心肌营养素1对谷氨酸诱导神经干细胞凋亡的作用

背景:心肌营养素1属于白细胞介素6细胞因子家族,近年发现其可能对中枢神经系统有重要保护作用。目的:探索重组腺病毒心肌营养素1对谷氨酸诱导神经干细胞凋亡的保护作用,为脑损伤提供新的治疗措施。方法:取新生Wistar大鼠海马神经干细胞,第2代培养第5天用于实验,神经干细胞分为3组:谷氨酸组、重组腺病毒心肌营养素1组及对照组,利用四唑蓝比色了解细胞存活情况及原位缺口末端标记技术检测细胞凋亡。结果与结论:谷氨酸组神经干细胞呈现明显形态改变,重组腺病毒心肌营养素1组未见类似改变,在谷氨酸暴露后12,24,48及72hMTT吸光度值均低于心肌营养素1组,而细胞凋亡率均高于心肌营养素1组。与其他两组比较,对照组相同时间点A值增高,细胞凋亡率降低。提示,心肌营养素1对谷氨酸损伤的神经干细胞具有保护作用,可以抑制神经干细胞凋亡,促进其存活和增殖。     

Persephin基因转染对缺氧诱导神经干细胞凋亡的影响

背景:如何抑制或减少神经干细胞凋亡的发生,促进缺氧后神经干细胞的存活,成为脑梗死神经干细胞移植治疗的研究热点。目地:观察在缺氧状态下转染人类persephin基因对神经干细胞凋亡的作用。设计:完全随机分组,对照实验。单位:中山大学附属第二医院神经内科。材料:实验于2006-07/2006-12在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成,重组腺病毒pAd persephin由本实验室构建保存,C17.2神经干细胞由美国哈佛大学医学院Snyder教授惠赠。胰蛋白酶、DMEM/F12购自Gibco公司;胎牛血清来自杭州四季青生物工程公司;多聚赖氨酸购自美国Sigma公司;TUNEL检测试剂盒,阳离子脂质体FuGENE购自瑞士Roche公司;S-P免疫组化试剂盒及DAB显色剂购自福建迈新生物工程公司;鼠抗人Nestin单抗,Persephin兔抗人多抗购自美国Santa Crus公司,persephin反义寡核脱氧苷酸由上海生工合成。方法:①实验干预:将携带人类Persephin基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞,分为4组,A组:正常对照组,C17.2神经干细胞不作缺氧处理。B组:缺氧处理组,即置于37℃、体积分数0.95N2,体积分数0.05CO2厌氧培养箱培养。C组:缺氧 pAdpersiphin转染组,即:将携带人类Persephin基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞,pAdpersiphin转染48h后的细胞置同B组条件的厌氧培养箱培养。D组:缺氧 pAdpersiphin转染组 persiphin反义寡核脱氧苷酸,即pAdpersiphin persiphin反义寡核脱氧苷酸转染。②实验评估:Western-blotting法分析Persephin蛋白的表达;TUNEL法检测凋亡指数;流式细胞术测定细胞凋亡率的变化。主要观察指标:Persephin蛋白的表达、细胞凋亡指数和凋亡率。结果:①Persephin蛋白表达:C组细胞经Western blot检测可见一特异性蛋白条带存在,Mr约为24000,符合预期结果,说明persiphin成功表达,D组亦可见一Mr 24000的条带,但条带较单纯pAdpersiphin感染组明显为淡,说明反义persiphin反义寡核脱氧苷酸可成功抑制pAdCMVpersiphin的表达。②细胞凋亡指数:C组凋亡细胞明显减少,凋亡指数低于B、D组(P<0.01),但高于A组(P<0.01),表明细胞凋亡未完全避免。③细胞凋亡率:B、D组凋亡率明显高于A组(P<0.01),C组明显较B组、D组低(P<0.01)。结论:腺病毒介导的Persephin基因能高效表达Persephin;外源性Persephin对C17.2神经干细胞具有抗凋亡作用,能够提高C17.2神经干细胞对缺氧的耐受性。     

心肌营养素-1在心肌梗死中的作用

心肌营养素-1(cardiotrophin-1,CT-1)是新发现的为白介素-6家族中的1种细胞因子,有促心肌细胞肥大作用,抑制心肌细胞的凋亡,影响心肌梗死后心室重构的进程,在心肌梗死的病理生理过程中发挥重要的作用.     

