大鼠delta阿片受体短发卡RNA干扰真核表达载体的构建和鉴定

背景:长期应用阿片受体治疗疼痛会导致药物耐受或成瘾,可能与delta 阿片受体密度上调有关.目的:设计及构建大鼠delta 阿片受体短发卡RNA 真核表达载体并鉴定.方法:根据大鼠delta 阿片受体mRNA 序列设计并体外合成短发卡RNA 寡核苷酸片段,退火形成双链,克隆到线性化质粒pGenesil-1,然后进行酶切和测序鉴定.结果与结论:酶切证明delta 阿片受体-短发卡RNA 已经插入到质粒载体pGenesil-1 里,测序结果证明均为插入正确的克隆质粒,而且质量均符合设计标准,证实靶向大鼠delta 阿片受体基因的短发卡RNA 真核表达载体构建成功.     

靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体质粒,为利用RNA干扰技术探索EZH2基因的作用的研究做准备。方法根据EZH2 mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入pGenesil-2载体,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中,经测序证明与设计相同。结论成功构建靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体,为进一步研究EZH2基因在肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。     

靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体质粒，为利用RNA干扰技术探索HIWI基因的作用的研究做准备。方法根据HIWI mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并连接入pGenesil-2载体，并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中，经测序证明与设计相同。结论成功构靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体，为进一步研究HIWI基因在干细胞和肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。     

靶向survivin基因的shRNA质粒表达载体的构建

目的:利用pGenesil-1质粒构建靶向survivin基因的2个短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体。方法:设计2对shRNA,GC比在40%～55%之间,进而应用BLAST软件进行同源性剔除,保证所得shRNA序列靶向survivin基因,分别克隆至带有U6启动子的质粒pGenesil-1中,构建质粒表达载体,转化大肠杆菌DH5α菌株扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析。双酶切重组质粒进行酶切鉴定。结果:成功构建靶向survivin基因的2个shRNA质粒表达载体,经双酶切鉴定及质粒测序结果完全符合设计要求。结论:经鉴定设计的2条shRNA已成功连接于质粒上,可以应用于进一步RNA干扰试验。     

Cdc42-shRNA表达载体的构建及在肝癌细胞株的沉默效果

目的构建Cdc42-shRNA真核表达载体。方法合成Cdc42的基因干扰序列并定向插入到RNA干扰(RNAi)真核表达载体pGenesil-1质粒,通过测序进行鉴定。干扰质粒经脂质体Lipofectamine2000介导转染肝癌细胞,Westernblot方法检测沉默效率。结果测序证明干扰序列完全正确,Westernblot结果显示Cdc42-shRNA对肝癌细胞株内源性Cdc42有较好的沉默效果。结论成功构建了Cdc42-shRNA真核表达载体,为进一步研究Cdc42在基因治疗中的作用奠定基础。     

大鼠SLPI基因真核表达载体的构建及其在真皮多能干细胞中的表达

目的 克隆大鼠白细胞蛋白酶抑制因子(SLPI)基因,构建其真核表达载体,并转染大鼠真皮多能干细胞,以探讨SLPI在创伤及炎症性疾病中的意义.方法 PCR扩增大鼠皮肤SLPI基因 cDNA,酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N2重组,将SLPI基因 cDNA片段连接到pEGFP-N2载体的多克隆位点,形成重组载体pEGFP/SLPI,转化大肠杆菌DH5α菌株,构建成SLPI基因真核表达载体质粒.扩增DH5α后抽提质粒DNA,Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切,电泳,DNA测序鉴定.鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染大鼠真皮多能干细胞,通过荧光显微镜和RT-PCR方法 来检测基因转染及表达.结果从大鼠皮肤cDNA扩增出392 bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N2载体中.经酶切和DNA测序验证,插入载体的DNA片段为SLPI基因,插入方向正确.重组质粒经脂质体转染真皮多能干细胞,24 h后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的 基因SLPI表达.结论 大鼠SLPI基因的克隆和真核表达载体构建获得成功,为进一步研究其功能奠定了基础.     

