贴壁和缩短胰酶消化时间培养大鼠骨髓间充质干细胞

背景:对于骨髓间充质干细胞的分离纯化、培养扩增目前已有几种方法,各自均有不同的优劣性。目的:观察贴壁法和缩短胰酶消化时间的方法体外分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞的特点。方法:培养初期频繁换液,去除混杂细胞;传代后加入不同诱导剂定向诱导分化,使之分别向脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞方向分化。结果与结论:该分离培养方法在第3代可以得到纯化的骨髓间充质干细胞。分离培养的细胞纯度高,有良好的增殖和分化潜能。定向诱导培养的细胞能向成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞方向分化。     

全骨髓贴壁接触培养SD大鼠骨髓间充质干细胞

背景：体外分离培养出生长状态好、高纯度、增殖能力强和数量充足的大鼠骨髓间充质干细胞,是将其作为种子细胞用于组织和细胞移植的重要前提。 目的：建立简便、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养方法,并观察其生物学特性。 方法：采用全骨髓法将 SD 大鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外分离培养,贴壁接种法进行细胞纯化、传代。观察细胞生长形态及特征,绘制细胞生长曲线,检测细胞表面标记物,采用体外诱导剂诱导细胞分别向成骨、成软骨、成脂方向分化。 结果与结论：全骨髓贴壁接种法分离培养的骨髓间充质干细胞生长旺盛、纯度高,细胞生长形态呈长梭形,极性排列,细胞生长呈S形生长曲线,群体倍增时间为29 h,细胞在连续传10代后仍具有较强的增殖能力。第3代骨髓间充质干细胞的表面标记物CD44、CD29、CD90均呈阳性表达,CD45、CD34、CD11b则呈阴性表达。第3代骨髓间充质干细胞分别经成骨、成软骨、成脂诱导剂诱导后,茜素红染色、碱性磷酸酶染色、von-kossa矿化结节染色、甲苯胺蓝染色和油红O染色均呈阳性。结果验证全骨髓贴壁接种法是一种简便可靠的体外分离培养方法,能获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,经实验鉴定第3代骨髓间充质干细胞生物活性最佳,且具有多向诱导分化能力,适合作为后续实验的种子细胞。     

贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果验证

背景:骨髓中的间充质干细胞含量不高,且随着年龄增加或体质衰弱,骨髓间充质干细胞的数量会逐渐减少.目的:验证贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果.方法:大鼠麻醉后取双侧股骨和胫骨,剪去骨骺端,暴露骨髓腔,用含小牛血清的DMEM培养基冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞,反复吹打制成单细胞悬液,接种后置于37 ℃、体积分数为5%的CO_2培养箱内孵育,24 h后全量换液,以后每周全量换液1次,筛选易贴壁但贴壁不牢的细胞进行传代培养.观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪及免疫细胞化学染色鉴定骨髓间充质干细胞表面标志的表达.结果与结论:培养24 h后细胞能够贴壁生长,呈梭形或三角形;第二三天贴壁细胞迅速增殖;培养15 d左右出现致密的贴壁细胞层,呈漩涡状生长或成簇生长.细胞在接种后2 d进入对数生长期,12 d左右进入平台期,约15 d细胞可铺满瓶底.分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞CD90和CD54均呈阳性表达.结果验证了采用贴壁法可在体外成功分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,操作简单,造成污染的环节和机会较少,不需离心,可以更好的保持细胞活性.     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

背景:培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提.目的:寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性.方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记.结果与结论:分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统.第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性.提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性最佳,可用于后续实验.     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

背景：培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提。目的：寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性。方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记。结果与结论：分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统。第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性。提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性最佳,可用于后续实验。     