心肌营养素-1在心肌细胞中的作用及其信号转导通路

心肌营养素 1作为IL 6细胞因子家族的一员 ,能维持心肌细胞的存活、保护心肌细胞 ,同时有促进心肌细胞肥大的作用。心肌营养素 1通过gp13 0激活MAPK、JAK/STAS3、PI 3K等信号通路产生上述作用。本文就此作一综述     

心肌营养素-1的生物多效性

心肌营养素-1(cardiotrophin-1，CT-1)最初是从小鼠胚胎干细胞的胚状体培养液中分离出来的一种新型细胞因子，其分子结构与细胞因子白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)家族成员具有高度同源性。是IL-6家族成员之一。最初发现能够在体内、体外均能诱导心肌细胞肥大的因子，后来研究发现CT-1除了能够在心脏组织中表达外，在其他多种器官和组织中如骨骼、肝脏和脊髓等同样存在，CT-1不仅能诱导心肌细胞的肥大，还能刺激心脏和神经细胞的存活，并可作为一种抗炎细胞因子参与机体炎症反应，具有广泛的生物学作用。     

牡蛎提取物在高温诱导皮质神经干细胞凋亡中的保护作用

背景:课题组前期研究表明,牡蛎提取物对高温所致神经管畸形中的凋亡细胞有一定的保护用用,该提取物对体外培养的神经干细胞的凋亡是否也有保护作用,尚未见报道目的:观察牡蛎提取液在高温所致神经干细胞凋亡中的保护作用.方法:取孕13 d小鼠胚胎大脑皮质细胞培养,采用免疫荧光法检测巢蛋白的表达以鉴定神经干细胞,将培养3代的神经干细胞随机分为4组:高温对照组和牡蛎保护Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组(分别加入质量浓度2.5,5,10 g/L的牡蛎提取液),同时设立培养液对照组(其中无细胞)、培养液+牡蛎提取液对照组(其中无细胞),各牡蛎保护组及对照组均经过39℃高温处理.锥虫蓝染色法检测神经干细胞存活率;MTT法检测神经干细胞的增殖活性;蛋白质印迹方法检测神经干细胞凋亡相关蛋门p53的表达.结果与结论:牡蛎保护Ⅱ、Ⅲ组中细胞的存活率及MTT值明显高于高温对照组(P<0 05);而p53的表达则明显低于高温对照组.提示牡蛎提取液对高温所致神经干细胞的凋亡具有一定的保护作用,这种作用有浓度依赖性.     

甲泼尼龙抑制神经干细胞并诱导其凋亡的研究

目的：研究甲泼尼龙对体外培养的神经干细胞的直接作用，为有效的结合这两种治疗方法提供依据和指导。方法：体外培养神经干细胞，加入MP培养12h、24h和48h后，用细胞活性检测试剂CCK-8，检测其对神经干细胞活性的影响，用Hoeehst 33258染色观察细胞凋亡，用Annexin V／PI双染色法检测神经干细胞凋亡比率。结果：甲泼尼龙对体外培养的活性有抑制作用，而且可以诱导体外培养的神经干细胞的发生凋亡。结论：甲泼尼龙不利于神经干细胞的生长，不宜在进行甲泼尼龙冲击疗法的同时进行神经干细胞移植。     

外源性碱性成纤维细胞生长因子对放射诱导神经干细胞凋亡的抑制效应

背景:已证实放射性神经干细胞损伤是放射性脑损伤的可能途径之一,而碱性成纤维细胞生长因子对放射性损伤具有保护作用,但其机制尚不清楚.目的:观察外源性碱性成纤维细胞生长因子对放射诱导C17.2神经干细胞凋亡的抑制作用.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2006-11/2008-06在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.材料:C17.2神经干细胞系为小鼠小脑祖细胞永生化后构建的神经干细胞系.方法:以直线加速器进行总量为8 Gy外照射C17.2神经干细胞建立离体放射性损伤模型,以1×107L-1的细胞浓度接种C17.2神经干细胞悬液至96孔板,每孔加细胞悬液200 μL,按0,25,50,100 μg/L(0 μg/L作对照)分别加入碱性成纤维细胞生长因子干预.主要观察指标:四甲基偶氮唑盐法检测细胞活性并拟合生存曲线,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:随碱性成纤维细胞生长因子浓度升高,C17.2神经干细胞增殖比明显增加(P＜0.01),呈现明显剂量-效应关系.碱性成纤维细胞生长因子浓度为100 μg/L时活性最强,未显示细胞毒性.流式细胞仪检测结果显示:对照组细胞凋亡率高于25,50 μg/L碱性成纤维细胞生长因子组(P<0.01),25,50,100μg/L碱性成纤维细胞生长因子组组间相比,差异具有显著性意义(P<0.05～0.01).结论:外源性碱性成纤维细胞生长因子对放射诱导的C17.2神经干细胞凋亡具有明显抑制作用.     

