两种表达鼠精子受精素β蛋白的减毒沙门氏菌疫苗株的稳定性分析

目的 了解表达鼠精子抗原受精素β亚单位(Fertilin βsubumit,fβ)的两种重组减毒沙门氏菌疫苗株X4632(pFEC)和X4550(pFEC)的生长特性和体内外携带重组质粒的稳定性。方法 将两种重组沙门氏菌疫苗株X4632(pFEC)和X4550(pFEC)体外传代培养，观察比较其生长特性和所含重组质粒的稳定性；将该两种重组菌口服免疫BAIB／c雄性小鼠，观察重组菌侵入小鼠Peyer结、肠系膜淋巴结和脾脏等组织内繁殖生长情况和所回收重组菌携带质粒的阳性率。结果 该两种无抗药性的重组菌株在体内、外营养选择压力下均可较稳定携带重组质粒传代繁殖，X4550(pCFL)在体内可较稳定地定植于Peyer结、肠系膜淋巴结和脾脏；X4632(pCFL)可较稳定地定植于Peyer结，均可稳定表达被Fβ单抗识别的重组Fβ蛋日。结论 X4632(pFEC)、X4550(pFEC)疫苗株可作为递呈精子抗原的活菌载体。     

一种精子蛋白嵌合肽的实验研究

目的：探讨可供两性使用的免疫避孕疫苗的可能性。方法：设计含有小鼠精子／睾丸特异性抗原SP17,Cyritestin中特异性氨基酸序列的新抗原35肽,经合成,鉴定及纯化后,免疫雌性Balb/C小鼠,并了解其免疫原性,同时观察其抗生育效应。结果：获得的新抗原35肽经质谱鉴定证实其合成正确,经高压液相色谱（KPLC）纯化后纯度达95％以上,嵌合肽与钥孔血蓝蛋白（KLH）偶联后免疫小鼠获得的特异性抗血清可识别小鼠,大鼠及人睾丸组织蛋白提取物中相对分子质量的蛋白质,与等量弗氏佐剂混悬后免疫小鼠,其血清中特异性IgG抗体滴度最高达1：6000,阴道粘膜冲洗液中特异性IgA抗体滴度最高达1：300,免疫后小鼠受孕率降至61．11％,平均每胎产仔量也减至4．3只,结论：新抗原35肽可在雌性Balb/C小鼠体内激发出较强的特异怀体液和粘膜免疫,使小鼠受孕率和每胎产仔数明显下降。     

精子抗体的检测及其临床意义

在已婚生育力正常的男性和女性,血液、精液或宫颈液中并无精子抗体;若在男、女任何一方的上述标本中测出精子抗体则可能造成免疫性不育;早在1932年Baskin用5～10毫升新鲜精液对20名妇女进行皮下注射,     

抗人精子膜80KD蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的：探索避孕疫苗的制作并为不育病人提供抗精子抗体的诊断方法。方法：用0．5％NP－40提取经SDS－PAGE电泳分离纯化获得的人精子膜80KD蛋白免疫BALB／C小鼠,取其脾细胞与SP2／0小鼠骨髓瘤细胞融合,获得12株阳性单克隆细胞株,并对其中4株进行了初步鉴定。结果：免疫双散法结果显示,3株为IgG型,1株为IgM型;免疫荧光定位试验显示4株单克隆抗体主要与人精子顶体后、颈和尾中段结合;Western blot试验结果显示,4株单克隆抗体均识别人精子80KD蛋白。结论：4株单克隆抗体对人精子膜80KD蛋白是特异的。     

精子顶体膜蛋白的研究

目的：研究提取和纯化与人卵透明带(HZP)作用更为密切的人精子膜蛋白，为改进精子包被抗原的制备方法和筛选避孕疫苗抗原提供科学依据。方法：①悬浮离心法制备人精子膜蛋白混合溶液；②卵子热溶透析法制备HZP溶液；③将人精子膜蛋白混合溶液进行SDS-PAGE电泳，然后全胶电洗脱分别收集蛋白溶液30管；④梅花孔葡聚糖凝胶试验及精卵结合体外实验鉴定出阳性管；⑤以阳性管内的HZP特异精子膜蛋白溶液包被抗原进行抗精子抗体(AsAb)检测。结果：SDS-PAGE电泳、梅花孔葡聚糖凝胶试验及精卵结合体外实验证实，与HZP结合的人精子膜蛋白有多种成分；全胶电洗脱后以第14管内成分之特异性最强，与标准蛋白分子量对照，其分子量范围为48～53kD。结论：以电洗脱转移法纯化、筛选的人精子膜蛋白是特异的，与HZP具极强相关性；以该精子膜蛋白包被抗原用于检测AsAb，其灵敏度更高，交叉反应会明显减少。     

