应用流式细胞术测定CD24表达鉴定人髓核细胞

背景:CD24是成熟髓核细胞表面表达的特异性分子,测定CD24的表达是否可以作为鉴定髓核细胞的一种方法?目的:验证流式细胞仪测定髓核细胞CD24表达鉴定髓核细胞的方法。方法:采用酶消化法分离培养人髓核细胞,取生长旺盛的第2代人髓核细胞爬片进行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,RT-PCR测定Ⅱ型胶原及SOX9的表达,流式细胞仪检测其CD24阳性表达率,分析来自同一批细胞的免疫组织化学染色、RT-PCR结果与CD24阳性率的相关性。结果与结论:体外分离培养的7例第2代髓核细胞爬片Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,RT-PCR结果阳性,流式细胞仪测定CD24其阳性率均为50%以上,髓核细胞分泌胞外基质Ⅱ型胶原与SOX9的表达与CD24阳性率结果有相关性。提示采用流式细胞仪测定CD24表达可以快速、简便地鉴定髓核细胞。     

TGF-β1对人髓核细胞 CD24及细胞外基质表达的调节作用

目的采用流式细胞术和荧光定量PCR观察TGF-β1因子对人髓核细胞表型CD24表达变化及细胞外基质合成的调节作用,为进一步了解髓核细胞特性提供支持.方法采用机械酶消化法分离培养人髓核细胞,利用流式细胞术联合免疫组化方法鉴定髓核细胞. TGF-β1持续刺激髓核细胞24 h、72 h、6 d后,流式细胞术观察CD24表达变化;RT-PCR检测不同作用时间CD24、SOX9、Ⅱ型胶原、蛋白多糖mRNA表达变化.结果体外分离培养的第2代髓核细胞表现为多边形或三角形,此类细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,比例为33%~60%,部分细胞表现为梭形,其Ⅱ型胶原免疫组化染色为弱阳性,流式细胞术检测CD24表达比例介于25%~56%,两种鉴定方法比较无统计学差异(t=27,P>0畅05);TGF-β1刺激人髓核细胞24 h后CD24阳性细胞比例为33畅9%,刺激72 h后CD24阳性细胞比例为76畅2%,刺激6 d后阳性细胞比例为99%;RT-PCR结果显示TGF-β1刺激后CD24、SOX9、Ⅱ型胶原、蛋白多糖mRNA表达量较对照组明显增加,并且存在时间依赖性.结论采用流式细胞术检测成熟髓核细胞CD24表达,在鉴定髓核细胞和检测成熟髓核细胞比例时,具有快速,操作简单,细胞需求量少,结果可靠的优点;TGF-β1可上调CD24基因表达和基质蛋白的合成,促进髓核细胞成熟.     

CD24在初诊结直肠癌患者外周血CD3~+细胞上表达的意义

目的探讨结直肠癌外周血CD3+细胞(荧光强度>104)中CD24的表达及其临床意义。方法 50例初诊结直肠癌患者(观察组)和50名健康体检者(对照组),均应用流式细胞术直接免疫荧光法检测外周血CD3+细胞上CD24的表达水平,比较2组CD3+细胞上CD24荧光强度。结果观察组外周血CD3+细胞上CD24荧光强度为373.02±27.92,对照组为293.84±9.54,2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论结直肠癌患者外周血中CD3+细胞上CD24荧光强度可作为外周血中筛选结直肠癌的一个新的分子标志物。     

CD24在初诊结直肠癌患者外周血CD3~＋细胞上表达的意义

目的探讨结直肠癌外周血CD3＋细胞（荧光强度〉104）中CD24的表达及其临床意义。方法 50例初诊结直肠癌患者（观察组）和50名健康体检者（对照组）,均应用流式细胞术直接免疫荧光法检测外周血CD3＋细胞上CD24的表达水平,比较2组CD3＋细胞上CD24荧光强度。结果观察组外周血CD3＋细胞上CD24荧光强度为373.02±27.92,对照组为293.84±9.54,2组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论结直肠癌患者外周血中CD3＋细胞上CD24荧光强度可作为外周血中筛选结直肠癌的一个新的分子标志物。     

