谷氨酸诱导对鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运体的调控

目的 研究底物谷氨酸对视网膜Müller细胞L-谷氨酸和L-天门冬氨酸转运体(GLAST)的调控作用.方法 采用L-3H-谷氨酸摄取分析方法研究底物谷氨酸诱导对GLAST活性影响.并提取细胞总蛋白,采用免疫印迹法分析视网膜Miiller细胞GLAST蛋白质表达量的差异.结果 在培养的鼠视网膜Müller细胞中加入不同浓度的谷氨酸培养30 min后,发现随着底物谷氨酸浓度增加(5～1000 μmol/L),L-3H-谷氨酸的摄取量增加.平均摄取量分别为(3100.7±86.8)、(3247.0±84.2)、(3840.0±118.6)、(4493.7±229.2)、(6429.0±81.5)、(6305.3±31.0)、(6346.3±36.2)cpm·mg-1·ml-1.当谷氨酸浓度为100 μmol/L时,L-3H-谷氨酸摄取量最大.随着谷氨酸浓度的增加,谷氨酸转运体GLAST蛋白质的表达量增加,当谷氨酸浓度为100 μmol/L时,GLAST蛋白质表达量达最大.结论 谷氨酸的底物诱导可增加GLAST摄取活性,且上调GLAST蛋白质的表达.     

转化生长因子α对鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运体调控作用的研究

目的 观察转化生长因子α（TGFα）对鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运体 (GLAST) mRNA、蛋白质表达及摄取活性的调控作用。方法 取出生后7～10 d 的新生昆明小鼠视网膜组织，体外进行Müller细胞的培养。同一原代细胞的第3～4代细胞培养后随机分为2组：①TGFα干预组：分别加入浓度为50、75、125、150 ng/ml的TGFα，每种浓度3孔；②对照组：仍用含20%胎牛血清的Dulbeccon改良Eagle培养基培养。采用L-3H-谷氨酸摄取分析方法观察不同浓度TGFα对Müller细胞GLAST摄取活性的影响；逆转录聚合酶链反应方法分析Müller细胞GLAST mRNA表达的差异；免疫组织化学染色方法检测Müller细胞GLAST蛋白质表达的变化。结果随着TGFα浓度的增加，L-3H-谷氨酸的摄取量及GLAST mRNA表达量均逐渐增加，TGFα浓度为125 ng/ml时，L-3H-谷氨酸的摄取量达到最大值，为对照组的266%，同时GLASTmRNA表达量也达到最大值，为对照组的近4倍。免疫组织化学染色显示当TGFα浓度为125 ng/ml时，干预组Müller细胞内的GLAST蛋白表达量明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 TGFα可通过上调GLAST mRNA和蛋白质的表达增加视网膜Müller细胞谷氨酸转运体GLAST的摄取活性。     

缺氧对视网膜Müller细胞中谷氨酸转运体及未折叠蛋白相关因子XBP1、CHOP表达的影响

目的研究体外缺氧刺激后视网膜Müller细胞是否存在未折叠蛋白反应(unfol-dedprotein reaction,UPR),及其与L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体(glutamate-aspartatetrans-porters,GLAST)的关系。方法出生3～7d大鼠视网膜组织采用胰蛋白酶消化法培养视网膜Müller细胞,氯化钴(CoCl2)200μmol·L-1对视网膜Müller细胞进行体外缺氧干预,干预时间为0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h;UPR诱导剂二硫苏糖醇(DTT)2mmol·L-1刺激视网膜Müller细胞为阳性对照,干预时间为0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h。采用实时荧光定量PCR检测GLAST与UPR相关因子X盒结合蛋白1、C/EBP同源蛋白的表达并分析其相关性。结果视网膜Müller细胞鉴定:细胞免疫荧光染色示90%以上细胞GS、GLAST表达阳性;流式细胞仪检测结果:Müller细胞的GLAST表达阳性率为(84.66±3.51)%。缺氧刺激后,GLAST与X盒结合蛋白1、C/EBP同源蛋白在Müller细胞上均有表达,缺氧早期呈上升趋势,干预后24h表达最强,后呈下降趋势。DTT干预组表达趋势与缺氧干预组一致。结论体外缺氧刺激后视网膜Müller细胞存在UPR,其相关因子的变化与GLAST的变化趋势一致,提示UPR可能是调控GLAST变化的原因之一。     