牛磺酸对谷氨酸诱导大鼠视网膜神经节细胞凋亡的抑制

目的:视网膜谷氨酸兴奋毒性可引起视网膜内层神经元尤其是视网膜神经节细胞的凋亡,牛磺酸作为神经保护剂,本研究观察其是否可以减少削弱大鼠视网膜神经节细胞兴奋毒性损伤,减少视网膜神经节细胞凋亡.方法:实验于2003-03/09在第三军医大学营养与食品卫生学教研室完成.通过玻璃体注射谷氨酸建立大鼠视网膜谷氨酸兴奋毒性损伤模型,实验分为正常对照组、玻璃体注射磷酸盐缓冲液对照组,牛磺酸干预高、低剂量组及MK-801干预阳性对照组.牛磺酸干预采用腹腔注射,其高、低剂量分别为25 mg/kg体质量及5 mg/kg体质量.通过Thy-1免疫组化、原位缺口末端标记法观察谷氨酸兴奋毒性及牛磺酸干预对大鼠视网膜神经节细胞的Thy-1蛋白表达及细胞凋亡的影响.结果:玻璃体注射谷氨酸使视网膜Thy-1免疫反应下降、内核层及神经节细胞层出现大量凋亡细胞.谷氨酸组平均每张视网膜切片节细胞层有(200&;#177;12)个原位缺口末端标记阳性细胞,牛磺酸干预使视网膜Thy-1免疫反应增强、节细胞层凋亡细胞数显著下降[高、低剂量组分别为(68&;#177;6)个及(163&;#177;10)个],以高剂量牛磺酸的效果显著.结论:一定剂量的牛磺酸在体内可有效抑制谷氨酸兴奋毒性引起的大鼠视网膜神经节细胞损伤及凋亡.     

单核细胞趋化蛋白-1对大鼠脑内神经干细胞的诱导作用

目的探讨外源性单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)对体内神经干细胞的作用。方法成年雄性Sprague-Dawley 大鼠64 只分为空白组(n=4)、对照组(n=30)和实验组(n=30)。空白组不做处理,对照组大脑皮层微量定向注射PBS 液,实验组注射MCP-1。注射后3 d、5 d、7 d、14 d、21 d 分别取对照组和实验组大鼠各6 只灌注取脑。免疫组织化学法观察脑内不同部位nestin 阳性细胞的分布。结果实验组皮质区、海马区nestin 阳性细胞矫正累积吸光度随时间延长而显著增加(P<0.001)。对照组和空白组之间无显著性差异(P>0.05)。结论外源性MCP-1 可以促进MCP-1 富集部位的nestin阳性细胞的数量增多。     

腺病毒介导的心肌营养素1基因修饰大鼠神经干细胞

目的:以心肌营养素1基因修饰大鼠神经干细胞,为心肌营养素1基因修饰的神经干细胞移植治疗中枢神经系统损伤提供物质基础。方法:实验于2002-06/2003-06在第三军医大学野战外科研究所全军重点开放实验室进行。从W istar大鼠胚胎海马和室管膜区组织分离、培养大鼠胚胎神经干细胞,以构建纯化好的重组腺病毒-心肌营养素1和重组腺病毒-增强绿色荧光蛋白载体转染神经干细胞。相差显微镜下直接观察细胞生长存活情况,应用免疫细胞化学和免疫荧光技术检测神经干细胞及其诱导后分化细胞的特异性蛋白巢蛋白、神经微丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白,外源性Brdu和增强绿色荧光蛋白的掺入情况,并观察心肌营养素1基因在神经干细胞中的表达。结果:①从胚胎大鼠分离的神经干细胞可在体外多次传代,经细胞增殖标记物Brdu掺入实验证明神经干细胞具有分裂增殖能力。②检测神经干细胞标志物巢蛋白、神经元标志物神经微丝蛋白和胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白,证实神经干细胞具有多向分化潜能。③重组腺病毒-心肌营养素1及重组腺病毒-增强绿色荧光蛋白转染神经干细胞后应用免疫组化和荧光示踪技术,检测到神经干细胞中心肌营养素1和报告基因增强绿色荧光蛋白表达明显持续增加。结论:①实验成功地分离和培养出大鼠神经干细胞,并在体外可多次传代增殖并可诱导分化为神经元和胶质细胞。②重组腺病毒-心肌营养素1和重组腺病毒-增强绿色荧光蛋白转染神经干细胞后,外源性心肌营养素1基因和增强绿色荧光蛋白在细胞中可持续稳定表达。     