流式细胞检测术分析胎肝CD34^＋细胞成分

目的了解胎肝中CD34+CD38+和CD34+CD38-细胞数量组成.方法从胎肝中分离细胞,制成细胞悬液;经淋巴细胞分离液密度梯度离心,收集单个核细胞;洗涤两次,制备细胞母液;取约1×106细胞经CD34CD38荧光抗体标记,流式细胞仪检测CD34+CD38+和CD34+CD38-细胞含量;用红细胞裂解液裂解残留在MNCs中的红细胞,统计肝细胞中MNCs的相对总数,最终统计出胎肝中CD34+和CD34+CD38-细胞的相对数量.结果 22～30W胎龄胎肝MNC中CD34+细胞平均为12.02%±4.00%,CD34+CD38-细胞平均为6.17%±5.08%,CD34+CD38-细胞在CD34+细胞中约占51.00%±32.56%;该期胎肝组织中CD34+细胞和CD34+CD38-细胞相对总数和胎龄有一定的相关性,30W时明显高于22W.结论 22～30W胎龄胎肝中的CD34+细胞和CD34+CD38-细胞相对百分率都高于胎儿脐血、新生儿脐血、成人骨髓和外周血的百分率;CD34+CD38-细胞在CD34+细胞中的比例也远高于上述四种组织中的比例.     

地塞米松可影响兔髓核细胞增殖及Ⅱ型胶原的表达

背景:地塞米松是细胞增殖的一种常用药物,但能否促进髓核细胞增殖呢?目的:观察地塞米松对兔椎间盘髓核细胞增殖的影响,以及对髓核细胞分泌Ⅱ型胶原的影响。方法:无菌条件下取兔椎间盘,常规分离消化髓核细胞进行培养;传代培养第2代髓核细胞7d,加入塞米松浓度分别为1,10,100,1000,10000nmol/L,培养1~5d每日MTT常规测一组490nm处的吸光值并制定生长曲线。另选取最佳作用浓度100nmol/L地塞米松加入髓核细胞进行培养,以不加于地塞米松为对照。结果与结论:MTT检测结果表明地塞米松对兔髓核细胞增殖有促进作用,最佳作用浓度为100nmol/L,最佳作用时间为48h;RT-PCR检测结果表明经地塞米松处理的髓核细胞其Ⅱ型胶原表达明显较对照组高(P<0.05)。提示地塞米松可以促进兔椎间盘髓核细胞的增殖,并可使兔髓核细胞内Ⅱ型胶原表达增高。     

优化流式细胞术测定保存血小板CD62p表达

CD62p阳性率是保存血小板质量监测的重要指标之一。为在静脉全血内血小板CD62p测定方法的基础上优化建立流式细胞术(FCM)测定保存血小板表达CD62p的方法，在血小板检测标本内加入0．1mmol/L潘生丁稳定血小板；对TBS溶液进行了改良，添加了1．1mmol/L的EDTA和100μmol/L潘生丁，用以代替PBS；采用新鲜富含血小板血浆(FPRP)制备的阴、阳性对照；进行方法学评价。结果表明：加入0．1mmol/L潘生丁和1．1mmol/L的EDTA可以有效防止实验过程中的血小板人为激活；采用新鲜富含血小板血浆(FPRP)制备的阴、阳性对照既可优化FCM分析方法，还可用于检验所购荧光抗体的质量，保证实验结果的有效性。采用泛血小板特异性标志物CD61可灵敏特异地识别血小板，提高了实验抗干扰能力。制备保存血小板时采用的是专用大号采血针，抽血流畅，对血小板CD62p表达测定人为影响很小，明显优于用注射器采集患静脉全血的做法。CD62p测定灵敏度可达1％，制备的标本可稳定48小时。结论：利用该流式细胞术可以灵敏而特异地测定保存血小板的CD62P表达率；该方法简便易行，提高了结果的准确性，具有良好的稳定性和重复性。     

人外周血Vα24 NKT细胞和CD3+CD56+CIK 细胞生物学特性的比较研究

目的进一步认识Vα24 NKT细胞和CIK细胞在生物学特性的差异。方法从人外周血单个核细胞扩增NKT细胞和CIK细胞;经免疫磁珠纯化获得高纯度的TCRVα24 NKT细胞和CD3 CD56 CIK细胞。运用流式细胞术测定纯化后的NKT细胞和CIK细胞的表型、细胞因子和细胞坏死相关因子的表达情况,并用DIOC18染色及流式细胞术测定纯化后的NKT细胞和CIK细胞的细胞杀伤活性。结果经纯化TCRVα24 Vβ11 NKT细胞和CD3 CD56 CIK细胞的纯度均达到>90%;纯化后的Vα24 NKT细胞多数为CD4 和DN NKT细胞,高表达TCRVα24、Vβ11、CD3、CD161,低表达CD56;而纯化后的CIK细胞则以CD8 T细胞为主,高表达CD3、CD56,低表达CD161,几乎不表达TCRVα24和Vβ11。在抗原刺激下,CD3 CD56 CIK细胞的IFN-γ、TNF-α、Perforin、FasL、TRAIL表达水平均高于NKT细胞,但CD3 CD56 CIK细胞几乎不分泌IL-4,而NKT细胞则分泌高水平的IL-4;CD3 CD56 CIK细胞对肿瘤细胞株K562、U937、Jurkat的杀伤率均远远高于NKT细胞。结论TCRVα24 NKT细胞和CD3 CD56 CIK细胞是两类完全不同的细胞群,在抗肿瘤免疫和免疫调节中可能起着不同的作用。     