建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定

背景:骨髓间充质干细胞作为种子细胞存组织工程等领域应用广泛,建立稳定的分离培养体系和统一鉴定标准尤为重要.目的:以不同方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测.设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2005-08/12在暨南大学完成.材料:SPF级3月龄SD雌性大鼠5只,由中山大学实验动物中心提供.方法:无菌条件下分离大鼠双下肢,低糖DMEM培养液冲出骨髓,分别运用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞.利用差速贴肇原理对细胞进行纯化扩增.取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分别加入成骨、成脂、成软骨诱导培养基,培养14d.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞的生长状态,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,采用碱性磷酸酶染色鉴定成骨能力,以油红○染色鉴定成脂能力,以甲苯胺蓝染色鉴定成软骨能力.结果:与密度梯度离心法相比,全骨髓贴肇法分离获得的骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经传代后能够纯化.第3代骨髓间充质干细胞形态单一均匀,呈典型的极性漩涡状生长,不表达造血前体细胞标志抗原CD34和白细胞标志抗原CD45,表达整合索家族成员CD29和黏附分子CD44,经诱导后碱性磷酸酶染色、油红○染色和甲苯胺蓝染色均呈阳性.结论:采用全骨髓贴壁法可稳定获得均质性良好的大鼠骨髓间充质干细胞,效果优于密度梯度离心法.经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为大鼠骨髓间充质干细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养表型鉴定与标记

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外分离培养、表型鉴定和标记的方法，为临床进行细胞移植治疗心、肝、脑等器官急性衰竭提供种子细胞。方法 无菌条件下取大鼠股骨、胫骨和腓骨，用冲洗法冲出骨髓，用直接贴壁法分离纯化MSCs，体外扩增，用免疫细胞化学法及流式细胞仪分别对培养的MSCs进行鉴定，并检测第3代MSCs的细胞周期。结果体外培养的原代MSCs 72h内可见有少量贴壁细胞，7d左右达到汇合。免疫细胞化学示，MSCs CD29、CD44、CD73、CD105、CD166表达阳性，而CD14、CD34、CD45表达阴性。流式细胞仪示，CD14阳性率为0．19％、CD29为64．36％、CD34为0．17％、CT44为86．73％、CD45为0．18％、CD73为90、21％、CD105为74．25％、CD166为54．60％。细胞周期显示，第3代MSCs约有90％的细胞处于G0／G1期。结论 MSCs在体外很容易分离培养和扩增，DAPI标记MSCs敏感性好，标记效率高，可作为标记细胞的一种有效手段，MSCs体外培养成功为细胞移植治疗急危重症器官衰竭提供新的治疗途径。     

人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养

目的:验证贴壁方式分离人骨髓间充质干细胞,并进行体外扩增培养的可行性。方法:实验于2006-02/12在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。①实验材料:骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者,对本实验知情同意。基础培养液由含体积分数为0.15胎牛血清和低糖α-MEM配置。②实验方法:无菌条件下髂后上棘穿刺抽取骨髓组织6mL,进行细胞培养,观察细胞生长情况,待细胞融合成片、长满培养瓶底部后,用质量浓度为2.5g/L的胰蛋白酶流过所有细胞表面。倒置显微镜下观察细胞变圆、部分脱壁后,立即加入有血清培养液终止消化。③实验评估:取第3代生长状态良好的细胞,胰蛋白酶消化制成细胞悬液,接种,以细胞数为纵坐标,时间为横坐标,绘制细胞生长曲线。同时每隔2h进行细胞贴壁率检测。结果:①骨髓间充质干细胞的形态学观察:倒置显微镜下,骨髓间充质干细胞接种1d即贴壁,去除悬浮细胞后继续培养3d贴壁细胞开始增殖,伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等。至14d细胞密集在集落中心,基本铺满瓶底,第3～5代细胞呈均匀一致的长梭型,排列成旋涡状或放射状。②骨髓间充质干细胞的生长曲线:细胞传代后3d内处于潜伏期,3d后进入生长期,7d后进入平台期。③骨髓间充质干细胞的贴壁率:随着培养时间的延长,骨髓间充质干细胞贴壁率逐渐升高。传代后2,4,6,8,10,12,14,16,18,20h细胞贴壁率分别为(20.20±0.25)%,(33.00±0.29)%,(46.50±0.32)%,(69.20±0.30)%,(76.60±0.34)%,(86.50±0.27)%,(90.30±0.20)%,(96.10±0.28)%,(98.50±0.12)%,(99.00±0.07)%。结论:贴壁法分离骨髓间充质干细胞操作简便,经体外扩增培养后细胞增殖活性强,传代周期为7d,是比较理想的骨髓间充质干细胞培养方法。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞分离提纯及鉴定