Survivin反义RNA/HSP70双基因表达载体的构建及鉴定

目的：构建Survivin反义RNA/HSP70双基因表达载体,为后期转染肿瘤细胞,抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡以及激发机体有效的特异性抗肿瘤免疫应答提供重要的实验材料。方法：应用RT-PCR从Jurkat细胞中获得Survivin cDNA片段,反向插入pIRES2-DsRed2质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的Survivin反义RNA表达载体是否成功;应用RT-PCR从HepG2细胞中获得的HSP70 cDNA片段,定向插入到pIRES2-DsRed2质粒载体中;经菌落PCR、酶切和测序鉴定所构建的HSP70表达载体是否正确。结果：经酶切和测序鉴定证明Survivin反义RNA表达载体已成功构建;经菌落PCR、限制性酶切和测序鉴定证明HSP70表达载体已成功构建。结论：本实验已成功构建了Survivin反义RNA/HSP70双基因表达载体,为进一步研究提供了实验基础。     

脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

背景：慢病毒载体可稳定介导基因沉默且具有较高的转染效率。目的：构建并鉴定脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体。方法：针对脯氨酰羟化酶2基因序列设计RNA干扰靶序列,合成靶序列的寡聚DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切的pGCSIL-GFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,产生重组RNA干扰慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果与结论：PCR和DNA测序证实合成的含脯氨酰羟化酶短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pGCSIL-GFP载体。说明实验成功构建脯氨酰羟化酶基因RNA干扰慢病毒载体。     

凋亡抑制基因Survivin siRNA真核表达载体的构建

目的构建靶向survivin siRNA真核表达载体,通过RNA干扰技术阻断survivin基因表达。方法针对目的基因survivin序列设计双链DNA(dsDNA),采用DNA重组技术与载体连接,转化感受态细胞经诱导表达筛选阳性克隆子。结果重组质粒经酶切、测序鉴定,证实插入载体目的基因片段大小与插入方向正确,符合其物理图谱。结论靶向survivin siRNA真核表达载体可用于转染肿瘤细胞,阻断survivin基因表达并诱导细胞凋亡的RNAi实验研究,为肿瘤的基因治疗提供一种新的方法。     

Stathmin特异性siRNA表达质粒抑制stathmin的表达

目的:构建微管解聚蛋白stathmin基因的特异性siRNA质粒表达载体,以便研究stathmin在鼻咽癌中的生物学作用。方法:合成stathmin特异性DNA片段,退火形成的双链DNA片段克隆于质粒表达载体pGenesil-1.3;载体经扩增后,进行酶切和测序鉴定;采用QIAGEN公司脂质体(effectenetransfectionreagent)将鉴定后的重组质粒转入鼻咽癌CNE2细胞;RT-PCR与Westernblot检测stathmin基因表达。结果:酶切和测序分析表明,插入siRNA质粒表达载体中的DNA片段,其碱基序列和插入方向正确。表达分析证实特异性siRNA质粒表达载体能有效抑制鼻咽癌CNE2细胞中stathmin的表达。结论:构建的siRNA质粒表达载体对stathmin的表达有很好的抑制作用。     

