心钠肽对培养人脐静脉内皮细胞缺氧再复氧损伤的保护作用的实验研究

目的探讨心钠肽(ANP)对培养的人脐静脉内皮细胞缺氧再复氧损伤后的保护及相关作用机制。方法取冻存的人脐静脉内皮细胞株复苏,传代培养,培养至第三代后,将细胞按同种浓度接种到24孔培养板上,正常环境下培养一天,隔天按实验分组换液:分为三组:1.正常对照组(n=6);2.缺氧复氧组(n=6)缺氧6 h再复氧6 h;3.缺氧复氧+不同浓度ANP组:0.001μg/mL(n=6);0.005μg/mL(n=6);0.01μg/mL(n=6);0.05μg/mL(n=6);0.1μg/mL(n=6)缺氧6 h再复氧6 h;各组细胞在倒置显微镜下观察细胞形态,取各组细胞培养上清液分别检测丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)及超氧化物歧化酶(SOD)活性。用SPSS13.0软件进行统计学处理。结果 (1)细胞形态学改变:缺氧复氧组与对照组相比,内皮细胞形状上不规则,细胞边界不清,细胞间隙变宽,可见脱落的细胞、细胞碎片及空泡。ANP干预组较缺氧复氧组在形态上发生形变的细胞更少,细胞间隙更窄,脱落的细胞更少,且随着药物浓度的增加,形态上趋于正常。(2)缺氧复氧组与正常对照组比细胞培养液乳酸脱氢酶(LDH)活性较对照组明显增高[(69.35±5.66)U/L vs(31.04±3.43)U/L,P<0.01];药物干预组各亚组较缺氧复氧组LDH活性明显降低(P<0.01),Pearson相关分析示LDH活性与ANP浓度呈负相关,Pearson相关系数为-0.771(P<0.05)。缺氧复氧组培养液中MDA含量较对照组明显升高[(5.94±0.58)nmol/mLvs(1.69±0.16)nmol/mL,P<0.01];药物干预组各亚组MDA含量较缺氧复氧组明显降低(P<0.01),MDA含量与ANP浓度做Pearson相关分析显示:Pearson系数为-0.809(P<0.01).缺氧复氧组SOD活性较对照组明显降低[(15.74±2.17)U/Lvs(47.08±4.23)U/L,P<0.01]。药物干预组各亚组细胞内SOD活性较缺氧复氧组明显升高(P<0.01),当ANP浓度在(0.001～0.05μg/ml)时,pearson相关分析显示:培养液SOD活性与ANP浓度呈正相关:Pearson系数为0.736(P<0.05)?     

17-β雌二醇对培养人脐静脉内皮细胞缺氧损伤的保护作用

目的探讨缺氧对培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的损伤及17-β雌二醇(E2)对其保护作用。方法胰蛋白酶灌流消化法培养原代人脐静脉内皮细胞,建立细胞缺氧模型。随机分为五组:对照组、缺氧12h组、缺氧24h组、E2+缺氧12h组、E2+缺氧24h组。对照组为常氧下培养的HUVECs,缺氧组按缺氧模型予缺氧下培养HU-VECs,E2+缺氧组予预先加入17-βE2后再缺氧下培养HUVECs。收集各组细胞培养液,Greiss反应测定一氧化氮(NO),放射免疫法测内皮素-1(ET-1);收集各组HUVECs,进行细胞计数,细胞骨架染色观察细胞形态。结果缺氧12h,内皮细胞数由对照组(4.33±0.24)×106/ml减少至(3.23±0.21)×106/ml(P<0.01),形态无明显变化;其分泌NO由对照组(19.28±2.08)nmol/106cell下降至(12.77±1.90)nmol/106cell(P<0.01),ET-1由对照组(95.7±11.32)pg/ml上升至(138.3±10.37)pg/ml(P<0.01)。缺氧24h,内皮细胞数由对照组(4.33±0.24)×106/ml减少至(2.73±0.19)×106/ml(P<0.01),形态变长体积变小;其分泌NO由对照组(19.28±2.08)nmol/106cell下降至(10.76±1.57)nmol/106cell(P<0.01);ET-1由对照组(95.7±11.32)pg/ml上升至(150.1±15.41)pg/ml(P<0.01)。经预先17-βE2处理后能有效抑制上述改变(P<0.01)。结论缺氧可使内皮细胞结构和功能均受损,17-βE2对这种缺氧损伤有保护作用。     