牛磺酸对高糖刺激大鼠视网膜Müller细胞GLAST和GS表达的影响

目的:通过检测牛磺酸对高糖刺激大鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运蛋白(glutamate-aspartate transporters,GLAST)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)表达的影响,探讨牛磺酸保护糖尿病引起视网膜损伤的机制。方法:高糖培养大鼠视网膜Müller细胞,分正常对照组(NC)、高糖组(high glucose,HG,25mmol/L)、高糖 0.1mmol/L牛磺酸(taurine,T)干预组(HG 0.1T)、高糖 1mmol/L牛磺酸干预组(HG 1T)、高糖 10mmol/L牛磺酸干预组(HG 10T)。用免疫荧光化学法和Western-blotting检测大鼠视网膜Müller细胞中GLAST和GS的表达。结果:高糖培养后,大鼠视网膜Müller细胞中GLAST和GS的表达明显减少(P<0.05),与高糖组相比,1mmol/L和10mmol/L牛磺酸干预可明显增加GLAST和GS的表达(P<0.05)。结论:牛磺酸增加Müller细胞中GLAST和GS的表达抑制糖尿病引起的视网膜Müller细胞功能改变。     

牛磺酸对高糖刺激大鼠视网膜Müller细胞GLAST和GS表达的影响

目的:通过检测牛磺酸对高糖刺激大鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运蛋白(glutamate-aspartate transporters,GLAST)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)表达的影响,探讨牛磺酸保护糖尿病引起视网膜损伤的机制。方法:高糖培养大鼠视网膜Müller细胞,分正常对照组(NC)、高糖组(high glucose,HG,25mmol/L)、高糖+0.1mmol/L牛磺酸(taurine,T)干预组(HG+0.1T)、高糖+1mmol/L牛磺酸干预组(HG+1T)、高糖+10mmol/L牛磺酸干预组(HG+10T)。用免疫荧光化学法和Western-blotting检测大鼠视网膜Müller细胞中GLAST和GS的表达。结果:高糖培养后,大鼠视网膜Müller细胞中GLAST和GS的表达明显减少(P<0.05),与高糖组相比,1mmol/L和10mmol/L牛磺酸干预可明显增加GLAST和GS的表达(P<0.05)。结论:牛磺酸增加Müller细胞中GLAST和GS的表达抑制糖尿病引起的视网膜Müller细胞功能改变。     

糖尿病视网膜Müller细胞GLAST功能变化的研究进展

糖尿病引起的视网膜神经功能异常可能先于血管损伤,引起这一改变的最主要原因是视网膜细胞外谷氨酸的大量蓄积,持久激活谷氨酸受体以及损伤视网膜神经元。细胞外谷氨酸的蓄积可能与视网膜Müller细胞L-谷氨酸/L-天冬氨酸转运体(GLAST)功能下降有关,致使细胞外的谷氨酸不能及时转运到Müller细胞内。本文就Müller细胞GLAST的作用机制及在糖尿病状态下功能的变化进行综述。     