流式细胞术检测外周血CD14+细胞的活化程度

目的　利用流式细胞术检测外周血CD14+细胞活化程度。方法　应用流式细胞术分别检测了 2 5份 ( 7份肝素抗凝的正常对照标本、7例肝素抗凝、11例枸橼酸钠抗凝的慢性活动性乙型肝炎标本 )外周血 (PBMC)CD14+细胞的侧向角光散射 (颗粒度 )SSC值、细胞活化相关表面抗原 (CD6 9)表达率。结果　肝素抗凝HBV组CD14+细胞颗粒度值 [( 85 3 1± 2 46 3)道 ]高于肝素抗凝正常对照组CD14+细胞颗粒度值 [( 474 5± 47 9)道 ](P≤ 0 0 5 ) ;肝素抗凝HBV组CD14+细胞颗粒度值 [( 85 3 1±2 46 3)道 ]高于枸橼酸钠抗凝组 [( 5 2 0 1± 10 5 6 )道 ](P≤ 0 0 5 ) ;肝素抗凝HBV组CD6 9在CD14+细胞的表达率 ( 2 2 71± 13 5 7) %明显高于肝素抗凝正常对照组CD6 9在CD14+细胞的表达率 ( 7 18±4 2 7) % (P≤ 0 0 5 ) ;肝素抗凝HBV组CD6 9在CD14+细胞的表达率 ( 2 2 71± 13 5 7) %明显高于枸橼酸钠抗凝HBV组 ( 3 93± 3 94) % (P≤ 0 0 1)。结论　采用流式细胞术检测细胞颗粒度、活化抗原表达率 ,是一种灵敏、快速、客观的评价外周血CD14+细胞活化程度的方法 ;使用不同抗凝剂肝素或枸橼酸钠对外周血CD14+细胞颗粒度、活化抗原表达率有影响 ,肝素抗凝血用来检测CD14+细胞活化程度效果更好。     

115例急性髓细胞白血病多参数流式细胞术免疫表型分析

免疫表型检测已成为白血病诊断和分类的重要手段。为了解急性髓细胞白血病(AML)免疫表型特征，利用三色流式细胞术CIM5／SSC参数散点图设门方法，对115例AML患者幼稚细胞表面及胞浆内分化抗原进行分析：结合FAB分类，比较AML不同亚型中抗原表达的差异，并对其诊断价值加以探讨。结果显示：在AML患者中，CD33、CD38和CDl3的表达最常见，分别达94．8％、91．3％、89．6％。在淋系抗原中，CD7的表达最为常见(20．2％)，其次是CD19(16．5％)和CD2(15％)，某些免疫表型特征与FAB分类具有相关性，包括M3中缺乏表达HLA—DR、CD34和CD56，但CD2的表达增加；M2中CD19，M5中CD14和CD56的表达增加，而M0中未见MPO的表达，结论：多参数流式细胞术是诊断AML的一项可靠技术，AML某些免疫表型特征与FAB分类具有明显相关性．     

人髓核细胞中不同滴度慢病毒介导绿色荧光蛋白基因的表达

背景:慢病毒作为基因载体感染椎间盘髓核细胞的感染效率研究具有实际应用价值.目的:测定不同滴度慢病毒介导的绿色荧光蛋白基因感染人髓核细胞的感染条件及感染参数.方法:采用酶消化法分离培养人髓核细胞,利用基因重组技术构建高滴度慢病毒介导的绿色荧光蛋白基因,按照不同感染复数感染第2 代人髓核细胞.结果与结论:第2 代髓核细胞在慢病毒介导的绿色荧光蛋白基因的感染复数为1,10,50,100 时,感染后第4 天荧光显微镜观察,流式细胞术测定其感染效率分别为32.1%,41.1%,54.2%和86.8%,继续传代培养3 代,第5 代椎间盘髓核细胞绿色荧光蛋白的表达仍能保持在60%以上.表明慢病毒介导的绿色荧光蛋白基因在人髓核细胞中可以持续高效表达.     

