CpG联合MUC1增强人外周血树突状细胞功能的实验研究

目的：观察CpG联合黏蛋白1（MUC1）应用对树突状细胞（DC）刺激T细胞增殖作用的影响。方法：应用淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞,体外培养应用GM－CSF、IL－4、TNF－α等细胞因子诱导DC,观察细胞形态,并通过流式细胞术检测细胞标志物CD80、CD86。收获DC按如下分组：A：DC;B：DC＋CpG;C：DC＋MUC1;D：DC＋CpG＋MUC1;E：CpG＋MUC1,分别与T淋巴细胞混合培养,通过MTT法检测T细胞增殖情况。结果：DC表型检测结果为：CD80＋细胞占70．4％,CD86＋细胞占72．0％,呈现成熟DC表型。MUC1与DC联合疫苗与淋巴细胞混合培养显示：DC具有刺激T细胞增殖的作用,CpG＋DC组和MUC1＋DC组,分别较单纯DC组对T细胞的刺激增殖作用明显增强（P＜0．01）,DC＋CpG＋MUC1组又明显高于单用MUC1或CpG＋DC组,差别显著（P＜0．01）,单纯加CpG和MUC1（无DC组）则基本无明显刺激T细胞增殖作用。结论：CpG联合MUC1能明显提高DC促T细胞增殖的功能。     

慢性髓性白血病来源的树突状细胞诱导的CTL体外作用研究

 目的　研究慢性髓性白血病来源的树突状细胞的免疫功能。方法　分离慢性期CML患者外周血单个核细胞 (PBMNC) ,用细胞因子GM CSF及IL 4在体外诱导培养DC ,检测细胞表型 ,并观察其诱导的CTL体外抗肿瘤效应。用酶联免疫 (ELISA)方法测定CML DC混合淋巴细胞反应 (MLR)上清液中IL 12及IFN γ的量 ,并与正常DC进行比较。结果　联合GM CSF及IL 4可诱导CML细胞分化为CML DC ,CML DC的CD1a、CD80、CD83表达率均低于正常DC ;CML DC混合淋巴细胞反应上清IL 12及IFN γ含量均低于正常DC ;CML DC能诱导出对自身CML细胞有特异性杀伤作用的CTL。结论　CML DC具有抗原提呈细胞的免疫功能 ,能诱导抗白血病CTL反应。     

负载腮腺腺样囊性癌抗原的树突状细胞诱导的抗肿瘤效应

目的：探讨腺样囊性癌肿瘤抗原负载的树突状细胞通过淋巴细胞介导的免疫反应,体外杀伤腺样囊性癌细胞的细胞毒性效应。方法：外周血单核细胞在GM—CSF＋IL-4的诱导下体外培养,用肿瘤细胞抗原冲击后,流式细胞仪检测树突状细胞抗原负载前后CD1a、CD83表达量的变化。MTT比色法检测同种异体的混合淋巴细胞反应和诱导细胞毒淋巴细胞CTL杀伤肿瘤细胞。结果：凋亡肿瘤抗原刺激后,CD83表达增加（P〈0．01）,而CD1a表达量下调（P〈0．05）。负荷肿瘤抗原树突状细胞体外诱导出明显的细胞不良反应,并刺激同种T淋巴细胞增殖。结论：GM—CSF＋IL-4诱导的单核细胞来源的树突状细胞,能在体外摄取肿瘤抗原而进一步成熟,通过激活淋巴细胞杀伤癌细胞。     

树突状细胞与超抗原联合诱导抗肿瘤免疫的研究

目的 建立体外培养扩增树突状细胞（DC）的方法，并利用DC和超抗原高聚金葡素（HAS）诱导产生高效特异性抗肿瘤免疫。方法 用GM－CSF和IL－4联合刺激诱导外周血单个核细胞分化为树突状细胞。HAS活化的淋巴细胞称为HASL。将DC与同源淋巴细胞或HASL共培养，分别称为DC－L和DC－HASL。用FCS分析细胞表型，MTT法测定细胞杀伤活性，并观察对裸鼠移植瘤的生长抑制作用。结果 在体外，DC－HASL对GLC－82细胞具有相对特异的杀伤作用，HASL和DC－L则无明显特异性。这三种效应细胞对荷瘤鼠的肿瘤生长都有不同程度的抑制，DC－HASL抗瘤活性最强。结论 将DC和HAS结合可诱导产生一种高效并具有相对特异性的抗肿瘤免疫活性细胞。     