苯那普利对乳鼠缺氧复氧心肌细胞肿瘤坏死因子的影响

目的 观察苯那普利对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤时肿瘤坏死因子(TNF-α)的影响和可能机制.方法 采用纯化的乳鼠心肌细胞复制缺血再灌注模型.实验分5组正常对照组、单纯缺氧复氧组(HR)、缺氧复氧+苯那普利低剂量组(1×10-7 mol/L)、缺氧复氧+苯那普利中剂量组(1×10-6 mol/L)和缺氧复氧+苯那普利高剂量组(1×10-5 mol/L).细胞缺氧1 h复氧2 h后取细胞培养液测定TNF-α及乳酸脱氢酶(LDH)的活性,取细胞测定超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量.结果 单纯缺氧复氧组与对照组比较,TNF-α(40.32±5.54和5.43±3.32,P＜0.05)、LDH(27.83±2.71和8.0±1.41,P＜0.01)和MDA(0.757±0.036和0.131±0.029,P＜0.01)含量增高,SOD活性明显降低(对照组为36.13±1.43,其他各组为13.20±1.10、8.87±1.43、21.84±1.31、24.34±1.07,分别为P＜0.01和P＜0.05);各组苯那普利均减弱TNF-α的表达,减少MDA的生成和LDH的释放,明显提高SOD活性,并呈剂量依赖趋势.结论 苯那普利可抑制乳鼠缺氧复氧心肌细胞过度分泌TNF-α,具有明显的抗缺氧复氧损伤、保护心肌的作用.     

缓激肽在血管紧张素(1~7)保护血管内皮细胞中的作用

目的观察缓激肽(BK)在血管紧张素(1~7)[Ang(1~7)]对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)致人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤、凋亡中的影响及可能作用机制。方法体外培养HUVECs,随机分为6组:对照组,AngⅡ组,Ang(1~7)组,AngⅡ+Ang(1~7)组,HOE-140组和AngⅡ+Ang(1~7)+HOE-140组。采用分光光度计测定培养的HUVECs乳酸脱氢酶(LDH)漏出,流式细胞仪技术检测细胞凋亡,硝酸还原酶法和放射免疫分析技术分别测定HUVECs上清液中一氧化氮(NO)和内皮素-1(ET-1)的含量,免疫组化法结合图像分析测定细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达。结果(1)与对照组比较,AngⅡ(0.1μmol/L)孵育细胞24h后显著增加HUVECs的LDH漏出[(231.5±74.4vs76.6±19.4)U/L,P<0.01]、ET-1分泌[(97.6±15.7vs48.8±9.3)pg/mL,P<0.01]、ICAM-1表达[0.070±0.001vs0.041±0.003,P<0.01]和HUVECs凋亡率[24.8%±0.6%vs1.4%±0.6%,P<0.01];Ang(1~7)(1μmol/L)明显抑制了AngⅡ的上述作用,同时还促进HUVECsNO的释放;(2)缓激肽B2受体拮抗剂HOE-140(1μmol/L)明显减弱Ang(1~7)对抗AngⅡ的作用(P<0.01);(3)单用Ang(1~7)、HOE-140对HUVECs无明显影响。结论Ang(1~7)能有效抑制AngⅡ引起的HUVECs的损伤和凋亡,其作用至少部分是通过BKB2受体介导的。     

