骨形态发生蛋白2对14d胎鼠端脑神经干细胞分化为胆碱能神经元的影响

背景:骨形态发生蛋白2可能是参与胆碱能神经元前体细胞分化的细胞外调控因子。目的:观察骨形态发生蛋白2在孕14d胎鼠端脑神经干细胞诱导成胆碱能神经元过程中的作用。方法:取孕14d胎鼠端脑,用含EDTA的胰酶和Ⅰ型胶原酶消化,无血清培养基培养细胞,种植于涂有多聚赖氨酸的培养板,细胞原代培养24h后半量换液,加入10μg/L骨形态发生蛋白2继续培养。结果与结论:胶原酶消化得到的神经干细胞呈单层贴壁生长;Nestin免疫荧光鉴定细胞为阳性,获取的神经干细胞纯度大于99%;ChAT免疫荧光鉴定骨形态发生蛋白2可以将孕14d胎鼠端脑神经干细胞诱导成胆碱能神经元,细胞纯度大于97%。     

胎鼠端脑神经干细胞原代单层化贴壁培养

目的介绍利用胶原酶消化特点,简单而快速地实现神经干细胞原代单层化贴壁培养的方法。方法孕14d的SD大鼠无菌条件下取胎鼠端脑,剪碎后用含EDTA的Ⅰ型胶原酶消化,无血清培养基培养细胞,种植于涂有多聚赖氨酸的培养板;Nestin免疫荧光鉴定细胞性质;计算细胞纯度。结果细胞Nestin免疫荧光阳性;获取的神经干细胞纯度>99%。结论本方法可以简单而快速地获得原代单层化贴壁生长的神经干细胞。     

胶原酶和胰酶对胎鼠端脑神经干细胞培养的影响

背景：神经干细胞为神经发育和神经功能重建的研究带来了广阔前景,其体外培养已成为神经科学的一个研究基础。目的：比较胶原酶和胰酶对体外培养神经干细胞的作用。方法：取孕14d的SD大鼠,无菌条件下取胎鼠端脑,剪碎后分别用含EDTA的胰酶和Ⅰ型胶原酶消化,无血清培养基培养细胞。结果与结论：胶原酶消化得到的神经干细胞呈单层贴壁生长,而用胰酶消化得到的则形成聚集体;Nestin免疫荧光鉴定细胞为阳性;获取的神经干细胞纯度大于99%。提示用胶原酶可以简单而快速地获得原代单层化贴壁生长的神经干细胞。     

提高胚胎大鼠神经干细胞数量的实验方法

目的：通过培养了解神经干细胞的生物学特性，着重从胎龄选择、优化分离和换液方法上提高神经干细胞的增殖能力和生长数量。方法：实验于2004-04／2005-09在锦州医学院中心实验室完成。①雌性SD大鼠35只，每日做阴道细胞涂片，排卵期雌雄合笼，以出现精栓计为受孕第0．5天。分别于孕10．5，11．5，12．5，13．5，14．5，16．5，18．5d取出大鼠胚胎体，每时间点各5只。②通过采用机械分离和酶消化分离相结合的方法分离培养不同胎龄大鼠脑神经干细胞。③换液首次采用分瓶法以后采用低速离心半量换液。④采用免疫细胞化学技术分别检测神经干细胞特征性标志巢蛋白表达和用血清诱导分化为大量神经元微管组合蛋白2和神经胶质纤维酸性蛋白表达。结果：①胎龄为12．5d的胎鼠提取的神经干细胞集落最多，其次为13．5d。②在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖，形成悬浮生长的呈巢蛋白阳性的神经球。③用血清诱导分化为大量表达微管组合蛋白2阳性的神经元和胶质纤维酸性蛋白阳性的神经胶质细胞。结论：考虑到生长因子在孕13-15d能够很好地发挥作用，故选择胎龄为13．5d胎鼠作为实验材料较为合适。通过采用机械分离和消化分离相结合的方法分离和原液首次采用分瓶法显著提高了神经干细胞的培养数量，培养出的细胞具有自我更新能力和增殖能力，可分化为神经元、神经胶质细胞及少突胶质细胞。     