肺癌患者外周血树突状细胞的生物学特性研究

目的：探讨肺癌患者外周血来源的树突状细胞（dendritic cells, DC）生物学特性。方法：从肺癌患者外周血分离获得单个核细胞，用细胞因子GMCSF (100 μg/L)，IL4 (50 μg/L)体外培养诱导。凋亡肿瘤细胞负载24 h后加入TNFα（10 μg/L）或CD40激发型单抗于培养DC中，继续诱导3～4 d。分别测定DC的表型、DC摄取抗原能力；混合淋巴细胞反应（MLR）对T细胞增殖能力的测定；细胞计数和3HTdR掺入观察DC对T细胞的激发和扩增效应，并与健康志愿者外周血来源的DC进行比较。结果： 患者外周血单个核细胞和正常人外周血单个核细胞来源的DC均高表达CD1α，CD83，CD80，CD86和HLADR等DC的相关抗原和共刺激分子；患者的未成熟DC能有效摄取FITCDextran，经TNFα或CD40激发型单抗激发诱导后，成为成熟和有功能的DC,几乎完全失去对抗原的摄取能力，与健康人外周血来源DC组相比无明显差别(P>0.05)；患者单个核细胞来源的DC在体外具有激发自体和同种异体外周血T细胞增殖的能力。结论：肺癌患者的外周血来源单个核细胞可以诱导成为具有功能的成熟DC。     

人外周血树突状细胞的体外诱导和鉴定

目的：建立从人外周血体外诱导扩增树突状细胞(DC)的方法：方法：从正常人外周血F1细胞分离单个核细胞，经三种细胞因子——重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(rh GM—CSF)、重组人白细胞介素4(rh IL-4)和重组人肿瘤坏死因子(rh TNFα)联合诱导培养，10天后收获细胞，利用光学显微镜、透射电镜观察其外部形态和细胞超做结构，流式细胞仪检测其细胞表面抗原，自体混合淋巴细胞反应检测其刺激T细胞的增殖活性：结果：培养收获了高纯度的DC，这些细胞表面有大量的不规则突起，核也呈不规则状，核仁小，核膜异染色质聚集，含有丰富的细胞器，如核糖体、内质网、溶酶体等；细胞表面高水平表达HLA—DR、CD1α、CD80、CD83和CD86；自体混合淋巴细胞反应表明诱导所得的DC具有很强的激发同种T细胞增殖的能力。结论：人外周血单个核细胞经细胞因子诱导培养可以得到大量的成熟DC。     

CpG-ODN持续刺激对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响

目的〖HT5"SS〗：研究CpGODN持续刺激对小鼠骨髓树突状细胞（DC）成熟的影响。〖HT5W〗方法〖HT5"SS〗： 小鼠骨髓细胞用GMCSF培养7 d,持续刺激组全程加入CpGODN,短期刺激组在培养的最后36 h加入CpGODN,对照组不加CpGODN。流式细胞仪检测细胞表型和细胞摄取抗原的能力,ELISA检测细胞产生的细胞因子,混合淋巴细胞培养检测细胞提呈抗原的能力。〖HT5W〗结果〖HT5"SS〗： 用CpGODN持续刺激的小鼠骨髓DC表达MHCⅡ、CD86和CD40等分子和分泌IL12 p70的能力并未增加,吞噬FITCOVA的能力显著升高,刺激同种异基因T细胞和刺激同种同基因T细胞增殖的能力显著低于CpGODN短期刺激组。〖HT5W〗结论〖HT5"SS〗：CpGODN持续刺激可抑制DC的发育成熟,可能是持续严重感染时免疫功能低下的原因。     