缺血预适应对缺氧复氧后细胞离子稳态的影响及机制

研究缺血预适应对大鼠心肌细胞缺氧 复氧后离子稳态的影响及可能机制以及探讨缺血预适应抗心律失常的离子基础。采用Langdorff逆行灌流技术分离SD大鼠心肌细胞。按①缺血预适应组、②Glibenclamide干预缺血预适应组、③哇巴因 (OUB)干预缺氧 复氧组、④缺氧 复氧组、⑤Cromakalim(CRK)干预缺血预适应组、⑥OUB和CRK干预缺氧 复氧组、⑦正常对照组 ,分组孵育细胞 ,观察缺血预适应对缺氧 复氧后心肌细胞内钠、钾离子水平 ,细胞膜Na+ K+ ATP酶 (Na+ K+ ATPase)活性的影响。结果 :与单纯缺氧 复氧相比 ,缺血预适应使心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出量下降 (2 1.75± 7.2 9vs 89.6 3± 2 4IU) ;同时维持Na+ K+ ATPase活性在较高水平 (6 .42± 0 .8vs 3 .18±0 .6 2 μmol·mg-1·h-1) ,保持细胞内较高的钾离子水平 (386 .5± 83vs 10 7.5± 2 9.96 μg/mg)和较低的钠离子水平(372 .5± 5 7.2 7vs 5 6 3 .0 7± 94.0 2 μg/mg)。此效应可被OUB及ATP敏感性钾通道阻滞剂Glibendamide所阻断。结论 :缺血预适应促进ATP敏感性钾通道的开放 ,减轻细胞膜损伤 ,维持细胞核Na+ K+ ATPase在较高水平 ,从而减少了缺氧 复氧后钠超载 ,增加了钾离子的再摄取 ,可能是缺血预适应稳定离子稳态的机制。细胞内外离子稳态的形成可?     

内皮素-1对缺氧/复氧所致心肌细胞凋亡的影响

目的探讨在缺氧/复氧过程中不同时期给予内皮素-1（ET-1）对缺氧/复氧所致心肌损伤与凋亡的影响。方法乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模型,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡,Hoechst 33258染色计算凋亡率,试剂盒检测乳酸脱氢酶（LDH）的活性。结果ET-1预处理组（EP）细胞生存率较缺氧复氧组（HR）提高,凋亡率下降,LDH活性下降;ET-1缺氧即刻处理组（EH）细胞生存率较HR组降低,凋亡率升高,LDH释放量增加;ET-1复氧处理组（ER）的细胞生存率、凋亡率及LDH活性与HR组均无统计学差异。结论ET-1预处理有心肌细胞保护作用,ET-1缺氧时有促进心肌细胞损伤和凋亡的作用。     

卡托普利晚期预处理对缺氧复氧心肌细胞游离钙的影响

目的观察卡托普利晚期预处理对缺氧复氧心肌细胞游离钙的影响,评价其延迟心肌的保护作用。方法建立培养乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤模型。设正常对照组、缺氧复氧组、缺氧预适应组、卡托普利预处理组、蛋白激酶C阻断剂+卡托普利组、一氧化氮合酶阻断剂+卡托普利组和核因子κB阻断剂+卡托普利组。利用分光光度计测定丙二醛和超氧化物岐化酶含量;全自动生物化学分析仪测定乳酸脱氢酶含量。Flou3AM负载染色和流式细胞分析技术测定细胞内钙离子浓度。结果卡托普利预处理和缺氧预处理均可减轻缺氧再灌注时心肌细胞内钙离子浓度增加(594±5nmolL、507±32nmolL比789±9nmolL,P<0.01),抑制乳酸脱氢酶和丙二醛的增加和超氧化物岐化酶含量的降低;但与对照组(414±37nmolL)比较钙内流仍有轻度增加(P<0.05);预先分别加入蛋白激酶C阻断剂、一氧化氮合酶阻断剂、核因子κB阻断剂与卡托普利共同孵育细胞,行缺氧复氧损伤所测得细胞内钙离子浓度分别为676±32nmolL、700±37nmolL和689±11nmolL,与卡托普利预处理组比较有所增加(P<0.05);但与缺氧复氧组比较仍有降低(P<0.05)。结论以上提示,卡托普利预处理可抑制缺氧复氧时的钙超载及其脂质过氧化损伤。其机制可能是通过轻度增加钙内流、启动心肌延迟保护作用;其过程可能涉及蛋白激酶C、一氧化氮合酶和核因子κB信号转导通路中的多个环节。     