提高胚胎大鼠神经干细胞数量的实验方法

目的:通过培养了解神经干细胞的生物学特性,着重从胎龄选择、优化分离和换液方法上提高神经干细胞的增殖能力和生长数量。方法:实验于2004-04/2005-09在锦州医学院中心实验室完成。①雌性SD大鼠35只,每日做阴道细胞涂片,排卵期雌雄合笼,以出现精栓计为受孕第0.5天。分别于孕10.5,11.5,12.5,13.5,14.5,16.5,18.5d取出大鼠胚胎体,每时间点各5只。②通过采用机械分离和酶消化分离相结合的方法分离培养不同胎龄大鼠脑神经干细胞。③换液首次采用分瓶法以后采用低速离心半量换液。④采用免疫细胞化学技术分别检测神经干细胞特征性标志巢蛋白表达和用血清诱导分化为大量神经元微管组合蛋白2和神经胶质纤维酸性蛋白表达。结果:①胎龄为12.5d的胎鼠提取的神经干细胞集落最多,其次为13.5d。②在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖,形成悬浮生长的呈巢蛋白阳性的神经球。③用血清诱导分化为大量表达微管组合蛋白2阳性的神经元和胶质纤维酸性蛋白阳性的神经胶质细胞。结论:考虑到生长因子在孕13～15d能够很好地发挥作用,故选择胎龄为13.5d胎鼠作为实验材料较为合适。通过采用机械分离和消化分离相结合的方法分离和原液首次采用分瓶法显著提高了神经干细胞的培养数量,培养出的细胞具有自我更新能力和增殖能力,可分化为神经元、神经胶质细胞及少突胶质细胞。     

鼠胚胎神经干细胞的体外培养及诱导分化

背景:随着神经干细胞培养技术条件的成熟,为颅脑损伤后神经系统功能重建、神经再生和神经系统疾病治疗提供了新的思路和途径.但移植所用的细胞来源及移植后的神经干细胞能否分化为神经细胞是急需解决的重要问题.目的:拟将体外分离培养的鼠胚胎神经干细胞稳定增殖传代,并诱导分化出神经系统的3种基本细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-06/2008-06在新疆维吾尔自治区人民医院完成.材料:14～16d孕龄Wistar大鼠胚胎,由新疆自治区实验动物研究所和新疆医科大学实验动物中心提供.方法:取胎鼠额叶大脑皮质,组织块消化法体外分离培养神经干细胞,在表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和B27联合作用下使其稳定增殖.原代培养7 d后,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导14 d.主要观察指标:倒置显微镜下观察神经干细胞的生长形态,并行巢蛋白免疫荧光染色鉴定.应用免疫组化染色检测诱导后神经干细胞的分化情况.结果:原代培养一两天细胞散在分布,胞体较小,呈圆形,折光性较好,3 d后逐渐形成由数个细胞组成的细胞球;传代后贴壁细胞多数分化为长梭形或扁平形的胶质细胞,10 d时可见大量由数十至数百个细胞组成的较大细胞球,其生长速度基本与原代培养相同,但成球速度明显加快;免疫荧光染色呈巢蛋白阳性反应.以含体积分数为10%胎牛血清的培养液诱导后,免疫化学染色示神经干细胞球呈神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、髓鞘碱性蛋白阳性表达.结论:实验成功从鼠胚胎脑皮质分离培养出神经干细胞,并诱导分化为神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞.     