肺癌细胞和蛙皮素抑制树突状细胞的产生和功能

目的：了解肺癌细胞株及蛙皮素对树突状细胞（DC）产生及功能的影响。方法：树突状细胞由健康人外周血单个核细胞CD14^ ，在完全细胞培养液中加入1000U／ml GM-CSF和1000U／ml IL-4,培养7天获得，肺癌细胞株CRL－5815，CRL－5826，Bombesin和Bombesin受体拮抗剂加入培养液中，Annxin V检测DC凋亡；流式细胞仪检测CD40，CD86，CD83，CD80，HLA－DR阳性表达。结果：培养7－10天后的DC前体细胞表达高水平的HLA－DR CD80 CD86 CD83 CD40。肺癌及蛙皮素可导致DC前体细胞凋亡，而蛙皮素受体拮抗剂可部分保护蛙皮素致DC凋亡的作用。加入肺癌细胞株或蛙皮素与DC共培养时明显抑制上述细胞表型的表达和DC刺激同种异体T细胞的增殖能力，当加入蛙皮素受体拮抗剂时，DC细胞表达HLA－DR CD80 CD86 CD83 CD40明显增加，接近DC正常对照组。结论：肺癌细胞株及蛙皮素可导致DC的凋亡，抑制树突状细胞的产生和功能。     

捕获肿瘤抗原的树突状细胞治疗小鼠膀胱肿瘤

目的：研究捕获肿瘤抗原的树突状细胞（dendritic cells,DC)治疗膀胱肿瘤的可行性。方法：分离小鼠脏树突状细胞,外体经粒－巨细胞集落刺激因子（GM－CSF）活化和放射线来活的肿瘤细胞刺激后（D组）,治疗膀胱肿瘤移植模型,并设立空白对照组（A）,单纯GM－CSF活化的树突状细胞组（B）及灭活肿瘤细胞组（C）。结果：D组特异性T淋巴细胞活性、IL－4及IFN－γ水平明显高于其它组（P＜0．01）;所有小鼠长期无瘤存活（＞100天）而其它组小鼠存活期小于30天（P＜0．001）。结论：捕获肿瘤抗原的树突状细胞治疗膀胱肿瘤具有一定的临床应用前景。     

肿瘤细胞培养上清对小鼠骨髓来源的树突状细胞分化发育的影响

目的：探讨肿瘤细胞对树突状细胞（dendritic cells,DC)分化发育的影响。方法：在诱导小鼠骨髓DC发育的过程中,加入肿瘤细胞培养上清,观察DC生成情况,产与政党培养条件下的DC比较共刺激分子,Ⅱ类分子、黏附分子的表达,刺激同种T细胞增殖,以及抗原提呈功能水平,通过ELISA法检测肿瘤细胞分泌的细胞因子。结果：经小鼠黑色素细胞瘤B16和肺癌细胞3LL的分泌上清培养后,DC表达共刺激分子CD40,CD86,CD80,和黏附子CD5R的水平下降,分泌Th1细胞因子IL－12的水平也降低;并且DC的抗原提呈功能和刺激同种混合淋巴细胞反应的功能下降,上述肿瘤细胞均可分泌抑制性细胞因子IL－10。结论：在肿瘤细胞的微环境中存在免疫抑生因子,对DC分化发育和抗原提呈功能起负性调节作用。     

GM-CSF重组腺病毒转染外周血树突状细胞的研究

目的:利用GMCSF重组腺病毒转染外周血单核细胞,诱导培养树突状细胞(dendriticcell,DC),并与细胞因子培养的DC进行生物学特性的比较。方法:将GMCSF重组腺病毒转染正常人外周血单核细胞,或用重组细胞因子GMCSF,诱导培养获得DC,通过相差显微镜观察DC表面形态变化,FACS分析GMCSF基因转染对DC表面免疫分子表达的影响,Westernblot鉴定GMCSF的表达,ELISA检测IL12分泌水平,MTT法检测DC激发同种异体T细胞增殖的能力。结果:GMCSF重组腺病毒转染外周血单核细胞,能扩增获得DC,该DC高表达CD1a、HLADR、CD80和CD86等免疫分子,并表达细胞因子GMCSF和IL12,对同种异体淋巴细胞有更强的刺激活性。结论:用GMCSF重组腺病毒可从外周血单核细胞中扩增到DC,为DC瘤苗临床应用提供实验基础。     