色素上皮衍生因子对糖尿病大鼠视网膜谷氨酸代谢的影响

目的 观察色素上皮衍生因子(PEDF)对糖尿病大鼠视网膜谷氨酸代谢的影响.方法 Sprague_Dawley大鼠78只,分为模型组、模型对照组、PEDF干预组(干预组)、干预对照组,实验结束时去除血糖恢复鼠和实验期间死亡鼠,每组以12只大鼠作为统计样本.模型组、干预组、干预对照组大鼠采用链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型.模型组大鼠不作任何干预,模型对照组为相同月龄的正常大鼠.干预组大鼠左眼玻璃体腔注射0.1 μg/μl的PEDF 5.0μl,干预对照组大鼠左眼玻璃体腔注射相同容积的磷酸盐缓冲液.采用蛋白免疫印迹法(Western bolt)和实时荧光聚合酶链式反应(PCR)法检测视网膜L-谷氨酸-L-门冬氨酸转运体(GLAST)表达的变化,高压液相色谱法(HPLC)观察视网膜谷氨酸的含量变化.将体外培养的大鼠视网膜Müller细胞随机分为对照组、实验组、PEDF干预组(干预组)和干预对照组,荧光免疫法和实时荧光PCR法检测Müller细胞GLAST表达的改变,根据[3H]标记的D,L-谷氨酸摄入量判断Müller细胞的摄取功能.结果 实时荧光PCR法和Western bolt检测结果显示,相对于模型对照组大鼠,模型组大鼠视网膜GLAST表达降低(实时荧光PCR法:t=8.86,P＜0.01;Western blot:t=3.42,P＜0.05),视网膜谷氦酸含量升高(t=4.01,P＜0.05);干预组大鼠视网膜GLAST表达与干预对照组视网膜GLAST表达比较,干预组大鼠视网膜GLAST的表达升高(实时荧光PCR法:t=3.56,P＜0.05;Western blot:t=3.52,P＜O.05);视网膜谷氨酸含量下调(t=4.36,P＜0.05).实时荧光PCR法和荧光免疫法检测结果显示,高糖可以降低视网膜Müller细胞GLAST的表达(实时荧光PCR法:t=3.48,P＜O.05;荧光免疫法:t=4.72,P＜O.05);[3H]标记的D,L-谷氨酸摄人量结果显示,高糖可以下调视网膜Mü1ler细胞GIAST的功能(t=3.81,P＜0.05);经PEDF处理后,可以明显改善高糖状态下视网膜Müller细胞GLAST的表达(实时荧光PCR法:t=6.82,P＜O.01;荧光免疫法:t=3.72,P＜0.05)和对谷氨酸的摄取功能(t=4.14,P＜0.05).结论 PEDF可通过改善糖尿病大鼠视网膜Müller细胞中GLAST功能从而改善谷氨酸循环,抑制神经节细胞的死亡.

Abstract：

Objective To observe the effect of pigment epithelium-derived factor(PEDF)on glutamate metabolism in diabetic rat retina.Methods 78 Sprague-Dawley rats were randomly divided into the model group,model control group,PEDF intervention group and intervention control group.There were some dead and euglycemia rats at the end of experiment,so only 12 rats in each group were included in the statistical analysis.The diabetic retinopathy rat model of the model,PEDF intervention and intervention control group were induced with streptozotocin injection.The rats in the model group were not intervened.The monthly-age matched normal rats of model group were in the model control group.The left eyes of rats were received intravitreal injection with 5μl(0.1μg/μl)PEDF(PEDF intervention group)or 5μlphosphate buffer solution(intervention control group).The expressions of L-glutamate/L-aspartate transporter in retina were analyzed by western blot and real time RT-PCR techniques and glutamate content in retina was analyzed by high-pressure liquid chromatography(HPLC).Cultured rat Mailer cells were divided into the control,experimental,PEDF intervention and intervention control group,GLAST expressions were detected by fluorescence immunofluorescence and real-time RT-PCR techniques.The glutamate up-take activity of Müller cells was determined by intracellular[3H] labeled D,L-glutamate concentration with scintillation counting.Results Western blot and real-time RT-PCR showed that GLAST expression decreased(real-time RT-PCR:t=8.86,P＜0.01;Western blot:t=3.42,P＜0.05).glutamate content increased(t=4.01,P＜0.05)in model group compared with the model control group:GLAST expression increased(real-time RT-PCR:t=3.56,P＜0.05;Western blot:t=3.52,P＜0.05),glutamate content decreased(y=4.36,P＜0.05)in the PEDF intervention group compared with the intervention control group.Real-time RT-PCR and fluorescence immunofluorescenee showed that high glucose down-regulate GLAST expressions in Müller cells(real-time RT-PCR:t=3.48,P＜0.05;fluorescence immunofluoreseence:t=4.72,P＜0.05)and impair glutamate up-take activity of Müller cells(t=3.81,P＜0.05).Under high glucose conditions,PEDF up-regulated GLAST expression significantly(real-time RT-PCR:t=6.82,P＜0.01;fluorescence immunofluorescence:t=3.72,P＜0.05)and ameliorated the glutamate up-take activitv of Mailer cells(t=4.14,P＜0.05).Conclusions In diabetic rats,PEDF may improve the activitv of GLAST in Müller cells,thus ameliorate retinal glutamate metabolism and inhibit death of retinal ganglion cells.     