哺乳动物精卵融合相关的精子膜蛋白研究进展

哺乳动物的受精是由一系列精卵质膜的相互作用而触发的,这些相互作用的基本过程包括:精卵识别、精卵结合和精卵质膜融合[1].其中精卵质膜融合是受精过程最为关键的步骤.精卵质膜融合是一个高度程序化的过程,完成顶体反应是精子发生质膜融合的必要前提.精子膜的不均一性导致融合的起始位点局限于特定的区域.现阶段普遍认为精卵融合开始于精子赤道区,探索精卵质膜融合相关的精子膜蛋白是研究精卵融合过程中一个极为重要的环节.     

精子蛋白17的研究进展

<正>精子蛋白17(sperm protein 17,Sp17)是一种高度保守的睾丸组织特异性蛋白,与在卵细胞透明带上的乙酰肝素糖基进行结合,参与顶体反应,促进受精过程[1]。近年来,Sp17作为一癌瘤—睾丸(CT)抗原,其作为肿瘤疫苗的前景被广泛研究     

抗人精子单克隆抗体对生殖的影响

本文报告9株抗人精子单克隆抗体在体外对生殖的影响。TAT、SIT、SCMC和精子—地鼠去透明带穿卵实验表明:3株IgM类抗人精子单克隆抗体主要引起精子的头—头凝集,对精子有较强的补体依赖性细胞毒作用;6株IgG类抗人精子单克隆抗体主要引起精子的尾—尾凝集,并能阻止精子在宫颈粘液中的前向性运动;4/9株抗人精子单克隆抗体对精子穿卵有明显抑制作用,且两株联合应用有协同效应,提示有效而可靠的精子避孕疫苗应具有多个抗原决定簇。     

重组鼠Muc1-MBP融合蛋白疫苗体内抗肿瘤作用

目的：研究重组鼠Muc1-MBP蛋白的体内抗肿瘤作用.方法：采用皮下注射法将不同剂量Muc1-MBP蛋白免疫小鼠,2wk/次,共免疫3次.在第3次免疫后4d,给予C57BL/6小鼠尾静脉注射LLC1细胞,或给予5GyX射线照射的ICR小鼠背部皮下注射MCF-7细胞.注射3wk后剥离并测量肿瘤大小;肿瘤组织行常规HE染色.免疫组织化学染色分析肿瘤周围浸润的淋巴细胞亚群.结果：LLC1细胞尾静脉接种后21d,肺肿瘤结节对照组,Muc1-MBP0.15g/L组小鼠分别为54和39个（100%）,Muc1-MBP0.3g/L组小鼠共计17个（60%）,提示Muc1-MBP0.3g/L组可显著抑制肺癌的生长（P〈0.05）,Muc1-MBP0.15g/L组作用较弱.皮下接种MCF-7细胞后21d,对照组,Muc1-MBP0.15g/L组小鼠100%（6/6）可见乳腺癌瘤体形成,平均体积分别为（142.8±70.2）和（96.1±53.4）mm3,Muc1-MBP0.3g/L组瘤体形成66.7%（4/6）,平均体积为（54.5±46.7）mm3.表明Muc1-MBP0.3g/L组免疫后可显著抑制人乳腺癌移植瘤生长（P〈0.05）,Muc1-MBP0.15g/L组作用较弱.免疫组化结果显示Muc1-MBP免疫组肿瘤周围有大量CD4＋和CD8＋T的细胞浸润到肿瘤周围.结论：Muc1-MBP诱导免疫能够明显抑制LLC1,MCF-7细胞的生长,为临床应用研究奠定了基础.     

多价精子抗原表位肽的设计与免疫效应研究

目的 开发可供两性使用的多价合成嵌合肽疫苗。方法 选择小鼠精子／睾丸特异性抗原SP17、Cyritestin中特异性氨基酸序列与牛核糖核酸酶非限制性T细胞表位作为骨架，按一定连接方式设计、合成新抗原35肽，并与弗氏佐剂混悬后免疫雌性BALB／C小鼠。结果 在430A固相自动肽合成仪上成功地合成35肽，并经HPLC纯化、质谱鉴定证实其纯度达95％以上；免疫后小鼠血清特异性IgG抗体滴度最高达1：6000，阴道粘膜冲洗液中特异性IgA抗体滴度最高达1：300；小鼠脾脏淋巴细胞增殖率达50％左右，淋巴细胞分泌的INF－γ和IL－4分别为60、108μg/ml；实验组BALB／c雌鼠妊娠率平均降至60％，每胎产仔数平均降低58％－71％。结论 含有两种特异性精子抗原中特异性氨基酸序列的新抗原可激发小鼠产生较理想的特异性体液免疫和粘膜免疫，并使小鼠受孕率下降，为研制适宜于两性的多价抗生育疫苗提供了实验基础。     