健康人外周血树突状细胞的体外诱导及其功能分析

 目的　分析以健康人AB血清与rhCD40L体外诱导健康人外周血树突状细胞（DC）的功能。方法　对健康人外周血单个核细胞进行体外培养,在以健康人AB血清为基础的培养体系中加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、 重组人白细胞介素（rhIL）-4、rhCD40L等细胞因子,诱导单个核细胞分化形成DC,采用倒置显微镜及瑞特-吉姆萨染色观察,流式细胞术行DC表型鉴定,四甲基偶氮唑蓝比色（MTT）法进行混合淋巴细胞反应（MLR）,检测其抗原刺激能力,酶联免疫吸附（ELISA） 法检测DC 培养上清IL-12的分泌。结果　培养7 d后的细胞具有典型的DC 形态,并上调表达DC 特征性表面分子CD83及共刺激分子CD40、CD80、CD86,第0、1 、3、5、7天,5个时间点间CD83、CD40、CD80、CD86、CD14表达差异有统计学意义（F值分别为50.253、243.769、248.181、191.267、226.339,均P＜0.05）。培养后的DC 可较强地刺激同种自体淋巴细胞增殖,GM-CSF加rhIL-4、rhCD40L组较GM-CSF加rhIL-4 组刺激反应能力强。培养的DC 自培养第5天始即有IL-12 分泌,未加CD40L组IL-12 p40分泌量为（42.92±1.54）pg／ml,加CD40L组为（136.18±5.27） pg／ml;培养第7天,IL-12 p40分泌明显增多,两组分别为（60.09±2.27） pg／ml及（322.30±30.60） pg／ml,差异有统计学意义（t＝-44.941、-22.611,均P＜0.05）。结论　健康人外周血单个核细胞可在以健康人AB血清与rhCD40L为主的培养体系中诱导成DC。     

负载腮腺腺样囊性癌抗原的树突状细胞诱导的抗肿瘤效应

目的:探讨腺样囊性癌肿瘤抗原负载的树突状细胞通过淋巴细胞介导的免疫反应,体外杀伤腺样囊性癌细胞的细胞毒性效应.方法:外周血单核细胞在GM-CSF + IL-4 的诱导下体外培养,用肿瘤细胞抗原冲击后,流式细胞仪检测树突状细胞抗原负载前后CD1a、CD83表达量的变化.MTT比色法检测同种异体的混合淋巴细胞反应和诱导细胞毒淋巴细胞CTL杀伤肿瘤细胞.结果:凋亡肿瘤抗原刺激后,CD83 表达增加﹙P<0.01﹚,而CD1a表达量下调﹙P<0.05).负荷肿瘤抗原树突状细胞体外诱导出明显的细胞不良反应,并刺激同种T淋巴细胞增殖.结论:GM-CSF + IL-4 诱导的单核细胞来源的树突状细胞,能在体外摄取肿瘤抗原而进一步成熟,通过激活淋巴细胞杀伤癌细胞.     