目的探讨SD大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离、传代培养方法,并对培养细胞进行鉴定。方法贴壁培养法分离SD大鼠骨髓细胞,传代扩增,倒置相差显微镜进行形态学观察,流式细胞术鉴定细胞。结果原代细胞较多细胞集落,细胞规则,呈梭形、椭圆形,传代细胞多成纤维形状,第3代培养细胞表面分子CD44,CD90,CD105呈阳性表达,但不表达CD34。结论贴壁培养法培养的大鼠骨髓原代细胞可稳定表达干细胞表面的标记分子。     

优化骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的:探讨全骨髓贴壁培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的优化方法.方法:全骨髓贴壁法分离、体外培养原代大鼠骨髓MSC,种植后3h首次换液,培养前72 h内频繁换液;通过流式细胞学方法检测原代培养细胞的MSC特征性表面标记的表达及比例;通过体外培养诱导成脂、成骨、成软骨分化,确立原代培养骨髓MSC的多向分化潜能.结果:早期、频繁换液的方法分离培养大鼠骨髓MSC,P0 MSC以单克隆生长,呈典型漩涡状排列,细胞形态均一;P1细胞均一表达CD29、CD44,不表达CD34、CD45;原代培养骨髓MSC具有成脂、成骨、成软骨分化潜能.结论:全骨髓贴壁法分离培养大鼠原代骨髓MSC,早期、频繁换液有助于在早期获得高纯度细胞,原代细胞具有多向分化潜能.早期、频繁换液的全骨髓贴壁法是体外分离培养骨髓MSC的优化方法.     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景:骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大.体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要.目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测.方法:通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化.结果与结论:大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上.生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃.第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达.成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性.全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能.实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义.     

全骨髓贴壁培养大鼠骨髓间充质干细胞体外成骨的定向诱导及鉴定

背景:许多分离纯化骨髓间充质干细胞操作繁琐、费用昂贵,且对细胞的活性影响较大,许多研究都致力于寻找有效且价格低廉的培养鉴定方法。目的:采用全骨髓贴壁培养法对大鼠骨髓间充质干细胞经体外进行成骨诱导和分化,并进行细胞鉴定。设计:观察对比实验。单位:青岛大学医学院。材料:实验于2005-11/2007-03在青岛大学医学院口腔研究室及分子生物学实验室完成,选用20只生后三四周Wistar大鼠,SPF级,雌雄不拘,体质量120～150g,由青岛市实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。胎牛血清购自杭州四季清生物技术有限公司,碱性磷酸酶检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供,逆转录试剂盒为PROMEGA产品,引物由上海生工公司合成。方法:采用全骨髓培养法分离培养成年大鼠骨髓间充质干细胞,用2.5 g/L的胰蛋白酶消化后分瓶,以5×10~7L~(-1)的密度接种于6孔培养板,诱导分化组加入诱导分化培养液,对照组加入等量基础培养液培养。①倒置相差显微镜观察细胞诱导分化结果及钙结节形成情况。②采用钙结节Von Kossa染色、钙结节茜素红染色进行诱导后细胞的生物学特性检测。③采用重氮盐法染色观察碱性磷酸酶活性。④RT-PCR检测细胞内成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达。主要观察指标:①细胞诱导分化结果。②大鼠骨髓间充质干细胞诱导后细胞的生物学特性。③碱性磷酸酶活性。④成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达。结果:①诱导分化组加入诱导分化培养液后,9d后开始密集重叠生长,21～28d出现较多散在的致密圆形矿化结节。对照组细胞虽密集重叠生长,但不形成矿化结节。②诱导分化组成骨诱导21～28d形成明显的圆形或卵圆形肉眼可见的钙化结节。Von Kossa染色为黑色沉淀,茜素红染色为橙红色结节状,对照组未见钙结节形成。③诱导分化组诱导2周细胞碱性磷酸酶活性明显增高,对照组活性较弱。④诱导分化组经诱导后成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达均较强。结论:大鼠的骨髓间充质干细胞经全骨髓培养法体外诱导和分化,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性。     