西尼罗河病毒preM/EⅢ融合蛋白特异性单克隆抗体的制备以及应用分析

目的制备针对西尼罗河病毒preM/EⅢ融合蛋白特异性单克隆抗体,并分析其在临床检测中的应用价值。方法采用原核表达系统表达西尼罗河病毒preM/E融合蛋白,作为抗原,免疫BALB/c小鼠,按常规单克隆抗体技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,采用有限稀释法筛选能稳定分泌抗preM/EⅢ单抗的杂交瘤细胞株。接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔,抽取腹水纯化单克隆抗体。采用间接ELISA和Western blotting对抗体特异性和效价进行分析,并对临床样本进行检测。结果获得了1株能稳定分泌preM/EⅢ蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为ME1。纯化后抗体效价为10-6,其亚类为IgG1。ME1单抗能与西尼罗病毒preM/EⅢ蛋白以及西尼罗病毒发生特异性反应,而与日本脑炎病毒(JEV)、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)、黄热病毒(YFV)和登革热病毒(DENV)无交叉反应。临床诊断准确率为97.78%。结论 ME1单克隆抗体具有较高的特异性,临床诊断准确性较高,具有临床应用价值。     

人血管生成素相关蛋白2单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备人血管生成素相关蛋白2(angiopoietin-related protein 2,ARP2)的单克隆抗体.方法:用RT-PCR方法获取人脾脏组织ARP2基因序列,构建pET32a-ARP2,经电穿孔导入大肠杆菌诱导表达,获得可溶蛋白样品和包涵体蛋白样品,回收、纯化蛋白,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立产生ARP2抗杂交瘤细胞株,Western印迹鉴定.结果:获得融合蛋白的相对分子质量为570 000,与理论计算值相符,纯化后蛋白浓度＞90%,杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:104,腹水抗体效价为1:107～1:108,抗体亚型为IgG2a类,Western印迹示目的蛋白相对分子质量为570 000,免疫组化显示该抗体能特异结合人ARP2.结论:制备的抗ARP2单克隆抗体可用于ARP2蛋白鉴定.     

附睾蛋白RhoA参与人精子顶体反应

目的:研究RhoA在男性生殖系统中的表达和功能.方法:采用RT-PCR来检测RhoA的mRNA表达,Western blot和免疫组化用来检测RhoA蛋白在人睾丸,附睾及成熟精子中的表达.免疫荧光用来观察这个蛋白在人精子上的定位.豌豆凝集素(PSA)染色用来确定精子顶体反应率.结果:只能在附睾中检测到RhoA的mRNA,而RhoA蛋白不仅在附睾上皮中表达,在人精子上也有表达.它位于人精子的顶体和尾部,并且随着顶体反应转移到精子的赤道部及顶体后区.同时特异的RhoA抗体能够显著地抑制精子发生顶体反应(P<0.01).结论:结果表明RhoA可能是在附睾成熟过程中带到人精子质膜表面,从而使精子获得发生顶体反应的能力.     

血管生成素样蛋白2单克隆抗体的制备和分析

目的：研制抗人血管生成素样蛋白2（ANGPTL2）单克隆抗体,为进一步进行ANGPTL2的表达分析和功能研究,揭示其在糖尿病肾病发生发展过程中的可能作用创造条件.方法：以纯化的ANGPTL2重组蛋白皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,分离脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,经HAT选择性培养基筛选,克隆和亚克隆化培养,ELISA鉴定,得到能稳定分泌抗人ANGPTL2的杂交瘤细胞;以硫酸铵沉淀法从杂交瘤细胞培养上清中初步纯化、制备抗人ANGPTL2单抗,以Western blot、细胞免疫染色和免疫组化染色相结合的方法对制备的单抗进行滴度和特异性鉴定.结果：得到1株能稳定分泌抗ANGPTL2的杂交瘤细胞,从其培养上清中制备的抗ANGPTL2单克隆抗体具有较好的特异性和较高的滴度,可用于Western blot、细胞免疫染色和免疫组化染色.结论：成功地研制了抗ANGPTL2单克隆抗体,为进一步进行ANGPTL2的表达分析和功能研究,揭示ANGPTL2的功能及其在糖尿病肾病发生发展过程中的可能作用创造了条件.     