无血清条件下体外分离培养鼠胚胎脑组织神经干细胞

背景:神经干细胞的体外培养成功为治疗中枢神经系统疾病提供了新的思路,但神经干细胞的分化和功能修复机制尚不甚清楚.移植后的细胞能否与体内细胞结合以及建立起正常的神经系统突触联系急需解决.目的:在无血清条件下体外分离培养胚鼠神经干细胞,观察其生长及分化情况.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-03/2008-01在天津市环湖医院神经干细胞室完成.材料;孕14～16 d的SD大鼠,由北京维通利华实验动物中心提供.方法:取孕鼠胚胎的脑海马组织.通过机械分离和胰蛋白酶消化结合法体外分离培养神经干细胞,在含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子及B27的无血清DMEM/F12培养基中传代扩增.取原代培养7 d的神经干细胞,制备单细胞悬液,接种后加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液诱导3 d.主要观察指标:倒置显微镜下观察神经干细胞的增殖分化过程,并行免疫荧光染色鉴定.通过细胞免疫化学染色检测诱导分化后的细胞类犁.结果:分离培养的神经干细胞在无血清培养基中不断分裂增殖,8 d左右即可形成胞体透亮、折光性好的干细胞球,悬浮生长,免疫荧光染色巢蛋白呈阳性表达.神经干细胞球诱导5 d,免疫细胞化学染色后可见胶质纤维酸性蛋白及神经元特异性烯醇酶呈阳性表达的细胞.结论:体外无血清条件下,分离培养的神经干细胞生长状态良好,且具有自我更新和增殖能力.诱导后能够向神经元及星形胶质细胞方向分化.     

胎鼠侧脑室神经干细胞的培养及鉴定

目的：从胎鼠侧脑室中分离神经干细胞,并对其进行培养及鉴定。方法采用无血清培养基分离培养来自胎鼠侧脑室的神经干细胞,并诱导其分化,用免疫荧光细胞化学的方法检测BrdU、Nestin和SOX2以及神经元标记物TuJ1的表达。结果胎鼠的侧脑室能够分离培养出具有增殖能力的神经球,呈Nestin和SOX2阳性,分化诱导后产生TuJ1阳性的神经元。结论胎鼠的侧脑室能够分离培养出神经干细胞,并能够在体外增殖、诱导分化为神经元。     

人胚胎脑组织蛋白提取物诱导人胎盘间充质干细胞向神经细胞的分化

背景：选择合适的诱导方法诱导人胎盘间充质干细胞分化为神经元样细胞是临床治疗神经损伤的关键。目的：在人胎盘间充质干细胞中加入商品化的人胚胎脑组织蛋白提取物,观察其诱导分化为神经元样细胞的可行性。方法：采用酶消化法分离培养人胎盘间充质干细胞,传至第3代,将人早期胚胎脑组织蛋白提取物加入诱导培养基培养6 d,加入浓度为20 nmol/L全反式维甲酸和500μg/L音猬因子培养3 d,换新的培养液,包含体积分数为10%胎牛血清,10μg/L脑源性神经营养因子,20μg/L神经胶质细胞源性神经营养因子,50μg/L胰岛素样生长因子Ⅱ型继续培养3 d。结果与结论：胎盘组织经酶消化后获得贴壁细胞,传至第2代细胞形态为梭形,成漩涡样生长,传至第3代细胞形态较均一。诱导后细胞经免疫细胞化学法检测均表达神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白、神经生长相关蛋白43;ELISA法检测细胞培养上清脑源性神经营养因子、神经营养因子3、神经营养因子4为阳性表达;RT-PCR检测细胞微管相关蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、神经生长相关蛋白43均为阳性表达。结果表明人胚胎脑组织蛋白提取物使人胎盘间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞。     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及其基本属性的观察