全骨髓直接贴壁分离人骨髓间充质干细胞的生物学特性

背景:体外分离培养骨髓间充质干细胞成为实验研究和临床应用的关键环节。目的:采用全骨髓培养法分离人骨髓间充质干细胞,建立一种简单、有效的分离培养骨髓间充质干细胞的方法。方法:通过全骨髓培养法分离培养人骨髓间充质干细胞,并通过传代进行纯化和扩增培养。分别在特定诱导体系中诱导人骨髓间充质干细胞向脂肪、成骨及软骨细胞分化。结果与结论:采用全骨髓培养分离法能获得90%以上纯度的骨髓间充质干细胞;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD73、CD90、CD105,不表达造血细胞表型CD34、CD45和HLA-DR;细胞倍增时间为(24.04±0.49)h;细胞周期分析表明:G0~G1期和S+G2+M期所占比例分别为71.63%和28.37%;诱导分化结果显示,人骨髓间充质干细胞能够向脂肪、骨和软骨细胞分化。说明全骨髓分离培养法是一种较好的分离人骨髓间充质干细胞的方法。     

全骨髓直接贴壁分离人骨髓间充质干细胞的生物学特性

背景：体外分离培养骨髓间充质干细胞成为实验研究和临床应用的关键环节。目的：采用全骨髓培养法分离人骨髓间充质干细胞,建立一种简单、有效的分离培养骨髓间充质干细胞的方法。方法：通过全骨髓培养法分离培养人骨髓间充质干细胞,并通过传代进行纯化和扩增培养。分别在特定诱导体系中诱导人骨髓间充质干细胞向脂肪、成骨及软骨细胞分化。结果与结论：采用全骨髓培养分离法能获得90%以上纯度的骨髓间充质干细胞;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD73、CD90、CD105,不表达造血细胞表型CD34、CD45和HLA-DR;细胞倍增时间为（24.04±0.49）h;细胞周期分析表明：G0~G1期和S＋G2＋M期所占比例分别为71.63%和28.37%;诱导分化结果显示,人骨髓间充质干细胞能够向脂肪、骨和软骨细胞分化。说明全骨髓分离培养法是一种较好的分离人骨髓间充质干细胞的方法。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化

背景:骨髓中的间充质干细胞含量极少,每1×104～1×105个单核细胞中约有1个骨髓间充质干细胞,需要在体外分离、纯化、扩增后才能满足体内移植要求.目的:观察体外分离培养的骨髓间充质干细胞生物学特性及多向分化潜能.设计、时间及地点;细胞学体外观察,于2007-10/2008-12在福建医科大学附属协和医院泌尿外科研究室完成.材料:清洁级雄性近交系SD大鼠30只,由上海斯莱克实验动物有限公司提供.方法:通过全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,待细胞融合至80%～90%胰蛋白酶消化传代.取传至第3代细胞,分别向成骨、成脂方向诱导分化.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测其表面标记,茜素红染色检测其成骨能力,油红O染色检测其成脂能力.结果:原代及传代的骨髓间充质干细胞均呈长梭形成纤维细胞样,连续传代10代以上,细胞始终保持旺盛的生长及扩增能力.第3代骨髓间充质干细胞CD90,CD44,CDl06均呈阳性表达,而CD34,CD45,CD11b呈阴性.成骨诱导21 d后,可见大量橘红色矿化结节形成.成脂诱导2周后,可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴. 结论:全骨髓贴壁培养法可大量分离纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能.     

全骨髓法培养C57小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

背景：饲养层细胞多数利用丝裂霉素C来处理,虽丝裂霉素C抑制了细胞增殖,但是细胞仍处于有分泌功能的活性状态,能够分泌不同的细胞因子。而骨髓中的非间充质骨髓细胞和血浆中的各种分泌因子,保持间充质细胞生长的微环境,提高间充质干细胞的产量。 目的：探究全骨髓培养法分离培养的小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。 方法：采用全骨髓贴壁法纯化扩增C57小鼠的骨髓间充质干细胞,检测细胞增殖的动力学变化、细胞表面的免疫标志物、多向分化的潜能及细胞周期的变化。 结果与结论：全骨髓培养法获得的小鼠骨髓间充质干细胞具有黏附于塑料培养器皿的能力,流式细胞仪检测表达CD45,CD105和Sca-1,不表达CD34,CD133和C-kit等间充质干细胞的表面标记特征;细胞倍增时间（57.11＆#177;1.5） h;诱导后具有向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的能力;细胞周期分析表明64%的细胞处于G 0-G 1期。提示全骨髓培养法获取的C57小鼠骨髓间充质细胞具有间充质干细胞的生物学特征。