人髓核细胞中不同滴度慢病毒介导绿色荧光蛋白基因的表达

背景：慢病毒作为基因载体感染椎间盘髓核细胞的感染效率研究具有实际应用价值。目的：测定不同滴度慢病毒介导的绿色荧光蛋白基因感染人髓核细胞的感染条件及感染参数。方法：采用酶消化法分离培养人髓核细胞,利用基因重组技术构建高滴度慢病毒介导的绿色荧光蛋白基因,按照不同感染复数感染第2代人髓核细胞。结果与结论：第2代髓核细胞在慢病毒介导的绿色荧光蛋白基因的感染复数为1,10,50,100时,感染后第4天荧光显微镜观察,流式细胞术测定其感染效率分别为32.1%,41.1%,54.2%和86.8%,继续传代培养3代,第5代椎间盘髓核细胞绿色荧光蛋白的表达仍能保持在60%以上。表明慢病毒介导的绿色荧光蛋白基因在人髓核细胞中可以持续高效表达。     

流式细胞仪检测人白细胞抗原-B27的影响因素

目的获得外周血淋巴细胞人白细胞抗原（HLA）-B27检测准确可靠的结果。方法用双抗体双色免疫荧光标记,流式细胞仪分析,对标本放置不同时间、溶血后洗涤前后的结果进行比较。结果标本放置不同时间可影响检测结果,洗涤可显著增加HLA-B27阳性细胞百分比和细胞表面平均荧光强度。结论制备好的标本应在6 h内检测,溶血后标本宜洗涤后测定,以提高检测的准确性。     

流式细胞术检测人/山羊嵌合体中人源细胞方法的建立与应用

目的 建立应用流式细胞术检测人/山羊嵌合体中人源细胞的方法.方法 通过宫内移植的方法将标记有绿色荧光蛋白(GFP)的人造血于/祖细胞(MIG细胞)移植入胎山羊腹腔内,从而获得人/山羊嵌合体模型(MIG羊).采集MIG羊的外周血,以数十种鼠抗人的抗体标记,筛选出对人源细胞特异性强而与山羊细胞无或仅有微弱交叉反应的抗体,列人流式细胞仪常规检测的首选抗体,继而在非移植山羊的外周血中加入不同比例(25%、50%、75%和100%)的人脐血细胞,用CD+34表面抗体标记来观察人脐血细胞和人CD+34细胞的分布,以决定"门"的区域和大小;取MIG羊的肝脏,应用流式细胞术检测灌流后肝实质细胞中GFP细胞的比例及DNA含量.结果 筛选出CD7、CD15、CD38、CD45CD20CD34CD14和血型糖蛋白A(GPA)等8种单抗作为检测嵌合体中人源细胞的首选抗体;确定了进行流式细胞分析时"门"的大小和区域;MIG羊肝实质细胞中,GFP+细胞的比例为29.1%(29 100/100 000);DNA含量测定结果显示MIG羊肝组织分选获得的GFP+细胞主要呈现2个峰,其位置与人的双峰位置相对应.结论 流式细胞术是研究干细胞在体内分化、归巢和生物学特征的快速、简便、有效的方法;表面抗体以及"门"的选择对于准确检测人/山羊嵌合体中人源细胞至关重要.     

静水压对人椎间盘髓核细胞形态及基质表达的影响

背景：加载在椎间盘上的重力引起的静态压力刺激是椎间盘细胞代谢的重要调节因素。目的：观察静水压对体外单层培养人椎间盘髓核细胞形态学及基质代谢的影响。方法：在静水压加载系统中对体外单层培养的传4代人髓核细胞施以0.3,0.7,3MPa的静压,分别加压30,60,90,120min,以常压0.1MPa为对照。结果与结论：①髓核细胞形态：在静水压干预下细胞体积均变小。0.3,0.7MPa静水压下轻微缩小,细胞形态相对完整;3MPa静水压下缩小最明显,且细胞形态不完整。②髓核细胞存活率：在持续静水压刺激下开始的30min,不论压力大小存活率都偏低,在0.3,0.7MPa时随作用时间延长而增加或维持稳定,细胞增殖逐渐增强,在3MPa时随时间趋于下降,最终细胞总体数量减少。③髓核细胞蛋白多糖：各组表达量随时间增加逐渐增加,当持续加压120min时,在0.3,0.7MPa静水压下合成量呈高表达状态,在0.1,3MPa静压表达相对较少。表明静水压会对髓核细胞形态学、存活率及基质表达产生影响。     