花色苷对高糖培养的视网膜Müller细胞L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体表达的影响

目的 观察花色苷对体外高糖培养的视网膜Müller细胞L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体(GLAST)表达的影响.方法 取出生后10 d的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠视网膜组织,体外原代培养Müller细胞.第2～4代细胞用于实验.将实验分为正常对照组(A组)、高糖对照组(B组)、高糖+30 μmol/L花色苷组(C组)、高糖+60 μmol/L花色苷组(D组)、高糖+100μmol/L花色苷组(E组)进行.采用噻唑蓝比色法(MTT)测定波长570 nm处的吸光度[A,旧称光密度(OD)]值,以各组A值计算细胞相对存活率.采用免疫蛋白印迹法(Western blot)检测各组大鼠视网膜Müller细胞上GLAST的蛋白表达.结果 MTT检测显示,A、B、C、D、E组A值分别为0.450 8±0.020 4、0.270 1±0.031 4、0.332 0±0.023 2、0.428 3±0.017 2、0.361 9±0.027 0,细胞相对存活率分别为100.0%、59.9%、73.6%、95.0%、80.3%.其中,C、D、E组A值均较B组增高,差异有统计学意义(F=32.25,P＜0.05);D组A值较C、E组显著增高,差异也有统计学意义(F=21.07,P＜0.05).Western blot检测显示,B组大鼠视网膜Müller细胞的GLAST蛋白表达较A组降低,差异有统计学意义(t=5.25,P＜0.05);A、C、D、E组间大鼠视网膜Müller细胞的GLAST蛋白表达无明显变化,差异无统计学意义(F=2.979,P＞0.05).结论 花色苷可逆转高糖引起的Müller细胞GLAST蛋白表达下降.

Abstract：

Objective To observe the effect of cyanin on the expression of L-glutamate/ L-aspartate transporter (GLAST) in high glucose cultured retina Müller cells. Methods The retinal tissue of SpragueDawley (SD) rats was collected at postnatal 10 day, and Müller cells were isolated and cultured according to literature. The Müller ceils (2nd-4th generations) were treated with five different medium as normal group (group A), high glucose control group (group B), high glucose+30 μmol/L cyanin group (group C), high glucose+60 μmol/L cyanin group (group D) and high glucose+100 μmol/L cyanin group (group E). Cell relative survival rates (A value) were measured by MTT assay at 570 nm. The GLAST protein expression in M011er cells was observed by Western blot. Results MTT assay showed that the A value of the five group were 0. 450 8±0. 020 4, 0. 270 1±0. 031 4, 0. 332 0±0. 023 2, 0. 428 3±0. 017 2, 0. 361 9±0. 027 0,the cell relative survival rate were 100. 0%, 59. 9%, 73.6%, 95%, 80.3% respectively. The A value of group C, D, E were significantly higher than that of group B (F=32.25, P<0.05), the A value of group D were significantly higher than that of group C and E (F=21.07, P<0. 05). Western blot showed that the GLAST protein expression of group B was lower than that of group A (t=5.25, P<0. 05) ; there was no obvious changes of GLAST protein expression in group A, C, D and E (F= 2. 979, P>0.05).Conclusion Cyanin can rescue high glucose-induced GLAST reduction.     

