尖音库蚊复组有机磷抗性相关酯酶B2基因杂合型的分子特征

目的 研究自然种群尖音库蚊复组有机磷抗性相关酯酶B2基因EstB2杂合型的分子特征.方法 采集杭州市自然种群库蚊,提取单蚊DNA基因组,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法进行抗性相关酯酶的基因分型.对酯酶B2基因Estβ2型蚊虫的PCR产物,进一步选用Bfm Ⅰ内切酶进行酶切,确定酯酶B2基因Estβ2纯合犁及Estβ2杂合型.本次研究共提取207只单蚊DNA,156份PCR样本阳性,阳性率75.36%(156/207).结果 在156份PCR样本阳性,酯酶B2基因Estβ2型占28.20%(44/156);对该基因型进一步分型,其中Estβ2纯合型占90.90%(30/33),EstB2杂合型占9%(3/33);Estβ2杂合型是以Estβ2和一种亚型杂合(Estβ2/Estβ2<'1>)形式存在.结论 建立了在自然种群尖音库蚊复组中酯酶B2基因分型方法,研究证明了杭州自然种群库蚊存在一种有机磷抗性相关酯酶B2基因Estβ2杂合型.     

复合PCR-RFLP技术用于尖音库蚊复组抗性相关酯酶基因分子分型

目的应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测法,建立尖音库蚊抗性酯酶等位基因分型方法。方法根据尖音库蚊抗性酯酶基因保守区序列设计引物;提取单个蚊虫基因组DNA,采用PCR-RFLP分析的方法,对抗性酯酶等位基因分型。结果酯酶基因扩增片段长度为860 bp,经限制性内切酶酶切后,尖音库蚊抗性Est-β11纯合型有5条带(70、89、147、198和347 bp);Est-β2纯合型出现4条带(60、147、207和437 bp);Est-β11/Est-β2杂合型出现5条带;Est-βN纯合型出现3条带(147、207和506 bp)。结论PCR-RFLP方法能快速、有效地检测尖音库蚊抗性酯酶等位基因类型。     

不同地理种群尖音库蚊复组杀虫药剂抗性及抗性酯酶

目的研究海南省三亚及海口市,广西壮族自治区南宁市、环江县,辽宁省葫芦岛市的尖音库蚊复组蚊虫对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性水平及与抗性有关的酯酶.方法生物测定和淀粉电泳技术.结果三亚市尖音库蚊复组蚊虫种群对DDVP、对硫磷、毒死蜱、邻仲丁基苯基甲基氨基甲酸酯和残杀威的抗性分别是敏感品系S-LAB的20.5、10.0、4.7、1.7、3.9倍;海口市尖音库蚊复组蚊虫种群对以上5种杀虫药剂的抗性分别是敏感品系S-LAB的8.3、6.6、2.5、1.7、3.7倍,略低于三亚市蚊虫种群对5种杀虫药剂的抗性水平;广西壮族自治区的2个种群的抗性非常低或未产生抗性;葫芦岛种群已产生中、低抗性;淀粉凝胶电泳显示海南省以抗性酯酶A2-B2为主,葫芦岛市以B1为主,广西壮族自治区的2个种群酯酶基因呈现多态现象.结论5个地区蚊虫对所测杀虫剂均产生中、低抗性,对有机磷的抗性大于氨基甲酸酯类,高活性酯酶是主要的抗性机制.     

杭州市淡色库蚊对杀虫剂的抗性及抗性基因研究

目的了解杭州市淡色库蚊对杀虫剂的抗性及抗性基因,为蚊虫防制提供依据。方法浸液法和PCR技术。结果杭州市淡色库蚊对溴氰菊酯的抗性倍数为9．10倍,敌敌畏为4．52倍,三氯杀虫酯为2．77倍,残杀威为2．04倍,高效氯氰菊酯、丙烯菊酯未形成抗性;经PCR扩增,检测到11个与抗性相关的基因,其中P450类1个,钠离子通道基因2个,酯酶基因2个,乙酰胆碱酯酶受体基因1个,超氧化物歧化酶基因1个,其他相关基因4个。结论杭州市淡色库蚊对溴氰菊酯和敌敌畏产生了抗性;PCR检测,存在11个抗性相关基因。     