腺病毒介导HIF-1基因转染对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用

目的:研究腺病毒介导缺氧诱导因子-1α基因转染对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用。方法:采用纯化培养的新生大鼠心肌细胞建立缺血再灌注损伤模型,实验分6组:正常细胞培养组,缺氧复氧损伤模型组(I/R组),基因转染小、大剂量组(AdHIF-1α组,MOI50,100),转染腺病毒空载体组(AdBlank组),转染HIF-1α核酶基因组(AtHIF-1α组)。测定各组缺氧复氧后细胞损伤指标乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)含量及细胞活性情况。结果:AdHIF-1α组(MOI50,100)较I/R组、AdBlank组、AtHIF-1α组LDH、MDA明显降低,细胞活性高(P<0.05)。结论:腺病毒介导HIF-1α基因转染心肌细胞具有抗缺血再灌注损伤、保护心肌的作用。     

丝裂素活化蛋白激酶参与心肌缺氧预处理的延迟保护作用

目的　探讨丝裂素活化蛋白激酶 (mitogen- activated protein kinase,MAPK)在心肌缺氧预处理延迟保护中的作用。方法　在培养乳鼠心肌细胞缺氧预处理的模型上 ,检测预处理后即刻、1h、6 h和 12 h的 MAPK活性变化 ,观察细胞缺氧 /复氧损伤后、延迟预处理后及蛋白激酶 C(PKC)抑制剂 chelerythrine(Ch)干预后的细胞存活率、L DH的释放、MDA含量和 SOD活性。结果　 MAPK活性在预处理后即刻明显增加 (P<0 .0 1) ,在 6 h后降至或接近对照水平。与未预处理组心肌细胞缺氧 /复氧损伤相比较 ,预处理后 2 4 h心肌细胞存活率增高 [(5 8.6 4± 5 .5 3) %vs (44 .2 9± 4 .2 7) % ,P<0 .0 1],L DH[(5 9.5 0± 11.0 8) U/ L vs(83.17± 13.6 9) U/ L,P<0 .0 1]和 MDA含量[(2 .33± 0 .4 9) nmol/ L vs(3.2 9± 0 .2 6 ) nmol/ L,P<0 .0 1]均降低 ,SOD活性增加 [(2 1.5 3± 3.6 3) n U/ m l vs(12 .86± 2 .6 8) n U/ ml,P<0 .0 1]。PKC抑制剂 chelerythrine可消除预处理的延迟保护作用。结论　预处理 2 4 h心肌细胞对再次缺氧 /复氧有保护作用 ,PKC、MAPK均参与心肌细胞预处理后的延迟保护作用     

苯那普利对乳鼠心肌细胞缺氧复氧自由基损伤的保护作用

目的观察苯那普利对乳鼠心肌细胞缺氧复氧自由基损伤的保护作用和作用途径.方法采用纯化的乳鼠心肌细胞复制缺血再灌注模型.实验分为6组:正常对照组、单纯缺氧复氧组、缺氧复氧 苯那普利低剂量组(1×107 mol/L)、缺氧复氧 苯那普利组中剂量组(1×106 mol/L)、缺氧复氧 苯那普利高剂量组(1×105 mol/L)、缺氧复氧 中剂量苯那普利 缓激肽B2受体拮抗剂(HOE140)组(1×106 mol/L).细胞缺氧1 h复氧2 h后取培养液测定乳酸脱氢酶(LDH)的活性,取细胞测定MTT代谢率、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA).结果细胞缺氧复氧时LDH及MDA含量较对照组明显增高(P＜0.01),SOD活性及MTT代谢率较对照组明显降低(P＜0.01);不同剂量的苯那普利组降低LDH和MDA含量,提高SOD活性和MTT代谢率,与缺氧复氧组比较(P＜0.01),并呈剂量依赖性改变;苯那普利与HOE140合用时,与中剂量苯那普利组比较上述指标呈反向变化,差异有统计学意义(P＜0.01).结论苯那普利通过抗自由基达到对缺氧复氧损伤心肌的保护作用,其作用可能与激活激肽-缓激肽释放系统,促进缓激肽的合成有关.     