p21基因的saRNA表达质粒的构建及功能研究

目的构建可表达具有RNA激活功能的小激活RNA（saRNA）质粒表达载体,并对其激活前列腺癌细胞PC-3中p21WAF1/CIP1（p21）基因表达的功能进行相关研究。方法人工合成与p21基因启动子特定序列相应的DNA片段及同样长度的随机DNA序列,利用DNA重组技术将这些片段构建到真核小分子双链RNA（dsRNA）表达质粒pGenesil-1中,构建成能表达dsRNA片段的表达质粒载体（dsRNAp21-pGenesil-1）和随机对照dsRNA片段的表达质粒载体（dsRNACon-pGenesil-1）。采用脂质体介导方法,分别将dsRNAp21-pGenesil-1（实验组）、dsRNACon-pGenesil-1（随机对照组）及空白质粒pGenesil-1（空白对照组）转染到体外培养的PC-3细胞,通过荧光染色检测转染效率,采用RT-PCR和免疫组化技术检测各组细胞p21蛋白表达的差异。结果成功构建目的表达载体dsRNAp21-pGenesil-1及随机对照载体dsRNACon-pGenesil-1,将各组质粒转染到PC-3细胞后,实验组p21基因表达明显增强,而随机对照组和空白对照组无明显变化。结论本研究构建的dsRNA表达质粒载体能成功表达saRNA分子,并激活p21基因及蛋白的表达,为研究的激活效应提供有效工具。     

靶向特定细胞PI3K基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建靶向血管平滑肌细胞和内皮细胞磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）基因的短发卡干扰RNA（short hair-pin RNA,shRNA）表达载体,研究其对上述细胞PI3K基因的靶向沉默作用,探索抑制移植血管狭窄的基因防治手段.方法 根据Genbank中大鼠PI3K p110β亚单位编码基因Pik3cb序列设计并合成两条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-10,经荧光定量PCR方法筛选一条较合适的shRNA转录模板;合成血管平滑肌细胞特异性SMHC增强子/SM22α启动子序列和血管内皮细胞特异性KDR增强子/启动子序列,将该增强子/启动子片段亚克隆至pGenesil-10-Pik3cbshRNA上,构建并鉴定重组质粒载体SMHCe/SM22α p-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA（简称SM22α e/p shRNA）和KDRe/p-pGenesil-10-Pik3 cb-shRNA（简称KDR e/p shRNA）;将重组质粒载体转染血管平滑肌细胞,分别于转染24h、48h、72 h后,采用实时荧光定量PCR检测Pik3cb基因mRNA的相对表达量.结果 荧光定量PCR检测转染Pik3cb-shRNA-1组与转染Pik3cb-shRNA-2组比较,前者细胞Pik3cb mRNA相对表达量降低更为明显,且两组均较对照组mRNA表达明显减少（P＜0.05）;酶切鉴定重组质粒载体SM22α e/p shRNA和KDR e/p shRNA构建成功;质粒转染细胞后,Pik3cb基因mRNA相对表达量SM22α e/p质粒组较阴性对照组均有所降低,且转染24h后,SM22α e/p质粒组与空白对照、CMV质粒组比较Pik3cb基因mRNA相对表达量明显降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 选择Pik3cb-shRNA-1作为转录模板,能够成功构建SM22α e/p shRNA和KDR e/p shRNA质粒载体,且特异性启动子SM22α介导的靶向大鼠Pik3cb基因的shRNA质粒载体可有效沉默靶基因在血管平滑肌细胞中的表达.     

人ski基因真核表达载体的构建及促细胞增殖作用

背景：c-Ski既可促进组织修复,又能降低瘢痕形成,有望成为一个全新的基因治疗药物。目的：构建人ski基因的真核表达载体,并对其促成纤维细胞增殖效果进行验证。方法：RT-PCR法从人包皮培养原代成纤维细胞总RNA中扩增出人ski基因,连同真核表达启动子CMV克隆到pUC118载体上,酶切和测序验证后,应用脂质体将其转染到培养的大鼠皮肤成纤维细胞中。结果与结论：酶切和测序结果证实表达质粒构建成功,Westernblot显示Ski蛋白在转染细胞中成功表达,且可显著提高转染细胞的增殖效应,说明以pUC118为骨架的重组ski表达质粒具有促进大鼠皮肤成纤维细胞增殖的作用。     

靶向转化生长因子β1的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

[目的]构建靶向转化生长因子β1（TGFβ1）小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体.[方法]设计二个siRNA作用靶点,体外合成的相应双链DNA被插入pSilencer-2.1质粒中,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序.采用脂质体转入HSC-T6细胞中,利用RT-PCR法和western-blot分别检测TGFβ1 mRNA和蛋白的表达.[结果]靶向TGFβ1 的siRNA-a和siRNA-b二个表达质粒是成功构建; 与无关对照组相比,siRNA-b组对TGFβ1mRNA和蛋白表达均明显下调（ P 〈0.01）,siRNA-a组无明显下调（ P 〉0.05）.[结论]成功构建了靶向TGFβ1 基因的siRNA表达质粒,为进一步研究其阻断肝纤维化打下基础.     

