绿色荧光蛋白及其应用

源于水母（Aepuorea vietoria）等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是一种极具潜力的标记物。其内源荧光其团在受紫外光或蓝光激发时可高效发射清淅可见的绿光,且荧光性质稳定,与现在的标记物相比,GFP具有无可比拟的优势。因而自GFP被发现以来,一直作为一个监测完整细胞和组织内基因表达及蛋白定位的理想标记。广泛应用于转基因动物的研究、融合标记、基因治疗、蛋白在活细胞内功能定位及迁移变化,病原菌侵入活细胞的分子过程等。表明GFP是一类能在现代细胞生物学和分子生物学研究与临床检测中发现重要作用的较理想的基因表达标记物。     

绿色荧光蛋白在成人胰腺来源的巢蛋白阳性干细胞中的表达

目的 研究绿色荧光蛋白(GFP)在成人胰腺来源的巢蛋白阳性干细胞(NPSCs)中的表达。方法 应用脂质体(lipofectin)法，将含GFP基因的质粒pEGFP—N1转染至培养的NPSCs中，用荧光显微镜观察GFP的表达。结果 大约40％的NPSCs呈现强度较均匀的绿色荧光。结论 GFP基因可以被转染至NPSCs中，并在NPSCs中表达。     

利用重组慢病毒载体建立稳定表达绿色荧光蛋白细胞系

目的：利用重组慢病毒载体将绿色荧光蛋白基因（GFP）导入293T细胞,建立稳定表达GFP的细胞系,将GFP作为靶基因观察不同方法调节基因表达的效力的差异。方法：以载体质粒pHR＇-pCMV-GFP、包装质粒pCMV-ΔR8.2及包膜质粒pCMV-VSVG用磷酸钙共沉淀法共转染包装细胞系293T,收集病毒颗粒再次感染293T细胞,用克隆环筛选出荧光亮度较强的细胞克隆。多次传代后,流式细胞术检测细胞荧光表达的稳定性。同时进行靶向GFP的RNA干扰,观察GFP表达下调情况,验证该细胞系用于研究基因调控方法的有效性。结果：利用重组慢病毒载体可有效建立GFP稳定表达的新细胞系,此细胞系中GFP阳性细胞占99%以上,12次传代前后GFP表达无明显差异;靶向GFP的RNAi可以显著下调GFP表达。结论：成功建立了表达GFP的G4细胞系,并可有效地用于基因调节方法的研究。     

增强型绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构造和表达

逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志,为此,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白（ＥＧＦＰ）基因,并构建可表达ＥＧＦＰ的逆转录病毒载体ＬＧＳＮ,通过脂质体转梁和交互感染方法建立高滴度的逆转录产病毒细胞,用以分析对造血细胞标记ＥＧＦＰ基因的可行性,流式细胞术和荧光显微镜检测发现,ＥＧＦＰ病毒转录的ＧＰ＋ｅｖｎＡｍ１２细胞和Ｋ５６２细胞均可发出稳定的绿色荧光信号,阳性率可分别达９７％和８６％,聚合酶链反应分析显示ＬＧＳＮ转子细胞内有原病毒的整合,上述结果提示,作为新一代选择性标志,ＥＧＦＰ是适于研究对造血细胞基因转移与报告基因,对促进人类基因治疗的研究有重要意义。     

高效绿色荧光蛋白基因标记系统的建立及其初步应用

逆转录病毒载体编码的众多报告分子被广泛用于分析基因转导率、分选或示踪基因修饰靶细胞 ,特别在改进基因转导条件、阐明造血干细胞 (ＨＳＣ)生物学特性和判定白血病复发的细胞来源等方面发挥了重要作用[1,2 ] 。作为新一代的报告分子 ,增强型绿色荧光蛋白 (ＥＧＦＰ)最近已被用于造血细胞的基因转移和示踪肿瘤转移与血管形成等研究[3 ] 。我们曾建立双启动子逆转录病毒载体介导的ＥＧＦＰ基因转移系统 ,但发现转导靶细胞后荧光强度较低[4 ] 。为提高靶细胞ＥＧＦＰ的表达 ,我们构建了仅携带ＥＧＦＰ单基因的逆转录病毒载体Ｇ1ＦＰ ,并在不…     