目的分别以单纯机械吹打法和胰蛋白酶消化法分离培养神经干细胞(NSCs),并观察NSCs的生长、增殖和分化特点。方法采用无血清培养技术从胎鼠的大脑皮层和海马通过单纯机械吹打和胰蛋白酶消化分离培养原代细胞,并加血清诱导其分化,借助免疫细胞化学技术检测培养的神经干细胞及其分化后神经元和星形胶质细胞标志蛋白的表达;并应用相差显微镜观察神经干细胞的生长特点及分化后的细胞形态学变化。结果①从胎鼠大脑皮层及海马能分离培养出具有很强增殖力的细胞,它们能稳定表达巢蛋白,经诱导分化后可表达神经元和星形胶质细胞的特异性抗原。②与用单纯机械吹打分离细胞法相比,用胰蛋白酶消化后,在神经干细胞培养基中有很少或几乎没有未分离的组织团块,原代细胞背景更清晰。结论①应用胰蛋白酶消化,能分离培养出纯度较高的神经干细胞。②从大鼠大脑皮层及海马能成功地分离、培养出神经干细胞,它是进一步研究神经干细胞的良好材料。     

无血清神经球培养下神经干细胞的生长与分化

背景：体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的神经干细胞并掌握其生物学特性是神经干细胞移植研究的前提。目的：建立大鼠神经干细胞的分离、培养、纯化方法,进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。方法：利用无血清悬浮神经球方法分离培养胚胎来源的神经干细胞,进行形态学观察,用免疫细胞化学方法检测神经干细胞及其分化细胞的标志物,流式细胞仪检测细胞标志物及其比例。结果与结论：无血清悬浮神经球培养下大鼠神经干细胞生长稳定,操作简单,可大量分离、纯化、扩增神经干细胞,所获细胞具有神经干细胞的一股生物学特性,流式细胞仪检测第3代神经干细胞巢蛋白达91．5％,并具有多向分化潜能,免疫化学染色及流式细胞仪示神经干细胞可分化形成神经元,神经胶质细胞和少突胶质细胞。     

神经球方法体外无血清含生长因子培养的神经干细胞主要向神经胶质细胞分化

背景：体外分离培养出神经干细胞并掌握其生物学特性是神经干细胞移植研究的前提。目的：采用神经球方法分离培养胎鼠皮质神经干细胞,并观察其生长和分化特性。方法：利用无血清悬浮方法分离培养胚胎来源的神经干细胞,用免疫细胞化学的方法检测神经干细胞及其分化细胞的标志物。结果与结论：体外无血清含生长因子的培养液培养胎鼠皮质神经干细胞,可得到悬浮生长的神经球,但悬浮生长的神经球可以发生融合,免疫细胞化学显示神经球呈巢蛋白表达阳性,神经干细胞可以分化为神经元,神经胶质细胞和少突胶质细胞,但主要向神经胶质细胞分化。说明在血清含有生长因子的而培养条件下,利用神经球方法可以分离培养出胎鼠皮质神经干细胞。     

大鼠胚胎神经干细胞体外分化时间的特异性

背景：目前对于神经干细胞体外培养过程中神经干细胞自身分化特性的变化研究的较少。目的：观察大鼠胚胎神经干细胞体外分化的时间特异性。方法：利用无血清悬浮培养的方法分离培养大鼠胚胎皮质神经干细胞,取不同培养时间的神经干细胞进行诱导分化,检测其分化特性的改变。结果与结论：体外培养的神经干细胞早期分化以神经元为主,随着培养时间的增加,分化成神经元的比例下降,神经胶质细胞的比例增加,而神经干细胞分化成少突胶质细胞的潜能与培养时间无明显相关。提示体外培养的神经干细胞其分化成神经元的潜能随着培养时间的增加而降低,而分化成神经胶质细胞的潜能随培养时间的增加而增加,神经干细胞分化为少突胶质细胞的潜能无时间相关性。     