全氟化碳对人脐静脉内皮细胞缺氧/复氧损伤的影响

目的:研究全氟化碳(perfluocarbon,PFC)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)缺氧/复氧损伤模型的保护作用。方法:采用化学方法(连二亚硫酸钠溶液法)制备缺氧/复氧(H/R)损伤模型。实验分组为对照组、10%PFC组、H/R组、PFC+H/R处理组(5%、10%、20%)(以上均为培养液体积比)。CCK-8法测定细胞活力;比色法依次检测培养液中乳酸脱氢酶(1actate dehydrogenase,LDH)外漏量和胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)、一氧化氮(nitric oxide,NO)的含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性。结果:与对照组相比,10%PFC组中各待检指标差异均不明显(P0.05)。相比于模型组,10%、20%PFC处理组能提高细胞活力A、降低胞内NO含量(P0.05);5%、10%、20%PFC处理组能显著降低LDH外漏量、胞内MDA含量及提高SOD活性(P0.01)。结论:PFC对HUVECs缺氧/复氧损伤具有明显的保护作用,其作用机制可能与抑制氧化应激及炎症反应,提高细胞抗氧化的防御能力有关。     

碱性成纤维细胞生长因子诱导老年大鼠心肌细胞保护及其机制研究

目的　探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对老年大鼠心肌细胞缺氧/复氧（H/R）损伤的影响及其保护机制。　方法　在分离的老年大鼠心肌细胞H/R模型上,观察bFGF预孵育对H/R后心肌细胞乳酸脱氢酶（LDH）漏出、ATP含量和细胞存活率的影响,并采用滤纸法测定心肌细胞外信号调节激酶(ERKs)活性的变化。　结果　bFGF激活ERKs,并呈剂量依赖性减轻H/R所致心肌细胞损伤,表现为细胞存活率〔bFGF10ng组(70.0±4.6)%,H/R组(53.0±4.5)%,P＜0.01〕和细胞内ATP含量〔bFGF10ng组(23.1±2.3)nmol/106细胞,H/R组(12.3±2.1)nmol/106细胞,P＜0.01〕升高,细胞浆酶LDH漏出〔bFGF10ng组（257.3±51.0）U/L,H/R组（372.5±69.2）U/L,P＜0.05〕减少;ERKs上游激酶抑制剂PD098059完全消除上述保护作用〔PD098059组细胞存活率（57.0±5.8）%,ATP含量（15.1±2.6）nmol/106细胞,培养液中LDH活性（325.5±59.0）U/L,与bFGF10ng组比较均为P＜0.01〕。　结论　bFGF可以提高老年大鼠心肌细胞对于缺氧的耐受性,其保护机制涉及ERKs的活化。     