表达增强型绿色荧光蛋白K562细胞株的建立及其检测自然杀伤细胞活性的效果评价

目的建立一种准确、稳定的自然杀伤细胞(NK)活性检测方法。方法通过电穿孔法将含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒转入K562细胞,经G418筛选后进行克隆,获得EGFP阳性表达细胞株;采用流式细胞仪和乳酸脱氢酶法检测10名健康人外周血NK细胞活性。结果通过基因转染的方法得到1株稳定表达EGFP的K562细胞,转染EGFP对细胞生长无影响,10名健康人外周血NK细胞对转染EGFP的细胞及未转染细胞的杀伤活性无差异(P>0.05);表达EGFP的K562细胞在效靶比为40∶1时,用流式细胞仪检测培养2和4h时的NK细胞杀伤率分别为(21.5±1.3)%和(23.7±1.5)%,二者无差异(P>0.05);而用乳酸脱氢酶法测定培养4h的NK细胞对K562和EGFP-K562的杀伤率[分别为(23.6±2.3)%和(23.7±2.3)%]均高于2h的杀伤率[(18.0±1.1)%和(18.2±1.3)%,P<0.05]。结论成功建立了表达EGFP的K562细胞株,将该细胞株作为靶细胞用于流式细胞术检测NK细胞活性时,无需预先染色和标记靶细胞,且操作简便、省时、稳定、可靠。     

慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达

本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统,并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道(PPT)元件、泛醌启动子(PUB)和绿色荧光蛋白基因(GFP)连接至pLO134载体,构建成pTK153载体。之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统(包括包装质粒△NRF、转移质粒pTK153和包膜蛋白质粒VSV-G)共转染293T细胞,12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞,在荧光显微镜下和应用流式细胞仪(FACS)观察感染情况。结果表明:慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,FACS分析转染效率为(63.04±7.24)%,病毒滴度测定为(3.09±0.61)×106U/ml。感染小鼠T淋巴细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达,FACS分析转导效率为(37.98±6.26)%。结论:成功构建了含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体,对小鼠T淋巴细胞有较高的感染效率。     

绿色荧光蛋白标记在干细胞移植中的应用

目的：了解绿色荧光蛋白标记在干细胞移植研究中应用的进展情况。资料来源：应用计算机检索Medline 1990-01／2005-11期间的相关文章，检索词为“green fluorescent protein，stemcell，labeling”，并限定文章语言种类为English。同时计算机检索重庆维普数据库、清华同方数据库和万方数据库1990-01／2005-11期间的相关文章，检索词为“绿色荧光蛋白，干细胞，标记”，并限定文章语言种类为中文。 资料选择：对资料进行初审，并查看每篇文献后的引文。纳入标准：文章所述内容应与绿色荧光蛋白标记在干细胞移植中的应用研究相关。 排除标准：明显缺乏随机对照的实验研究、重复研究或综述类文献。 资料提炼：共收集到123篇相关文献，27篇文献符合纳入标准，排除的96篇文献为内容陈旧或重复。符合纳入标准的27篇文献中，关于绿色荧光蛋白的结构和功能7篇，关于绿色荧光蛋白标记干细胞的方式及其在干细胞分化、定量、示踪中的应用17篇，关于绿色荧光蛋白在细胞标记的毒副作用3篇。 资料综合：绿色荧光蛋白作为标记物时主要优点有：①不需加任何底物，监测方便。②分子量较小，与目的基因融合后，对目的基因的结构功能影响小。③不影响或很少影响细胞的正常功能。④绿色荧光蛋白荧光表达稳定，可耐受一定的理化处理。绿色荧光蛋白被广泛地应用于干细胞移植的研究中。目前，常用的标记干细胞的方式有3种：质粒载体转染．病毒载体转染和绿色荧光蛋白转基因动物。结合使用定量聚合酶链反应、激光共聚焦、荧光激活细胞分类计数和激光捕获显微切割技术等技术方法，可有效地监测移植干细胞在体内的分布和分化情况，并可定量分析其在组织中的含量。 结论：绿色荧光蛋白标记具有检测方便、表达稳定和不影响细胞功能等优点，从而被广泛地用于示踪移植干细胞在体内的分布、含量、分化等方面的研究。绿色荧光蛋白标记细胞还可能存在一定的毒副作用，应进一步加以改进，以利于其应用。     