抑制JAK/STAT信号通路对糖尿病早期大鼠视网膜Müller细胞的保护作用及对谷氨酸转运蛋白表达的影响

目的　探讨JAK/STAT信号通路对糖尿病早期大鼠视网膜Müller细胞及对谷氨酸转运蛋白（glutamate transporter，GLAST）表达的影响。方法　雄性SD大鼠30只，随机分成对照组、糖尿病组、AG490组，每组10只。后两组大鼠采用单次腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ） 50 mg·kg^-1诱导糖尿病模型。模型诱导成功后，AG490组给予AG490 10 μL（17 mmol·L^-1）玻璃体内注射给药。注射1个月后，利用试剂盒检测3组大鼠视网膜中谷氨酸含量变化，免疫荧光检测视网膜GLAST表达，免疫组织化学检测视网膜p-JAK2表达，Western blot检测视网膜GLAST、p-JAK2及p-STAT3蛋白相对表达量。结果　与对照组GLAST相对表达量（65.35±0.66）%、p-JAK2相对表达量（32.80±0.40）%、p-STAT3相对表达量（17.62±1.09）%、谷氨酸含量（23.93±0.67）μmol·g^-1相比，糖尿病组视网膜p-JAK2相对表达量（52.16±0.62）%、p-STAT3相对表达量（47.41±0.95）%及谷氨酸含量（44.88±0.27）μmol·g^-1均明显增加，GLAST相对表达量（32.96±0.64）%明显下降（均为P<0.01）；而与糖尿病组相比，AG490组p-JAK2相对表达量（13.67±0.45）%、p-STAT3相对表达量（14.47±0.25）%及谷氨酸含量（25.18±0.66） μmol·g^-1均明显降低，GLAST相对表达量（49.48±0.32）%明显增加（均为P<0.01）。结论　糖尿病早期大鼠视网膜GLAST表达明显降低，抑制JAK/STAT通路的活化可上调视网膜GLAST表达，降低视网膜谷氨酸含量，这可能有助于减轻糖尿病状态下视网膜Müller细胞的损伤。     

脑源性神经营养因子对小鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运体表达的调控

谷氨酸是视网膜主要的兴奋性神经递质,然而在病理性浓度升高时,对视网膜神经节细胞(RGC)具有兴奋毒性作用[1].L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体(GLAST)是表达在视网膜Müller细胞上最主要的谷氨酸转运体[5],在维持谷氨酸平衡和保护RGC免受谷氨酸兴奋毒性作用中发挥着重要作用[3].     

脑源性神经营养因子（BDNF）对高糖环境下视网膜Müller细胞的保护作用

目的　探讨脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）对高糖环境下视网膜Müller细胞的保护作用。方法　该研究实验分为3组,对照组、高糖组（对照组中添加25 mmol·L^-1葡萄糖）、BDNF组（高糖组添加100 mg·L^-1 BDNF）,实验干预24 h后,在倒置显微镜下观察各组细胞形态和生长状态,并进行各项指标检测。用倒置荧光显微镜观察各组视网膜Müller细胞的生长状态并检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）荧光强度;流式细胞仪检测视网膜Müller细胞凋亡率,Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达情况。结果　与对照组相比,高糖组Müller细胞生长状态差,细胞突起减少,细胞失去原有形态,由原来的不规则形变为类圆形,折光性增强;而BDNF组与对照组相比无明显差异;与高糖组相比,BDNF组细胞生长状态明显改善,细胞突起增多,细胞折光性减弱。与对照组相比,高糖组Müller细胞内ROS含量显著升高（P<0.01）,BDNF组细胞内ROS含量亦升高（P<0.01）;与高糖组相比,BDNF组ROS含量显著减少（P<0.01）。与对照组相比,高糖组细胞凋亡率显著升高（P<0.01）,BDNF组凋亡率仍高于对照组（P<0.01）;与高糖组相比,BDNF组凋亡率明显减少（P<0.01）。与对照组相比,高糖组Bcl-2蛋白相对表达量显著减少,Bax蛋白相对表达量明显升高,Bcl-2/Bax二者比值降低（P<0.01）,BDNF组与对照组相比相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）;与高糖组相比,BDNF组Bcl-2蛋白相对表达量明显升高,Bax蛋白表达减少,Bcl-2/Bax比值升高（P<0.01）。结论　高糖环境能诱导视网膜Müller细胞凋亡,而给予外源性BDNF能够显著抑制高糖环境诱导的视网膜Müller细胞凋亡,对视网膜Müller细胞起到保护作用。     