白藜芦醇通过TLR4通路对H9C2细胞高糖缺氧/复氧损伤的作用

目的 观察白藜芦醇(RES)对H9C2心肌细胞高糖及缺氧/复氧条件下Toll样受体4(TLR4)表达的影响,探讨RES通过TLR4通路对糖尿病心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护机制。方法 培养H9C2心肌细胞建立缺氧/复氧及高糖心肌细胞损伤模型,并给予白藜芦醇处理。随机将H9C2心肌细胞分为对照组、缺氧/复氧组、缺氧/复氧+RES处理组、高糖组、高糖+缺氧/复氧组、高糖+缺氧/复氧+RES处理组。ELISA法测定各组乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量,CCK8和AnnexinV/PI分别检测细胞增殖和凋亡,Western-blot法检测TLR4蛋白的表达水平。结果 与对照组相比,缺氧/复氧组及高糖组细胞增殖、SOD水平明显下降(P<0.05),LDH、MDA水平明显升高(P<0.05),TLR4表达明显增多,缺氧/复氧组细胞凋亡率明显升高(P<0.05),而高糖组细胞凋亡率有所升高,但差异无统计学意义。RES处理后,缺氧/复氧+RES组、缺氧/复氧+高糖+RES组LDH、MDA水平及细胞凋亡率与缺氧/复氧组、高糖组及缺氧/复氧+高糖组比较明显降低(P<0.05),SOD水平及细胞增殖能力与缺氧/复氧组、高糖组及缺氧/复氧+高糖组比较显著提高(P<0.05);TLR4蛋白的表达在缺氧/复氧和高糖组均有明显上升,在加入RES后,缺氧/复氧+RES组、缺氧/复氧+高糖+RES组TLR4蛋白表达量与缺氧/复氧组、高糖组及缺氧/复氧+高糖组比较均有下降,但差异无统计学意义。结论 白藜芦醇通过TLR4通路抑制TLR4蛋白表达可能是其减轻糖尿病心肌细胞缺氧/复氧损伤的机制之一。     

银丹心脑通胶囊对缺氧复氧心肌细胞损伤的抗氧化作用

目的 评价银丹心脑通胶囊对心肌细胞的抗氧化保护作用.方法 对培养的乳鼠心肌细胞造成缺氧/复氧损伤模型,比较正常对照组、缺氧/复氧损伤组、银丹心脑通各组培养液中过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和一氧化氮(NO)含量.结果 缺氧/复氧损伤模型组CAT和GSH-Px活性较正常对照组明显降低(P<0.01),NO含量显著升高(P<0.01);而银丹心脑通中、高剂量组CAT、GSH-Px较缺氧/复氧损伤模型组明显升高(P<0.05或P<0.01).结论 银丹心脑通对缺氧/复氧造成的心肌细胞损伤具有保护作用,作用机制与增强细胞抗氧化作用,减轻自由基和脂质过氟化物导致的细胞膜损伤有关.     

Janus激酶2/信号转导和转录激活子3信号通路在心肌细胞缺氧损伤中的作用

目的探讨Janus激酶2/信号转导和转录激活子3(JAK2/STAT3)信号通路在心肌细胞缺氧损伤中的作用。方法体外培养的新生大鼠心肌细胞,构建缺氧模型,按随机数字表法分为正常对照组、缺氧组、JAK2抑制剂AG490处理组和STAT3抑制剂Statti c处理组。采用细胞计数试剂盒CCK-8检测心肌细胞活力,采用比色法检测细胞上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量,并采用缺口末端标记法(TUNEL)检测各组细胞的凋亡率。采用蛋白质印迹(Western blot)检测JAK2及STAT3蛋白表达及磷酸化情况。结果与正常对照组相比,缺氧组心肌细胞成活率明显降低,为对照组的30.14%±6.23%(P<0.01),细胞上清液中LDH、MDA含量升高明显,分别为(50.11±2.58)U/L和(19.55±1.81)mol/L(均为P<0.01),SOD活力则显著降低,为(10.21±0.57)U/ml(P<0.01),缺氧组凋亡率明显升高,为24.24%±4.37%(P<0.01),JAK2、STAT3磷酸化水平上调。AG490及Stattic预处理后,JAK2及STAT3磷酸化水平降低,心肌细胞成活率明显升高(P<0.01),LDH、MDA含量显著低于缺氧组(均为P<0.01),SOD活力则高于缺氧组(P<0.01)。结论 JAK2/STAT3信号通路参与了缺氧所致心肌细胞损伤,抑制JAK/STAT通路有助于减轻缺氧所致心肌损伤。     