神经科学研究中绿色荧光蛋白报告基因的应用

随着研究手段的进步，人们对神经学的研究更加深入。绿色荧光蛋白作为一种新型的报告基因，具有荧光性质稳定、对生物体无毒性作用、检测时不需底物的特点，在神经细胞的基因表达、蛋白定位的研究上优于其他报告基因，尤其适合于活体细胞功能与形态相结合的研究。     

人PTEN绿色荧光蛋白真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人PTEN绿色荧光蛋白真核表达载体并进行鉴定.方法 参照PTEN基因全序列,在cDNA两端各设计一条对应引物,并引入各自的酶切位点.从正常人胎盘组织中提取mRNA作为模板合成第一链,并扩增目的基因序列片段,经双酶切后定向克隆至绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中,筛选阳性重组质粒,分别经双酶切、测序法对重组质粒进行鉴定.结果 双酶切和特异PCR结果表明克隆的基因片段约1.2 kb;测序法进一步证实该基因为PTEN编码基因,经NCBIBLAST分析与Gene Bank中基因序列完全相同.结论 成功构建了人PTEN绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1-PTEN,为研究在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础.     

对比剂Gd-DTPA-BSA-chTNT的研制及其在乳腺癌裸鼠模型活体MR分子成像中的应用

目的:探索采用特异性对比剂进行乳腺癌模型活体MR分子成像的可能性,及其在诊断乳腺癌方面的价值。方法:在一定条件下将Gd-DTPA-BSA与单克隆抗体chTNT反应生成MR特异性对比剂Gd-DTPA-BSA-chTNT。在5周龄雌性、无特定病原体(SPF级)BALB/c裸小鼠原位接种人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)制作动物模型。将12只人乳腺癌裸鼠随机分为实验组和对照组,前者注射Gd-DTPA-BSA-chTNT,后者注射含相同Gd离子浓度的Gd-DTPA,两者均经尾静脉注射,注射剂量均为0．2 ml/只。测量SE T1WI平扫及引入对比剂5 min及1、2、3、4、8、12、24 h后的肿瘤信号强度,并计算对比度噪声比(CNR)。将右侧前肢肌肉组织信号变化作为参照物,并进行统计学分析。结果:实验组注射对比剂Gd-DTPA-BSA-chTNT后1 h裸鼠瘤体信号强度开始升高,于4 h达到高峰,且延迟24 h后信号强度仍有增高,与注射对比剂前比较差异有统计学意义(P＜0．001)。但裸鼠肌肉信号始终无明显升高,与注射对比剂前比较无显著差异(P＞0．05)。对照组注射对比剂Gd-DTPA后5 min及1、2、3、4 h裸鼠瘤体及肌肉信号变化与注射对比剂前比较,差异有统计学意义(P＜0．001);本组8 h后成像显示对比剂退出,与对比剂注射前比较无统计学意义(P＞0．05)。结论:MR特异性对比剂Gd-DTPA-BSA-chTNT,对乳腺癌(MDA-MB-231)裸鼠模型肿瘤灶有较好的特异性和靶向作用,可用于乳腺癌模型活体MR分子成像研究,并将有利于乳腺癌病灶的检出及定性诊断。     