精子形态学、精子-透明质结合试验与体外受精率的相关性研究

目的探讨精子形态学、精子-透明质结合试验（hyaluronan binding assay,HBA）与体外受精率的相关性。方法对体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transportation,IVF-ET）中精子形态学155例和精子-透明质结合试验38例进行分析,分别观察女方MⅡ卵子1509个和327个,记录受精和未受精卵的数目,并分析精子正常形态率、精子-透明质结合试验结合率和受精率的相关性。结果精子正常形态率≤5%、6%～14%、≥15%对应的MⅡ卵子受精率分别为48.05%、72.25%、81.79%,各组间相比较,差异有显著性（P〈0.05）。精子-透明质结合试验的结合率≤40%、41%～69%、≥70%对应的MⅡ卵子受精率分别为55.17%、72.07%、75.31%,≤40%组和其它两组间相比较,差异有显著性（P〈0.05）,另两组间相比较,差异无显著性（P〉0.05）。结论在体外受精过程中,精子正常形态率与卵子的受精率有明显的相关性,而精子-透明质结合试验的结合率与卵子受精率有一定程度的相关性,此两项参数可作为选择不同的辅助生殖技术[体外受精（in vitro fertilization,IVF）或胞浆内单精子显微注射术（intracytoplasmic sperm injec-tion,ICSI）]的依据。     

晚期氧化蛋白产物抗体的制备和鉴定

目的 制备和鉴定抗人晚期氧化蛋白产物(AOPPs)单克隆抗体(McAb).方法 用次氯酸(HOCl)和纯化的人血白蛋白(HSA)孵育获得AOPPs-HSA,取凝胶层析纯化后的第1峰免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗AOPPs-HSA的McAb,用间接ELISA、Western blot鉴定其特异性及亚类.结果 成功筛选出3株稳定分泌抗AOPPs,1株既抗HSA又抗AOPP的McAb杂交瘤细胞株,其分泌抗体亚类3株为IgGl,1株为IgG2b,间接ELISA和Western blot证明制备的抗体可以特异地和天然或体外制备的AOPPs结合.结论 获得抗人AOPPs-HSA的McAb细胞株4株,为进一步研究AOPPs生物学活性及其相关疾病的诊断和预后奠定基础.     

生物薄片法检测抗精子抗体及其临床意义

目的探讨抗精子抗体（ASAb）与不孕不育的关系,并评价免疫荧光生物薄片技术在检测ASAb中的临床应用价值。方法采用间接免疫荧光法结合生物薄片技术检测1920对不孕不育夫妇和40对正常孕期夫妇ASAb,并进行统计分析。结果不孕不育组ASAb阳性率明显高于正常对照组,（12.7%vs1.25%,χ2ASAb=9.4,P〈0.01）,ASAb阳性者IgG型占66.4%,IgM型28.1%,IgA为0.6%。ASAb结合的部位分别头部占58.0%,尾部35.8%,体部3.7%,整体阳性较少为2.5%。结论体内抗精子抗体的存在可能是导致不孕不育的主要原因之一。生物薄片技术检测抗精子抗体特异性高,既能定性又能定位,值得在临床推广。     

A Novel Contraceptive Vaccine： Design and Synthesis of the Chimeric Peptide Containing Multivalent Sperm-Specific Epitopes

Objective To develop a novel multivalent chimeric peptide vaccine for bisexual fertility regulation Materials & Methods On the basis of the amino acid sequence of the two peptides respectively selected from the mouse sperm/testis-specific proteins SP17 and Cyritestin, and one T cell epitope in bovine ribonuclease (RNase), a novel chimeric peptide consisting of 35 amino acid was designed and subsequently synthesized on the 430A peptide synthesizer. After being emulified with the equivalence Freund's adjuvant, the peptide with 35 amino acid residues was used to immunogenity the female BALB/c mice to investigate its immunity.Results The peptide was successfully synthesized, after being purified in high performance liquid chromatography (HPLC), its purity reached 95%. The specific antisera collected from the immunogenity mice could identify the corresponding proteins of testis tissues of mice, rats and human. The highest specific IgG titer in serum was 1:6 000, while the IgA titer in the washing of vaginal mucous membrane was 1:300.Conclusion The antibodies from the peptide with specific amino acid sequence can identify the original antigens, and stimulate powerful specific humoral immunity in mice. It provides a experimental bases for polyvalent contraceptive vaccine study.