基于白纹伊蚊转录组的溴氰菊酯抗性相关基因分析及验证

目的 通过对白纹伊蚊溴氰菊酯抗性品系(DR)和敏感品系(DS)进行转录组分析,筛选可能与抗性相关的差异表达基因。方法 提取白纹伊蚊实验室敏感品系(DS品系)、溴氰菊酯抗性品系(DR品系)的总RNA进行高通量测序,对差异基因进行COG和KEGG的功能注释与分析,筛选出可能与抗性相关的差异表达基因,并进行实时定量PCR验证。结果 DR品系的LC₅₀为2 087.75μg/L,相较于DS品系,抗性倍数为109.8倍,达到了高度抗性标准。RNA-seq测序后基于FPKM值进行差异性分析结果显示,差异表达的基因共有551个,其中在DR品系中上调表达基因有278个,下调表达基因有273个。COG和KEGG功能富集结果显示,显著性富集的通路和蛋白质功能预测均主要与物质代谢相关。基于此进一步分析了代谢抗性相关基因,且10个目标基因的RNA-seq结果与实时定量PCR结果在DR和DS品系中表达趋势具有一致性。结论 白纹伊蚊可能通过上调表达细胞色素P450基因、谷胱甘肽S转移酶基因、羧酸酯酶、表皮蛋白等基因应对杀虫剂的选择压力。     

多药耐药铜绿假单胞菌β-内酰胺类耐药相关基因及Ⅰ型整合酶基因研究

目的 了解临床分离的多药耐药铜绿假单胞菌(MRPA)中β-内酰胺类药物耐药相关基因及Ⅰ型整合酶基因存在状况.方法 对34株多药耐药铜绿假单胞菌用K-B纸片扩散法和微量稀释法测定对庆大霉素等16种抗菌药物的敏感性;用PCR法对β-内酰胺类药物耐药相关基因TEM、SHV、OXA-10群、PER、VEB、GES、CARB、IMP、VIM、SPM、GIM、DHA、FOX、MOX、CTX-M9-群、CTX-M-1群和外膜蛋白oprD2基因及Ⅰ型整合酶基因等18种主要耐药基因进行了检测与分析.结果 34株MRPA(耐3类抗菌药物的菌株)对阿米卡星、头孢他啶、环丙沙星、头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟、美罗堵南、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、哌拉西林、妥布霉素的耐药率分别为14.7%、29.4%、61.8%、67.6%、70.6%、73.5%、76.5%、76.5%、79.4%、91.2%、94.1%,对其他抗菌药物耐药率均为100.0%;检出β-内酰胺酶编码基因FOX、IMP、DHA和VIM基因阳性率分别为23.5%、11.8%、11.8%和5.9%,24株(70.6%)外膜通道蛋白oprDz基因缺失,而其他基因均阴性,34株Ⅰ型整合酶基因int Ⅰ 1均阳性.结论 临床分离的MRPA携带多种β-内酰胺酶基因,oprD2基因缺失率高,Ⅰ型整合酶基因广泛存在于MRPA.     

淡色库蚊对残杀威抗性与酯酶和乙酰胆碱酯酶的关系研究

目的研究淡色库蚊对残杀威抗性与酯酶和乙酰胆碱酯酶的关系。方法WHO浸渍法检测蚊虫抗性指数;分光光度法检测羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活性。结果使用残杀威对淡色库蚊野外品系进行筛选,筛选8代后抗性指数由原来的4.77倍上升至12.07倍。对敏感品系和抗性品系分别进行羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活性测定,二者的羧酸酯酶活性差异无统计学意义(P>0.05),而二者的乙酰胆碱酯酶活性在高浓度残杀威抑制浓度(100×10-6、10×10-6、1×10-6)下,抑制率敏感品系分别为(93.92±0.65)%、(91.69±0.54)%和(87.03±1.14)%,抗性品系分别为(89.81±0.92)%、(87.41±1.66)%和(83.84±0.36)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论羧酸酯酶在对残杀威的抗性形成中作用较小,而乙酰胆碱酯酶的敏感性降低与抗性品系的抗性形成有关。     

舟山、杭州两地淡色库蚊对杀虫剂抗性特征分析

目的了解浙江省不同地理环境下淡色库蚊对杀虫剂的抗性特征,为蚊虫抗性产生机制以及防制措施的制定提供科学依据。方法采用浸渍法检测淡色库蚊敏感品系、舟山现场种群、杭州现场种群对敌敌畏、溴氰菊酯、三氯杀虫酯、残杀威、丙烯菊酯、高效氯氰菊酯4类6种常用杀虫剂的抗性特征。结果杭州现场种群抗性水平普遍较低,抗性系数在0.78～7.58倍之间,其由高到低依次为敌敌畏（7.58倍）〉溴氰菊酯（4.00倍）〉三氯杀虫酯（2.88倍）〉残杀威（2.11倍）〉丙烯菊酯（1.11倍）〉高效氯氰菊酯（0.78倍）。舟山现场种群抗性系数在2.25～15.00倍之间,其由高到低依次为溴氰菊酯（15.00倍）〉三氯杀虫酯（7.54倍）〉敌敌畏（5.99倍）〉高效氯氰菊酯（5.57倍）〉丙烯菊酯（4.55倍）〉残杀威（2.25倍）。淡色库蚊的抗性系数舟山现场种群除敌敌畏外,其余均高于杭州现场种群,其中对高效氯氰菊酯、丙烯菊酯和溴氰菊酯的抗性系数比杭州现场种群高6.14、3.10和2.75倍。结论舟山、杭州现场种群抗性水平普遍较低,舟山现场种群除溴氰菊酯外,两地现场种群对其他药物的抗性系数均〈10。两市比较,舟山现场种群除敌敌畏外,其他抗性均略高于杭州现场种群。     