光学分子影像学及其应用

光学分子影像学是一种快速发展的生物医学影像技术,它可以利用生物自发光或荧光蛋白或荧光染料,在分子和细胞层面上对在体的特定生物过程进行定性和定量研究。光学分子影像学同磁共振、核素成像等技术相比,具有无创性、高敏感性、成像价格低、近红外荧光穿透力强等优点。光学对比剂,特别纳米颗粒、纳米壳和量子点发展迅速。近红外(NIR)荧光染料标记的探针在转化到人类临床应用方面有着巨大的潜力。本文综述了当前光学分子影像学的发展现状及其在生物学、医学和药学中的应用。     

SPIO分子探针标记裸鼠肺腺癌移植瘤的磁共振成像及病理学初步研究

目的建立应用超顺磁性氧化铁(SPIO)分子探针氨基硅烷Fe3O4纳米颗粒标记人肺腺癌的裸鼠移植瘤模型,行磁共振成像和病理观察,探讨其临床价值.方法制备氨基硅烷Fe3O4纳米颗粒,分别将标记和未标记肺腺癌细胞株植入裸鼠皮下,观察其成瘤情况,行MR扫描和病理观察.结果标记及未标记纳米分子探针SPIO的肿瘤模型均成功建立,其中前者肿瘤较后者在MR成像中信号强度有明显变化,在T1WI、T2WI、FGR/20°和FGR/70°四个序列中,以FGR/20°变化最明显.病理切片普鲁士兰染色可见肿瘤细胞及坏死组织内有铁染色.结论氨基硅烷Fe3O4纳米颗粒标记人肺腺癌细胞建立裸鼠移植瘤模型稳定可靠,应用磁共振可以对其进行活体监测,提示在临床上具有良好的潜在性应用前景.     

Small animal positron emission tomography imaging and in vivo studies of atherosclerosis

Atherosclerosis is a growing health challenge globally, and despite our knowledge of the disease has increased over the last couple of decades, many unanswered questions remain. As molecular imaging can be used to visualize, characterize and measure biological processes at the molecular and cellular levels in living systems, this technology represents an opportunity to investigate some of these questions in vivo. In addition, molecular imaging may be translated into clinical use and eventually pave the way for more personalized treatment regimes in patients. Here, we review the current knowledge obtained from in vivo positron emission tomography studies of atherosclerosis performed in small animals.     

GFP作为脐带间充质干细胞体内示踪标志物在大鼠脑缺血再灌注损伤中的表达

目的通过腺病毒转染携绿色荧光蛋白(GFP)的脐带间充质干细胞(ucMSCs)移植大鼠脑缺血再灌注损伤模型,研究GFP作为示踪剂的可行性。方法体外培养经腺病毒转染GFP的ucMSCs,建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,通过脑立体定位技术将1×10~6携GFP的ucMSCs移植入损伤脑组织,并于造模7d后取脑组织进行冰冻切片,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。结果体外携GFP的ucMSCs形态呈成纤维状,融合时聚集成簇,呈放射状或漩涡状排列,与未转染ucMSCs形态无差异,荧光显微镜下可见GFP的阳性率达80%以上,且荧光扩散至整个细胞,可反映细胞完整形态。移植后大鼠未出现排斥反应,7d后脑组织移植部位附近均可见GFP表达,荧光未见衰减。结论 GFP作为ucMSCs移植治疗脑损伤的有效示踪剂,可为细胞水平的各种研究及体内移植细胞的研究提供实验手段。     

Improved fluorescence of indocyanine green in vitro and in vivo after simple cooling procedures