以重组人类CD40配体为主的细胞因子体外诱导急性髓系白血病完全缓解患者及健康人外周血单个核细胞来源的树突状细胞形态及表型分析

 【摘要】　目的　以健康人AB血清与以重组人类CD40配体（rhCD40L）为主的细胞因子体外诱导急性髓系白血病完全缓解（AML-CR）患者及健康人外周血的单个核细胞,并分析其形态及表型差异。方法　以健康人AB血清为基础的培养体系中加入GM-CSF、rhIL-4、rhCD40L等细胞因子,诱导单个核细胞分化形成树突状细胞（DC）。瑞特-吉姆萨染色观察形态;流式细胞术鉴定表型;MTT法检测DC对淋巴细胞抗原刺激能力;ELISA法检测DC培养上清IL-12的分泌。结果　培养7 d后的细胞具有典型的MoDC形态,并上调表达MoDC特征性表面分子CD83及共刺激分子CD40、CD80、CD86,AML-CR组与健康人组相比差异无统计学意义（均P＞0.05）,但加rhCD40L组较未加rhCD40L组间差异有统计学意义（均P＜0.05）。培养后的MoDC可较强地刺激同种自体淋巴细胞增殖,AML-CR组与健康人组间刺激淋巴细胞增殖作用的差异无统计学意义（P＞0.05）,但加rhCD40L组较未加rhCD40L组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）。培养的MoDC自培养第5天始即有IL-12的分泌,AML-CR组与健康人组相比IL-12分泌水平差异无统计学意义（P＞0.05）,加rhCD40L组与未加rhCD40L组间差异有统计学意义（P＜0.05）。结论　以rhCD40L为主的细胞因子体外可诱导AML-CR患者及健康人外周血DC生成,两者在形态及表型上无明显差异,DC可刺激白血病特异毒性T细胞增殖,尤以由rhCD40L诱导的DC作用明显。     

树突状细胞与肾癌融合细胞疫苗诱导抗肿瘤免疫

目的探讨自体树突状细胞(DC)与肾癌融合细胞疫苗诱导特异性抗肿瘤免疫应答。方法利用肿瘤细胞纯化技术,从手术切除的肾癌组织中分离出高纯度的肾癌细胞,用10%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640进行原代培养。分离外周血单核细胞(PBMCs),在含重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和白细胞介素4(rhIL-4)的培养条件下,诱导分化为DC。用细胞融合技术将DC与肾癌细胞融合制备DC与肾癌融合细胞疫苗。用流式细胞仪检测肾癌细胞、DC和融合细胞的表型;用噻唑盐(MTT)比色法检测融合细胞刺激自体T细胞的增殖能力,乳酸脱氢酶(LDH)释放的细胞毒实验检测融合细胞刺激的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的杀瘤活性。结果DC高表达主要组织相融性复合体(MHC)Ⅰ类分子、MHCⅡ类分子和共刺激分子(CD86,CD80);原代肾癌细胞高表达一种高分子量的糖蛋白(MUC-1);自体DC与肾癌融合细胞疫苗同时表达肾癌细胞和DC细胞的表面抗原,并能有效刺激自体T细胞增殖,诱导产生的CTLs对自体肾癌细胞具有显著的杀伤活性。结论自体DC与肾癌融合细胞疫苗能诱导特异性抗自体肾癌细胞的免疫应答,为自体DC与肾癌融合细胞疫苗在治疗肾癌的临床应用中提供了实验依据。     

rhIL-17对小鼠造血前体细胞和人脐血CD34+干细胞分化发育的影响 *

目的:探讨重组人白细胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)对小鼠骨髓造血前体细胞和人脐血来源的CD34~ 干细胞生长发育的影响.方法:采用常规方法采集小鼠造血前体细胞;采用Mini-MACS分离技术,从正常人脐血分离人CD34~ 干细胞.体外加入IL-17和/或GM-CSF、IL-4培养分离的前体细胞,应用流式细胞仪检测其表型,采用ELISA法检测了其分泌的IL-12水平,通过[~3H]-TdR掺入法测定其刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力.结果:IL-17促进了小鼠骨髓来源的未成熟DC表达Ia,B7-2等免疫分子,促使其分泌较高水平的IL-12,该细胞也能刺激同种异体T细胞有效增殖,表现出了成熟DC的特征.IL-17单独培养9d促使人脐血CD34~ 干细胞扩增了2倍,部分细胞高表达CD1a及B7-2,低表达HLA-DR,未检测到CD83的表达.该细胞能促使同种异体T细胞增殖,但作用较弱;而rhIL-17与GM-CSF联合培养后扩增了14倍,培养细胞中CD1a、B7-2阳性细胞的比例明显升高,且此细胞刺激同种异体T细胞增殖的能力较强.结论:IL-17体外可促进小鼠骨髓造血前体细胞来源的DC成熟;与GM-CSF联合培养既能促进CD34~ 干细胞增殖,又能使之获得DC特征,初步提示IL-17与GM-CSF联合作用可促进CD34~ 干细胞向DC分化.     