FK506对高糖培养视网膜Müller细胞血管内皮生长因子表达的抑制作用

背景 视网膜M＆#252;ller细胞可通过表达血管内皮生长因子（VEGF）参与糖尿病视网膜病变（DR）的病理过程.FK506可抑制实体肿瘤及实验性角膜新生血管中VEGF的表达,但其对视网膜M＆#252;ller细胞中VEGF的表达是否有抑制作用鲜见文献报道.目的 观察FK506对高糖培养的大鼠视网膜M＆#252;ller细胞表达血管内皮生长因子（VEGF）的影响.方法 将大鼠永生化视网膜Müller细胞系进行常规培养并将对数生长期的Müller细胞分别接种到96孔培养板中,分别在培养液中加入800.00、400.00、200.00、100.00、75.00、50.00、25.00、12.50和6.25 pg/ml FK506 100 μl/孔（细胞密度为1×10^4个/ml）,MTT比色法确定Müller细胞半数抑制浓度（IC50）的最适FK506质量浓度.将大鼠视网膜Müller细胞系分为正常对照组、FK506组、高糖组和高糖＋ FK506组,分别用高糖DMEM培养液（含50 mmol/L D-葡萄糖）和正常DMEM培养基（含5.5 mmol/L D-葡萄糖）进行培养,并分别在培养基中加入FK506,至质量浓度为75 pg/ml.ELISA法检测培养细胞上清液中VEGF的质量浓度;分别采用逆转录PCR（RT-PCR）和Western blot法检测各组大鼠视网膜Müller细胞中VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量,分别以目的基因与内参β-actin吸光度（A）比值和灰度比值表示.结果 光学显微镜下正常对照组、FK506组、高糖组及高糖＋Fk506组培养12、24、48 h的大鼠视网膜Müller细胞均呈多角形,大小一致.致大鼠视网膜Müller细胞IC50的FK506质量浓度为75 pg/ml.正常对照组、FK506组、高糖组和高糖＋FK506组细胞上清中VEGF蛋白的质量浓度分别为（966.46±13.59） pg/ml、（1 059.42±67.43） pg/ml、（16 243.11±3 926.38）pg/ml和（9 467.25±1 525.56） pg/ml,总体差异有统计学意义（F=20.51,P=O.00）,其中高糖组细胞上清中VEGF的质量浓度明显高于正常对照组,差异有统计学意义（P=0.00）;高糖＋FK506组较高糖组细胞上清中VEGF的质     

羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞表皮生长因子受体表达的影响

目的研究羊膜对兔视网膜Müller细胞表皮生长因子受体（EGFR）表达的影响及其机制。方法取出生15d新西兰白兔视网膜Müller细胞进行原代培养及传代,采用神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S-100进行细胞鉴定。0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA酶消化取第3代Müller细胞,实验组加0.5mL羊膜匀浆上清液继续培养12h,采用免疫组织化学法检测羊膜诱导和非诱导条件下兔视网膜Müller细胞EGFR表达的变化并进行分析。结果培养的兔视网膜Müller细胞GFAP和S-100表达阳性,透射电镜检查细胞质内可见8～10nm的中间丝。未经羊膜诱导的视网膜Müller细胞EGFR有少量表达,经羊膜诱导12h后,EGFR表达明显增多,2组灰度值分别为571588.80±67862.68和1000352.00±98386.22,差异有统计学意义（t=4.035,P〈0.01）。结论经羊膜诱导后可促进培养的兔视网膜Müller细胞EGFR的表达。     