Indocyanine green (ICG) is a contrast agent used for detecting angiogenesis with optical imaging (OI). The purpose of this study was to investigate whether cooling procedures increase the signal yield of ICG with OI. Test samples of 0.05 and 0.02 mM ICG in 40% DMSO and 60% DMEM underwent OI at four different temperatures (5, 37, 55 and 75°C). In addition, six athymic rats with an antigen‐induced arthritis of the knee and ankle joints underwent OI before and after injection of ICG (10 mg/ml, dose 15 mg/kg) on two separate days with and without cooling of the joints. The fluorescent signals of the test samples and arthritic joints were measured and evaluated for significant differences before and after cooling with a t‐test. In vitro studies showed a strong negative correlation between ICG temperature and fluorescent signal. The mean fluorescent signal of arthritic joints (measured in efficiency) was 0.345 before ICG‐injection, 4.55 after ICG‐injection and before cooling and 9.71 after ICG‐injection and after cooling. The fluorescent signal enhancement of arthritic joints with ICG‐enhanced OI images increased significantly after cooling (p = 0.02). The signal yield of ICG can be significantly increased by cooling the target pathology. The primary underlying cause of the temperature dependence of ICG is enhanced collisional quenching with increasing temperature. This simple cooling method may be immediately helpful to increase the fluorescence signal yield in current ICG‐enhanced OI‐studies in patients. Copyright © 2008 John Wiley & Sons, Ltd.     

Bioluminescence imaging in vivo – application to cancer research

Molecular events promoting tumourigenesis and anticancer therapeutic strategies have been intensively studied in tumour cell culture models. In the past few years, non-invasive bioluminescence imaging (BLI) has emerged as a powerful strategy for the validation of cell culture findings in animal models of cancer. BLI allows for repetitive and exceptionally sensitive real-time monitoring of a disease course, as well as of tumour response to therapeutic interventions in an individual animal. This review discusses the application of BLI to cancer research in general and to the area of experimental neuro-oncology in particular.     

肺结节的病理演进与分子影像研究进展

随着肺部低剂量CT的普及和大众健康意识的提高,肺结节的检出率大大提高,但良恶性判断仍然是目前影像学的难点和热点,早期明确诊断对于疾病治疗方案的选择和预后结果至关重要。目前影像学对肺结节的研究已经从形态学向分子影像学方向发展,分子影像学能够对活体进行细胞和分子水平的定性、定量、动态研究,在诊断肺结节中显示出重要价值和潜力。本文就不同病理类型肺结节的病理演进过程进行概述,并对几种不同类型的核医学分子影像显像剂作一综述。     

Feasibility,sensitivity, and reliability of laser-induced fluorescence imaging of green fluorescent protein-expressing tumors in vivo

Whole-body imaging of green fluorescent protein (GFP) can be used to test the efficiency of gene carriers for in vivo transduction. The aim of the current study was to determine the sensitivity and the accuracy of a GFP imaging procedure by in vivo investigation of GFP-expressing tumor cells. An improved method of whole-body GFP imaging made use of a laser excitation source and band-pass filters matched specifically to GFP and constitutive tissue fluorescence emission bands. Processing of the primary GFP fluorescence images acquired by the CCD camera subtracted background tissue autofluorescence. Our approach achieved 100% sensitivity and specificity for in vivo detection of 10%-transfected BxPc3 pancreatic tumor after subcutaneous grafting or orthotopical implantation in the pancreas of nude mice. It also detected less transfected tumors (i.e., 1 to 5%) but with a loss in sensitivity (50% of cases). The system was employed over a 5-week period to monitor the persistence of GFP expression in 10%-transfected BxPc3 tumors orthotopically implanted in the pancreas of two nude mice, allowing the direct visualization of tumor progression and spread. In facilitating the temporal–spatial follow-up of GFP expression in vivo, the optimized laser-induced fluorescence imaging device can support preclinical investigations of vectors for therapeutic gene transduction through regular, harmless, real-time monitoring of theirin vivo transductional efficacy and persistence.