人类髓核细胞分离培养方法的优化选择*

背景：关于人类髓核细胞的分离培养方法不一,所用消化酶组分及消化时间差异较大,如何提高人类髓核细胞获得效率的问题尚未解决。目的：优选人类髓核细胞获取的消化酶组分和消化方法。方法：髓核组织标本取自吉林大学中日联谊医院骨科成人椎间盘3例。无菌条件下取突出至椎管内的急性创伤后椎间盘组织,可见到外周白色的纤维环和中心胶冻样的髓核组织。按不同混合酶组分划分为2组,Ⅰ组成分为0.2%Ⅱ型胶原酶;Ⅱ组成分为先用0.25%胰酶消化30 min,再用0.2%Ⅱ型胶原酶。每组再按消化时间分为2,4 h,过夜3个亚组。最后重悬细胞终体积均定位2 mL 并计数,采用含胎牛血清的 DMEM 培养液体外培养细胞。观察不同组分酶对分离所得髓核细胞数量、活性及增殖能力的影响,采用锥虫蓝染色计数细胞总数及活细胞比值,MTT 法测定髓核细胞生长曲线。结果与结论：采用2种不同酶组分进行消化,发现消化时间2,4 h 时,Ⅱ组消化细胞较Ⅰ组多,但差异无显著性意义(P >0.05)。孵育过夜时,Ⅰ组和Ⅱ组的存活细胞率较消化2,4 h 明显降低,差异有显著性意义(P <0.05)。在作用4 h 时,组织块消失,计数细胞数量最多。提示以Ⅱ型胶原酶为主要成分的Ⅰ组对分离髓核细胞有利,消化时间以4 h 为宜,该条件具有操作简单,效率较高,成本较低等优点,可以认为0.2%Ⅱ型胶原酶消化髓核组织块4 h 为获取髓核细胞的最佳条件。     

流式细胞仪检测人白细胞抗原-B_(27)的影响因素

目的获得外周血淋巴细胞人白细胞抗原(HLA)-B27检测准确可靠的结果。方法用双抗体双色免疫荧光标记,流式细胞仪分析,对标本放置不同时间、溶血后洗涤前后的结果进行比较。结果标本放置不同时间可影响检测结果,洗涤可显著增加HLA-B27阳性细胞百分比和细胞表面平均荧光强度。结论制备好的标本应在6 h内检测,溶血后标本宜洗涤后测定,以提高检测的准确性。     

体外培养人退变髓核细胞的生物学性状

背景：椎间盘退行性变后很难自行修复,研究退变髓核细胞的生物学特性可为研究椎间盘退变机制、组织工程椎间盘构建、基因治疗等提供理论基础。目的：观察体外培养的人退变髓核细胞的生物学特性。方法：分离培养人退变椎间盘髓核细胞,采用光镜、电镜观察细胞的形态和超微结构,荧光定量PCR技术检测髓核细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA的表达。ELISA法检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原水平,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖水平。结果与结论：体外培养的传2代内的退变椎间盘髓核细胞结构与原代细胞相似,传3代后的细胞出现退变及凋亡改变。对体外培养第1代的退变髓核细胞和正常髓核细胞的Ⅱ型胶原和糖胺多糖进行检测发现,退变髓核细胞Ⅱ型胶原、糖胺多糖mRNA水平及细胞外基质中Ⅱ型胶原和糖胺多糖的表达均明显低于正常髓核细胞,呈现去分化趋势。     

体外培养人退变髓核细胞的生物学性状

背景:椎间盘退行性变后很难自行修复,研究退变髓核细胞的生物学特性可为研究椎间盘退变机制、组织工程椎间盘构建、基因治疗等提供理论基础.目的:观察体外培养的人退变髓核细胞的生物学特性.方法:分离培养人退变椎间盘髓核细胞,采用光镜、电镜观察细胞的形态和超微结构,荧光定量PCR技术检测髓核细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA的表达.ELISA法检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原水平,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖水平.结果与结论:体外培养的传2代内的退变椎间盘髓核细胞结构与原代细胞相似,传3代后的细胞出现退变及凋亡改变.对体外培养第1代的退变髓核细胞和正常髓核细胞的Ⅱ型胶原和糖胺多糖进行检测发现,退变髓核细胞Ⅱ型胶原、糖胺多糖mRNA水平及细胞外基质中Ⅱ型胶原和糖胺多糖的表达均明显低于正常髓核细胞,呈现去分化趋势.