子,11份宽叶羌活种子,另外3份样品不属于羌活基原植物种子。研究证明,DNA条形码技术可以准确鉴别羌活种子基原,为中药材种质资源鉴定提供了新方法,对中药材种子质量标准的建立提供依据。     

基于DNA条形码技术的北柴胡种子分子鉴定

目的:建立基于核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列的北柴胡种子分子鉴定方法,保障北柴胡栽培种子的物种准确。方法:收集北柴胡及主要栽培柴胡属物种种子、市售北柴胡种子样品共59份,探究不同取样量和不同水浴条件对种子DNA提取质量的影响,建立柴胡属种子DNA提取方法;通过聚合酶链式反应(PCR)和双向测序得ITS条形码序列。从GenBank下载34条北柴胡、红柴胡、黑柴胡等主要栽培柴胡属物种ITS序列,丰富北柴胡种子鉴定数据库;利用MEGA-X10. 0. 5进行变异位点分析并构建邻接(NJ)系统发育树,考察ITS序列对北柴胡种子的物种鉴定能力;基于BLAST方法和NJ系统发育树法对市售北柴胡种子进行DNA条形码鉴定。结果:共获得59条北柴胡、红柴胡、三岛柴胡及市售北柴胡种子的ITS序列,北柴胡ITS序列可分为6个单倍型,包含7个变异位点,NJ系统发育树表明北柴胡所有单倍型可形成独立的枝,与所收集样品中其他柴胡属栽培物种可相互区分,具备北柴胡种子物种鉴定能力。基于ITS条形码序列鉴定发现19份市售北柴胡种子中有3份为三岛柴胡,伪品率15. 8%。结论:基于ITS序列的DNA条形码技术可以准确可靠地鉴定北柴胡种子及其易混品,可为我国中药材种子规范化建设提供参考。     

金银花分子生物学研究进展

分子生物学(molecular biology)是从分子水平阐明生命现象和本质的科学,其发展为传统生药学的研究提供了新的生物技术和方法。金银花作为常用大宗药材之一,国内外学者在深入研究传统方法的基础上,采用分子生物学手段对其展开真伪鉴别、品质评价和控制等方面的相关研究,并取得了一定成果。该文主要综述了近年来分子生物学技术方法在金银花鉴别、有效成分生物合成的分子机制以及胁迫条件下次生代谢产物积累的分子机制研究,并针对基于杂交技术的标记(RFLP)、基于PCR的分子标记(RAPD,AFLP,SSR,ISSR)和基于DNA序列分析的SNP及DNA条形码对金银花的多样性识别、诊断、鉴定等方面进行了详细的总结,同时提出可以采用多组学技术,构建系统生物学技术和平台,建立次生代谢产物生物合成的相关模型,从而更好地研究金银花活性成分生物合成的分子机制以及药用植物在环境胁迫下的相关代谢产物的合成和积累等生命活动规律并进行调控,为进一步推动金银花现代化及其他中药资源的开发利用提供支撑与参考。     

珊瑚菜Gl4CL 基因克隆与生物信息学分析

目的：对动物药材DNA提取方法进行优化,利用优化方法提取市售动物药材DNA并进行DNA条形码鉴定。方法：基于SDS法DNA提取原理,比较裂解液中不同EDTA浓度（0.025、0.25、0.5 mol·L-1）、是否含NaCl和Triton X-100等因素对不同用药部位动物药材DNA提取质量的影响,筛选得到最佳裂解液配方;使用优化的裂解液配方提取121份市售动物药材DNA并进行基原物种鉴定。结果：裂解液配方为1 % SDS、0.03 mol·L-1 Tris-HCl、0.25 mol·L-1 EDTA、0.2 mol·L-1NaCl对不同用药部位动物药材DNA提取效果最佳,并可实现对蝉蜕等提取困难样本DNA的提取;利用优化裂解液提取的121份市售动物药材DNA满足中药材分子鉴定后续实验要求,所有市售动物药材均可准确鉴定到基原物种。结论：本研究优化的裂解液配方可用于除壳类、分泌物类、加工品外不同用药部位动物药材的DNA提取,为动物药材分子鉴定提供了技术支持。     

中药鉴定学新技术新方法研究进展

作者对近20年中药鉴定学研究和应用的新技术、新方法进行了综述,介绍和评述了每种技术或方法的原理、特点、应用实例及发展方向,探讨了现有新技术在鉴定中的客观性和准确性。DNA条形码技术鉴定能力较强,在鉴定没有背景信息的中药样品及在方法通用性和可数字化方面具有优势,应用前景广阔。光谱鉴定具有指纹特征性,在中药材及饮片的质量管理和鉴定中具有一定的实用性。显微鉴定新技术、色谱鉴定、特定引物PCR标记鉴定、生物效应鉴定、DNA芯片以及仿生技术等其他技术在特定中药鉴定中将发挥重要作用。