冰冻储存对淡色库蚊非特异性酯酶活性的影响

目的探讨冰冻储存对淡色库蚊非特异性酯酶（non-specific esterase,NSE）活性的影响,为蚊虫抗药性生物化学检测方法的推广应用提供依据。方法以β-乙酸萘酯为底物,坚固蓝B盐为显色剂,测定单个蚊虫NSE活性。结果DDVP抗性品系淡色库蚊NSE活性水平明显高于敏感品系;经完全随机设计的方差分析比较,-20℃冰冻0、7、14、21、28d的淡色库蚊NSE活性A值之间的差别,敏感品系4龄幼虫的F值为0．7642,该品系3日龄雌成虫的F值为0．7452,DDVP抗性品系4龄幼虫的F值为0．1092,该品系3日龄雌成虫的F值为0．1521,P值均〉0．05,差异无统计学意义。结论-20℃冰冻28d对淡色库蚊4龄幼虫和3日龄雌成虫体内NSE活性无影响,可在现场采集蚊虫带回实验室集中测定。     

非特异性酯酶与淡色库蚊抗药性关系的研究

目的探讨非特异性酯酶与淡色库蚊抗药性的关系,为应用生物化学方法检测蚊虫抗药性提供依据。方法测定敏感（S）、抗DDVP（Rd）、抗残杀威（Rp）、抗氯氰菊酯（Rc）品系淡色库蚊及其恢复品系（Rd降解、Rp降解、Rc降解）淡色库蚊的抗药性水平和NSE活性水平。结果Rd、Rp、Rd降解、Rp降解品系淡色库蚊的抗药性系数分别为12.17、11.21、6.10、8.38,其NSE活性OD值≥1.0的个体频率分别为95.10%、52.77%、57.33%、40.28%;Rc、Rc降解品系淡色库蚊的抗药性系数分别为534.31、83.26,而其NSE活性OD值≥1.0的个体频率分别为8.75%、8.33%,均与S品系的8.25%相近。结论淡色库蚊对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性变化伴随其NSE活性的变化,而对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性变化不伴随其NSE活性的变化。测定NSE可用来判断蚊虫对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性状况。     

淡色库蚊酯酶A2探针应用于现场抗性检测的研究

目的制备淡色库蚊酯酶A2探针,应用于现场蚊虫抗性检测。方法设计酯酶A2上下游引物,5′端地高辛标记,PCR法制备DNA探针并对扩增片段测序、分子杂交检测各现场蚊虫抗性。结果单蚊基因组DNA稀释至1/20时,抗性与敏感品系杂交点的阳性率有差别。应用酯酶A2探针检测各现场蚊虫,唐口种群的杂交阳性率为33%,微山种群的杂交阳性率为38%,滕州种群的杂交阳性率为56%。结论应用酯酶A2探针能够检测现场蚊虫抗性水平。该方法灵敏、可靠,为蚊虫有机磷杀虫剂抗性分子生物学检测提供了选择。     

浦东国际机场致倦库蚊和淡色库蚊的调查研究

目的了解致倦库蚊和淡色库蚊在浦东机场的分布与活动规律。方法帐诱法、灯诱法、人诱法、捞勺法和人工小时法。结果致倦库蚊和淡色库蚊是浦东国际机场的优势蚊种,4-11月均有危害;灯诱法调查,季节消长呈坡型,蚊虫于4月出现,5-6月达到高峰,10-11月逐渐减少至消失;蚊虫活动（帐诱法）主要在晚上,黄昏时有群舞习性,活动高峰为日落后1～4h,白天基本不活动;刺叮（人诱法）高峰时间为21：00,叮人频率最高为42次/15min;入室蚊虫以19：00-22：00为多,入室率最高为9只/15min;幼虫主要孳生于池塘、水坑、洼地、下水道和容器等污染或干净的静止水体中。结论致倦库蚊和淡色库蚊是浦东国际机场危害人类的常见蚊种,其活动规律的研究对媒介控制和虫媒病的预警提供了技术支撑。