靶向转酮醇酶样基因1 siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建针对转酮醇酶样基因1(TKTL1)特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体并检测其沉默效应。方法采用人U6 SnRNA启动子,分别把被9 bp序列间隔的19 bp长短的TKTL1靶序列的反向重复序列,置于pEGFP-C1-U6质粒载体中,构建成TKTL1短发夹环RNA,产生重组质粒pEGFP-C1-U6/TKTL1,分别用PstⅠ和SalⅠ酶切鉴定及测序分析,并将重组质粒转染人结肠癌细胞株LoVo,通过RT-PCR检测TKTL1基因表达水平的变化。结果酶切鉴定与DNA测序分析证明,TKTL1基因的siRNA表达载体构建正确,RT-PCR结果表明转染重组质粒的LoVo细胞TKTL1基因的表达水平明显降低。结论成功构建了针对TKTL1基因的siRNA表达载体,转染LoVo细胞后可显著抑制TKTL1基因表达。     

人端粒酶反转录酶小发夹RNA质粒表达载体的构建及鉴定

背景:端粒酶反转录酶是端粒酶的活性亚基,已成为肿瘤研究的热点。RNA干扰技术作为一种基因沉默方法,具有高效、特异等优点,现已广泛应用于肿瘤、病毒等研究领域。目的:构建针对人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,并观察其对乳腺癌T47D细胞人端粒酶反转录酶基因的表达和端粒酶活性的影响。方法:以Genbank中人端粒酶反转录酶基因的mRNA序列为基础,设计人端粒酶反转录酶基因的小干扰RNA序列,将其连接到具有G418抗性的质粒pBAsi-hU6-Neo(BamHⅠ/HindⅢ)中,应用基因测序加以验证,扩增提取质粒,以脂质体转染表达小发夹RNA的质粒到乳腺癌T47D细胞,抗生素G418筛选出转染成功的各组细胞。结果与结论:实验所构建的人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,经测序验证无误。将pBAsi-hU6-Neo重组质粒转染入T47D细胞,经G418筛选获得了转染成功的细胞。经RT-PCR和Western blot检测,转染后的人端粒酶反转录酶基因在mRNA和蛋白水平的表达均明显降低(P<0.01),经TRAP-ELISA法检测实验组细胞端粒酶活性出现显著下降(P<0.01)。结果证实,实验成功构建人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,实验所设计的小干扰RNA能有效抑制肿瘤细胞人端粒酶反转录酶基因的表达,进而降低细胞的端粒酶活性。     

抑制骨髓基质干细胞雌激素受体β基因表达的有效序列

背景：雌激素受体β是否参与介导骨髓间充质干细胞的增殖与分化需进一步实验论证。目的：以RNAi技术寻找和验证对大鼠骨髓基质干细胞雌激素受体β基因表达抑制的有效序列。方法：根据GeneBank数据库提供的SD大鼠雌激素受体β基因核苷酸序列,选择设计能转录小发卡结构RNA（Small hairpin RNAs,shRNA）的DNA序列。再在两条互补碱基序列的5＇端分别加上BamHⅠ（GATCC）和HindⅢ（AGCTT）酶的酶切位点,最后形成两条互补的克隆入pSilencer3.1-H1载体的发夹状siRNA模板序列,进行重组载体的碱基序列测定。结果与结论：重组质粒碱基序列鉴定后,证实真核表达载构建正确。雌激素受体β特异性siRNA真核表达载体构建成功。