脂肪基质细胞诱导分化为胆碱能神经元细胞

背景：脂肪基质细胞具有多向分化潜能,在特定条件下,可分化为中胚层起源组织的细胞及内、外胚层起源组织的细胞,在一定条件下可分化为胆碱能神经元。目的：探讨脂肪基质细胞的体外培养及其向胆碱能神经元细胞分化的能力。方法：取2-4周龄的SD大鼠腹股沟皮下脂肪垫,体外分离培养并传代,神经诱导培养基诱导培养后,免疫细胞学检测CD29、CD31和CD44的表达,进行表型鉴定。结果与结论：脂肪基质细胞在体外培养过程中贴壁生长,增殖能力强,其表面标记物CD29、CD44表达阳性,CD31表达阴性。经神经诱导培养基诱导培养后,分化的细胞大部分呈典型的神经元样细胞形态,巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、微管联合蛋白2表达阳性。诱导分化后胆碱乙酰转移酶表达阳性。说明脂肪基质细胞可分化为神经元样细胞,分化后的细胞具有合成胆碱乙酰转移酶的功能。     

低氧环境下白细胞介素1β诱导中脑源性神经干细胞的分化

背景：在体外某些外来信号的调控和诱导下,神经干细胞可定向诱导分化成与受体部位细胞类型与构成相似的细胞群体,使其更容易掺入靶组织,并可满足移植所需的细胞数量,提高移植细胞的存活率。目的：验证白细胞介素1β在低氧环境下体外诱导中脑源性神经干细胞的分化。方法：分离孕12d胎鼠中脑组织,培养神经干细胞、传代并鉴定。将鉴定后传代培养的中脑源性神经干细胞按分组接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12＋白细胞介素1β培养基;分别置于常氧（体积分数21%O2）和低氧（体积分数3%O2）环境下诱导分化,诱导分化9-11d后行小鼠抗大鼠酪氨酸羟化酶免疫细胞化学染色,检测酪氨酸羟化酶及神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率。结果与结论：与常氧组比较,低氧组尤其是低氧＋白细胞介素1β组中酪氨酸羟化酶阳性神经元的突起数目更多,且长度更为延长。孕12d胚鼠腹侧中脑组织可以在体外培养传代、并能诱导分化成多巴胺能神经元;在低氧环境或低氧＋白细胞介素1β诱导下,分化率均高于常氧组,其表型更成熟。说明在低氧或低氧和白细胞介素1β诱导下,可明显促进中脑源性干细胞分化为形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养建立大鼠胚胎神经干细胞克隆的实验

背景体外培养获得神经干细胞的有效方法是干细胞实验研究中很值得关注的问题.目的观察应用含有不同生长因子的培养基体外培养神经干细胞的有效方法.设计单一样本观察.单位四川大学生命科学院细胞生物学实验室.材料孕14 d SD大鼠10只,DMEM/F12 11,碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子;巢蛋白抗体IgG,β-微管蛋白Ⅲ抗体Ig G,胶质纤维酸性蛋白抗体Ig G,生物素标记二抗和三抗、异硫氰酸荧光素标记二抗.方法实验于1999/2001在四川大学生命科学院细胞生物学实验室完成.①从胎鼠前脑取出脑组织,采用酶消化、机械吹打、离心、培养原代神经干细胞克隆.②神经干细胞以2×108L-1密度接种培养,分4组,每组6瓶细胞,DMEM/F12组加入DMEM/F12(11)培养基含体积分数为0.1的小牛血清;碱性成纤维细胞生长因子组培养基为含20μg/L碱性成纤维细胞生长因子;表皮生长因子组培养基含30μg/L表皮生长因子;碱性成纤维细胞生长因子+表皮生长因子组先用含碱性成纤维细胞生长因子的培养基培养2 h后再换成含表皮生长因子的培养基培养.培养24 h后更换培养瓶,培养14 d后显微镜下计数原代克隆数,免疫组化法检测干细胞特殊标记蛋白巢蛋白的表达.主要观察指标①神经干细胞的原代克隆.②单细胞克隆培养结果.③诱导分化结果.结果①从胎鼠脑中分离的细胞具有连续传代形成克隆的能力,免疫荧光化学显示细胞球内细胞巢蛋白表达阳性.②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法形成神经干细胞克隆率最高(0.630%).③培养的神经干细胞克隆能诱导分化成神经元和神经胶质细胞.结论①结果证实培养分离的细胞是神经干细胞.②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法是获得神经干细胞的有效方法.     