Hsp22对缺氧/复氧损伤人脐静脉内皮细胞保护及Bcl-2、Caspase-3的表达

目的研究热休克蛋白22(Heat shock protein22,Hsp22)对缺氧/复氧损伤人脐静脉内皮细胞(HUVECs)保护作用,并探讨Hsp22调节bcl-2和caspase-3表达。方法把pGcsi-U6/Neo/GFp/shRNA/HSP22稳定转染HUVECs,Western blot印迹检测Hsp22蛋白在对照组、Lipo组、未转染组和转染组缺氧24 h/复氧0 h表达;MTT检测转染组和未转染组缺氧24 h/复氧0 h、3 h、6 h、12 h生长抑制:RT-PCR和Western blot印迹检测bcl-2和caspase-3转染组和未转染组缺氧24 h/复氧0 h、3 h、6 h、12 h基因和蛋白表达水平。结果 (1)转染组显著低于比对照组、Lipo2000组和未转染组(0.20±0.02 vs.0.43±0.03 vs.0.45±0.06 vs.0.48±0.05,P<0.05)而对照组、Lipo2000组和未转染组组间无显著差异(P>0.05)。(2)转染组抑制高于未转染组相同复氧时间点(58.5%±2.1%vs.41.6%±5.4%、62.7%±5.4%vs.45.6%±3.7%、65.4%±8.4%vs.48.5%±5.2%和68.6±6.7%vs.52.9%±3.4%,P<0.05)。(3)转染组bcl-2基因和蛋白在相同复氧时间点均低于未转染组:(1.85±0.06 vs.2.65±0.15、1.66±0.04 vs.2.35±0.08、1.09±0.05 vs.2.05±0.08、0.69±0.04 vs.1.75±0.09,P<0.05)和(0.54±0.04 vs.1.05±0.05、0.32±0.05 vs.0.75±0.03、0.29±0.02 vs.0.55±0.03、0.13±0.04 vs.0.45±0.07,P<0.05)。(4)转染组caspase-3基因和蛋白在相同复氧时间点均高于未转染组:(2.75±0.04 vs.1.75±0.07、2.96±0.04 vs.1.95±0.06、3.59±0.05 vs.2.45±0.05、3.59±0.05 vs.2.77±0.09,P<0.05)和(9.36±0.11 vs.3.05±0.12、8.82±0.07 vs.2.65±0.12、6.18±0.24 vs.2.05±0.11、3.59±0.05 vs.1.75±0.04,P<0.05)。结论 (1)稳定转染并缺氧/复氧损伤后,转染组Hsp22蛋白表达明显低于对照组而对照组、Lipo组和未转染组组间Hsp22蛋白无显著差异;(2)Hsp22对缺氧/复氧损伤HUVECs起保护作用;(3)Hsp22通过上调bcl-2和下调caspase-3基因和蛋白表达保护受损细胞。     

肺缺血再灌注细胞模型的建立及Bag-1表达

目的 建立肺缺血再灌注细胞模型并研究BCL-2结合抗凋亡基因(BCL-2 associated anthanogen-1,Bag-1)在肺缺血再灌注中的表达,以期为研究Bag-1在肺缺血再灌注疾病的作用机制提供实验基础。方法 本课题以A549细胞系作为肺缺血再灌注模型的细胞模型,实验分5组,将A549细胞给予不同缺氧时间：0 h、6 h、12 h、18 h、24 h缺氧,再复氧24 h处理后,通过低温、低氧、葡萄糖剥夺建立缺血再灌注细胞模型。通过比较5组细胞活性、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)以及活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)水平,确定建模效果,同时观察Bag在肺缺血再灌注中的表达。结果 不同缺氧时间处理后,缺氧组细胞活性均较正常组细胞活性降低(P<0.01),并随缺氧时间延长细胞活性下降,各时间点间细胞活性存在显著差异(F=85.03,P<0.001)。缺氧组LDH、ROS浓度均较正常组细胞明显升高(P<0.01),各时间点间LDH(F=107.67,P<0.001)、ROS(F=42...     