视网膜Müller细胞谷氨酸转运体及其功能调节

谷氨酸的兴奋毒性是造成视网膜神经节细胞损伤和死亡的主要因素之一,而谷氨酸转运体对维持细胞外谷氨酸水平起重要作用.GLAST是表达在Müller细胞膜上的一种重要的谷氨酸转运体,其在分子和蛋白质水平上的调节方式可能为酶底物-诱导的负反馈调节.     

重组人促红细胞生成素对高糖视网膜Müller细胞谷氨酰胺合成酶表达的影响

目的 观察体外培养大鼠视网膜Müller细胞在高糖培养环境下谷氨酰胺合成酶(GS)的表达变化,探讨重组人促红细胞生成素(rhEPO)对其表达的影响及作用机制.方法 出生后3～5 d新生Sprague-Dawley大鼠10只,摘除眼球分离视网膜,经胰酶消化后分离纯化视网膜Müller细胞.并将其随机分为正常对照组、高糖培养组、高糖+5U/ml rhEPO组、高糖+10 U/ml rhEPO组、高糖+20 U/mlrhEPO组、高糖+40 U/ml rhEPO组.48 h后原位缺口末端标记法检测高糖及不同浓度rhEPO对视网膜Müller细胞凋亡的影响;免疫细胞化学法半定量检测高糖组在不同浓度rhEPO干预下视网膜Müller细胞GS蛋白的表达水平.结果 与正常对照组比较,高糖培养组视网膜Müller细胞活性下降,细胞大量凋亡,GS蛋白表达下降,差异有统计学意义(t=27.4,P＜0.0l).与高糖培养组比较,不同浓度rhEPO处理组凋亡细胞随着rhEPO浓度的增加显著性减少,差异有统计学意义(t=857.2、2 374.6、2 473.2、2 537.7,P＜0.01),GS蛋白的表达显著性升高,差异有统计学意义(t=3.2、18.0、22.5、26.4,P＜0.05).结论 rhEPO对高糖作用下视网膜Müller细胞的凋亡具有保护作用,并可上调高糖损伤细胞内下降的GS蛋白表达水平;促进谷氨酸循环,有效降低高浓度谷氨酸的兴奋性毒性作用,可能是其抗高糖损伤的保护机制之一.     

热休克蛋白70在视网膜神经元和Müller细胞中的诱导及其保护作用

目的评价大鼠视网膜神经元(RNs)和Müller细胞中热休克蛋白(HSP)70的诱导表达,及其对低糖和谷氨酸损伤的视网膜神经元的保护作用. 方法大鼠RNs和Müller细胞体外培养体系分别经过热休克处理(42℃下1 h)及免疫细胞化学法检测HSP70表达的时间经过;并对RNs进行低糖(0.56 mmol/L葡萄糖,作用6 h)和谷氨酸(100 μmol/L,作用 6 h)兴奋毒性损伤,四唑盐(MTT)比色法评价细胞存活能力,同时用HSP70抗体阻断其表达. 结果热休克后大鼠RNs和Müller细胞中HSP70高效表达;经热休克预处理,RNs在低糖和谷氨酸盐损伤后的细胞活力明显提高,该现象可被HSP70抗体阻断. 结论热休克能够诱导RNs和Müller细胞高效表达HSP70,从而增强RNs对低糖和谷氨酸兴奋毒性损伤的耐受能力.     