机械吹打法大鼠海马神经元原代培养的研究

目的：探讨建立简单、稳定的大鼠海马神经元体外原代培养方法。方法：分离出生24hr大鼠海马组织,采用机械吹打法或胰蛋白酶消化法制备单细胞悬液,以含10％胎牛血清的DMEM／F12培养基接种．24hr后更换含2％B27的DMEM／F12无血清培养基饲养,每3d全量换液,观察神经元形态．培养第7d检测神经元纯度,MTF法测定神经细胞活性,比较两种操作方法的培养效果。结果：机械吹打法可缩短实验操作时间．减少培养污染率,降低了操作难度,培养出的神经元纯度高、活性好。结论：机械吹打法操作简便．结果稳定．是大鼠海马神经元体外原代培养的好方法。     

不同胎龄大鼠神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的比较

背景:胚胎来源干细胞的分化潜能不仅受到诱导条件影响,也受来源胚胎胚龄的影响.目的:实验拟观察不同胎龄大鼠中脑神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化能力.设计:随机对照观察.单位:中山大学附属第一医院神经外科.材料:实验于2007-03/2007-09在中山大学附属第一医院实验室完成.成年孕SD大鼠30只,体质量350～400 g,由中山大学动物实验中心提供.许可证号码为SCXK(粤)2007-0034.实验过程中对动物处置符合动温桌硌П曜?DMEM/F12无血清培养液、B27添加剂、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、体积分数为0.1的胎牛血清为英国Gibco公司产晶;白细胞介素1α,白细胞介素11、胶质细胞源性神经营养因子购自美国R&D公司:白血病抑制因子购自英国PEPROTECH公司:酪氨酸羟化酶抗体购自美国Santa Cruz公司;巢蛋白抗体、微管相关蛋白2抗体及胶质纤维酸性蛋白抗体为美国CHEMICON公司产品.方法:①分别于大鼠孕10,12,14,16,18天摸球法随机选取6只,麻醉后处死孕鼠,无菌条件下剖腹取胚胎,分离中脑腹侧脑组织进行神经干细胞培养.在含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中分别培养不同胎龄大鼠脑神经干细胞,经传代扩增后,在含白细胞介素1α、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中向多巴胺能神经元分化.②诱导分化6 d后观察分化细胞生长情况并进行免疫细胞化学鉴定:酪氨酸羟化酶染色标记后通过流式细胞仪检测分化的多巴胺能神经元比率.主要观察指标:①不同胎龄大鼠神经干细胞诱导分化后生长情况及免疫细胞化学鉴定结果.②神经干细胞诱导分化后酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比率.结果:①孕10,12,14,16,18 d胚胎大鼠中脑神经干细胞球在诱导分化液中贴壁生长,球内细胞从球体中央逐渐向外呈放射状生长,分化6天的细胞多数有1～2个长突起或有多个短突起.神经球经巢蛋白免疫细胞化学染色,大部分细胞胞浆染色呈阳性.②孕10,12,14,16,18 d胚胎大鼠中脑神经干细胞在诱导分化液中培养6 d后.流式细胞仪检测其诱导分化成酪氨酸羟化酶阳性细胞的比率分别为(10.3±2.5)%,(21.6±3.4)%,(16.7±2.8)%,(14.2±3.2)%,(8.9±1.8)%,各组间比较差异均有显著性意义(P<0.05),其中孕12 d大鼠中脑神经干细胞诱导分化成多巴胺能神经元比例最高.结论:不同胎龄大鼠中脑的神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的能力不同,以孕12 d诱导分化成多巴胺能神经元比例最高.