Calpain对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤中自噬过程的作用

目的探讨calpain是否通过改变细胞自噬水平而参与心肌缺血再灌注(I/R)损伤。方法原代乳鼠心肌细胞分离培养,建立原代心肌细胞缺氧/复氧模型(H/R)模拟心肌I/R损伤,分为对照组,H组(缺氧12小时),HR组(缺氧12小时后复氧3小时),HR+ALLN组(calpain抑制剂ALLN预处理30min后缺氧12小时复氧3小时),HR+CQ组(自噬流抑制剂氯喹预处理30min后缺氧12小时复氧3小时),HR+ALLN+CQ组(氯喹和ALLN预处理30min后缺氧12小时复氧3小时)。检测各组calpain活性,心肌细胞损伤指标乳酸脱氢酶(LDH),心肌细胞活力(MTT法),WesternBlot检测自噬相关蛋白LC3的表达,以LC3II/LC31比值作为自噬程度指标,以氯喹干预检验自噬流。结果缺氧使calpain激活(p0.001),心肌细胞LDH释放增加(p0.001),心肌活力下降(p0.001),同时自噬上调(p0.05),复氧时calpain活性更高(p0.005),LDH量更高(p0.001),心肌活力更低(p0.001),自噬更增强(p0.01),而自噬流未受阻。ALLN抑制calpain激活(p0.001),使H/R心肌细胞LDH释放减少(p0.001),改善细胞活力(p0.001),这种改善伴随着自噬上调(p0.01),自噬流未受影响,提示calpain有抑制H/R心肌细胞的自噬的作用。结论calpain通过抑制心肌细胞的自噬反应而参与I/R损伤。     

参附注射液对大鼠肝缺血再灌注NF-kappaB和PGI2/TXA2的影响

目的: 探讨参附注射液对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用及其机制. 方法: 24只Wistar大鼠随机分为IR组和SF组. SF组腹腔注射参附注射液, 10 mL/kg. IR组大鼠给予相同剂量的生理盐水. 两组均采用Pringle's法阻断肝门缺血15 min再灌注1 h、3 h, 测定血浆血栓素B2(thromboxane B2, TXB2)、6-酮-前列腺素F1alpha(6-keto-PGF1alpha)、肝组织NF-kappaB p65表达和肝组织匀浆GSH含量, 及观察肝组织形态学改变. 结果: 再灌注3 h SF组血浆TXB2低于IR组(118.7±19.1 vs 386.3±282.7, P>0.05), 6-keto-PGF1alpha高于IR组(1081.7±282.7 vs 960.0±209.9, P>0.05), 二者比值TXB2/6-keto-PGF1alpha低于IR组(0.11±0.03 vs 0.39±0.24, P<0.05); 再灌注1 h SF组NF-kappaB p65表达低于IR组(59.33%±11.06% vs 75.83%±11.46%, P<0.05); 而GSH稍高于IR组(47.59±19.07 vs 37.32±4.71, P>0.05). SF组肝实质细胞和线粒体损伤明显减轻. 结论: 参附注射液对肝缺血再灌注损伤有保护作用, 其机制与降低TXA2/PGI2比值, 抑制NF-kappaB活化有关.     

氧化应激在血管内皮细胞缺氧/再给氧损伤中的作用

目的探讨冠状动脉内皮细胞(CAEC)缺氧再给氧(H/R)损伤发生机制及抗氧化剂吡咯烷二硫氨基甲酸脂(pyrroli dinedithiocarbamate,PDTC)对它的影响。方法将体外培养的猪CAEC分为3组。对照组:未经处理;H/R组:将细胞作H/R处理;PDTC组:于培养液中加入PDTC而后作H/R处理。分别检测各组CAEC谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达。结果在相应时间点,对照组细胞GSH、MDA的含量及ICAM-1表达无明显改变;H/R组及PDTC组细胞GSH含量明显低于对照组,而MDA的含量及ICAM-1表达明显增高,其中PDTC组细胞GSH含量又明显高于H/R组,MDA的含量及ICAM-1表达明显低于H/R组。结论H/R损害CAEC,使其GSH含量明显减少、MDA含量及ICAM-1表达明显增加;PDTC有效降低ICAM-1活性,减轻H/R损伤。提示氧化应激在血管内皮细胞缺氧-再给氧损伤过程中起重要作用。