色素上皮衍生因子对高糖环境下视网膜Müller细胞钾离子通道Kir4.1的调控

目的 探讨高糖环境下视网膜Müller细胞钾离子通道Kir4.1的表达改变及色素上皮衍生因子(PEDF)对Kir4.1的调控及可能机制.方法 培养的大鼠Müller细胞随机分为对照组、高糖组、PEDF干预组和干预对照组.其中,对照组使用5 mmol/L葡萄糖的培养液,高糖组使用25 mmol/L葡萄糖的培养液,PEDF干预组在25 mmol/L葡萄糖的培养液中加入100 ng/ml PEDF,干预对照组在25 mmol/L葡萄糖的培养液中只加入相同容积的磷酸缓冲盐溶液.通过蛋白免疫印迹法和实时荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组Müller细胞Kir4.1表达的改变,同时采用二氯二氢荧光素二已酯荧光法检测各组细胞中氧自由基(ROS)生成;实时荧光RT-PCR法检测脂质过氧化物酶(GPx)的表达变化.结果 蛋白免疫印迹法和实时荧光RT-PCR法检测结果提示,高糖可以降低视网膜Müller细胞Kir4.1的表达(蛋白免疫印迹法:t=3.53,P＜0.05;实时荧光RT-PCR法:t=4.12,P＜0.05),同时引起ROS生成增多(t=3.76,P＜0.05)以及GPx表达下降(t=3.18,P＜0.05).PEDF处理后,高糖状态下视网膜Müller细胞的Kir4.1表达显著上升(蛋白免疫印迹法:t=6.43,P＜0.01;实时荧光RT-PCR法:t=3.66,P＜0.05),同时使ROS浓度下降及GPx表达升高(t=4.11,P＜0.05;t=5.12,P＜0.01).结论 高糖可以通过诱发氧化应激从而使Müller细胞Kir4.1的表达下调,PEDF能改善由高糖诱发的这一变化.     

高糖对体外培养的视网膜Müller细胞表达蛋白转录活化因子4的影响

目的 观察高糖对体外培养的视网膜Müller细胞表达蛋白转录活化因子4(ATF4)的影响.方法 组织块悬浮法体外原代培养Sprague-Dawley(SD)大鼠视网膜Müller细胞,用链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物(SABC)法对Müller细胞进行神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及谷氨酰胺合成酶(GS)的鉴定.将培养的视网膜Müller细胞分为正常对照组和A、B、C组,正常对照组使用5.5 mmol/L葡萄糖培养液,A、B、C组分别使用20.0、30.0、40.0 mmol/L葡萄糖培养液进行.培养4d后,蛋白免疫印迹(Western blot)法检测各组视网膜Müller细胞上ATF4蛋白的表达.结果 体外培养的细胞均为视网膜Müller细胞,95％以上细胞染色呈GFAP及GS阳性.A、B、C组视网膜95％的Müller细胞呈阳性.Western blot检测显示,4d后A、B、C组Müller细胞表达ATF4蛋白的量均较正常对照组升高,组间比较,差异有统计学意义(q＝0.293、0.754、0.484,P＜0.05).结论 高糖能促使体外培养下的视网膜Müller细胞表达内质网应激蛋白ATF4增加,高糖培养下的视网膜Müller细胞可发生内质网应激反应.     

视网膜Müller细胞与谷氨酸代谢

视网膜Müller细胞作为重要的星形胶质细胞,在维持视网膜正常功能方面具有重要的作用,在病理状态下也可以通过蛋白表达、反应性胶质增生、谷氨酸(glutamate,Glu)转运体的表达、谷氨酰胺合成酶的改变和分泌神经营养因子等途径对Glu代谢进行干预,从而起到保护视网膜神经元免受Glu神经性毒性损伤的作用.     

脑源性神经营养因子对小鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运体表达的调控

谷氨酸是视网膜主要的兴奋性神经递质,然而在病理性浓度升高时,对视网膜神经节细胞(RGC)具有兴奋毒性作用[1].L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体(GLAST)是表达在视网膜Müller细胞上最主要的谷氨酸转运体[5],在维持谷氨酸平衡和保护RGC免受谷氨酸兴奋毒性作用中发挥着重要作用[3].