Interferon-alpha induces dendritic cell differentiation of CML mononuclear cells in vitro and in vivo.

The ability of interferon-alpha (IFN-alpha) to induce dendritic cell (DC) differentiation in chronic myeloid leukemia (CML) was evaluated. Peripheral blood mononuclear cells from CML patients cultured with IFN-alpha and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) developed a dendritic morphology. Fluorescence in situ hybridization demonstrated that the DCs harbored the bcr/abl translocation. The DCs prepared with IFN-alpha/GM-CSF expressed significantly higher levels of class I and II HLA than those grown in interleukin-4 (IL-4) and GM-CSF. The DCs prepared from newly diagnosed CML patients using IFN-alpha/GM-CSF expressed immunoregulatory proteins at levels comparable to normal DCs. In contrast, DCs cultured from CML patients who did not achieve a cytogenetic response to IFN-alpha expressed significantly lower levels of class I HLA, CD40, CD54, CD80 and CD86 than normal DCs. The expression of CD86 by CML DCs was enhanced when they were cultured with IFN-alpha/IL-4/GM-CSF, or when IFN-alpha/GM-CSF-treated cells were induced to mature by CD40 ligand. The DCs from IFN-alpha failures were less stimulatory than normal DCs in the allogeneic mixed leukocyte reaction. CML patients who had a cytogenetic response to IFN-alpha initially had low numbers of bone marrow DCs that increased significantly with treatment, while nonresponders had more prevalent DCs at baseline that showed no consistent change with treatment. Therefore, IFN-alpha can induce DC differentiation from CML progenitor cells both in vitro and in vivo. The therapeutic activity of IFN-alpha in CML may be due to its ability to stimulate the generation of DCs that can present CML-specific antigens. Resistance to IFN-alpha may result when DC differentiation becomes impaired.     

CD14+单核细胞系白血病细胞来源树突细胞体外刺激特异抗白血病T细胞应答

背景与目的:白血病细胞能在体外分化为树突细胞(dendriticcells,DCs),从而有希望用于白血病的免疫治疗。本研究旨在探讨CD14高表达的单核细胞系白血病(M4、M5)细胞分化而来的DCs体外诱导抗白血病T细胞应答的能力。方法:取5例初诊CD14高表达的M4或M5型白血病患者的骨髓标本,分离单个核细胞(bonemarrowmononuclearcells,BMMNCs),将白血病细胞分为3组:贴壁白血病细胞组、非贴壁白血病细胞组及总白血病细胞组。流式细胞术(flowcytometry,FCM)比较3组细胞的CD14表达。用含GM-CSF、IL-4和TNF-α或不含细胞因子的培养液培养细胞7～10天后,通过细胞形态学观察及FCM检测细胞表型,鉴定单核白血病细胞来源的DCs(monocyticleukemiacell-deriveddendriticcells,Mo-LDCs);采用异基因混合淋巴细胞反应(allogeneicmixedlymphocytereaction,Allo-MLR)以及细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)抗白血病细胞毒分析检测Mo-LDCs的免疫功能,染色体核型分析结合异常表面抗原确定Mo-LDCs的白血病来源。结果:3组中贴壁白血病细胞的CD14含量最高,在细胞因子联合诱导下,可分化为大量CD83 成熟DCs。在同一病例的3组细胞以及不同病例的总单核细胞组间,培养前CD14的表达率与诱导后CD83 DCs的产率成正相关(r=0.967,P=0.007)。Mo-LDCs具有典型的成熟DCs的形态及表型特征,在Allo-MLR中能刺激同种T细胞明显增殖,并能刺激扩增特异性抗白血病CTL。同时,Mo-LDCs持续存在所起源白血病的核型异常和异常表达的髓系抗原。结论:在细胞因子组合诱导下,M4、M5亚型AML的CD14 细胞可分化为具有免疫功能的Mo-LDCs,单核系白血病细胞的CD14表达高低可能预示其DCs分化能力。Mo-LDCs具有经典的DCs的表型及功能,还具有白血病的克隆异常,可用于M4、M5患者的免疫治疗。