腺病毒介导的心肌营养素1基因修饰大鼠神经干细胞

目的：以心肌营养素1基因修饰大鼠神经干细胞,为心肌营养素1基因修饰的神经干细胞移植治疗中枢神经系统损伤提供物质基础.方法：实验于2002-06/2003-06在第三军医大学野战外科研究所全军重点开放实验室进行.从Wistar大鼠胚胎海马和室管膜区组织分离、培养大鼠胚胎神经干细胞,以构建纯化好的重组腺病毒-心肌营养素1和重组腺病毒-增强绿色荧光蛋白载体转染神经干细胞.相差显微镜下直接观察细胞生长存活情况,应用免疫细胞化学和免疫荧光技术检测神经干细胞及其诱导后分化细胞的特异性蛋白巢蛋白、神经微丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白,外源性Brdu和增强绿色荧光蛋白的掺入情况,并观察心肌营养素1基因在神经干细胞中的表达.结果：①从胚胎大鼠分离的神经干细胞可在体外多次传代,经细胞增殖标记物Brdu掺入实验证明神经干细胞具有分裂增殖能力.②检测神经干细胞标志物巢蛋白、神经元标志物神经微丝蛋白和胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白,证实神经干细胞具有多向分化潜能.③重组腺病毒-心肌营养素1及重组腺病毒-增强绿色荧光蛋白转染神经干细胞后应用免疫组化和荧光示踪技术,检测到神经干细胞中心肌营养素1和报告基因增强绿色荧光蛋白表达明显持续增加.结论：①实验成功地分离和培养出大鼠神经干细胞,并在体外可多次传代增殖并可诱导分化为神经元和胶质细胞.②重组腺病毒-心肌营养素1和重组腺病毒-增强绿色荧光蛋白转染神经干细胞后,外源性心肌营养素1基因和增强绿色荧光蛋白在细胞中可持续稳定表达.     

LINGO-1在脊髓神经干细胞向少突胶质细胞分化中的作用研究

目的:观察LRR结构和免疫球蛋白结构域Nogo受体作用蛋白(LINGO-1)在脊髓神经干细胞(SpNSCs)向少突胶质细胞分化过程中的表达特征及其对少突胶质细胞分化成熟的作用。方法:体外培养大鼠脊髓神经干细胞并诱导分化,于分化第3天及第5天进行LINGO-1与A2B5及O4免疫荧光双染色,观察LINGO-1的表达特征。体外培养的大鼠脊髓来源神经干细胞分为对照组及干扰组,干扰组通过LINGO-1shRNA慢病毒感染SpNSCs下调LINGO-1表达,对照组表达Scramble-shRNA的慢病毒,通过LINGO-1shRNA慢病毒感染SpNSCs下调LINGO-1表达,于分化第7天免疫荧光染色检测少突胶质细胞分化情况及髓鞘碱性蛋白(MBP)表达情况。结果:LINGO-1与A2B5及O4均共表达于分化细胞中。下调LINGO-1表达后,成熟少突胶质细胞达到对照组细胞的3.28倍,MBP表达量为对照组的5.31倍,且均具有统计学意义(均P0.05)。结论:LINGO-1在少突胶质细胞分化过程中持续表达,LINGO-1负性调控少突胶质细胞分化及成熟。     

脑微血管内皮细胞对体外缺氧神经干细胞增殖及凋亡的影响

目的:观察脑微血管内皮细胞对体外培养缺氧神经干细胞增殖、凋亡的影响。方法:实验于1996-01/1996-12在佳木斯大学神经科学所完成。实验材料:同一基因背景新生的Wistar大鼠由哈尔滨医科大学实验动物学部提供(黑动字第99102001)。实验方法:①取新生24hWistar大鼠大脑培养神经干细胞,采用免疫组织化学方法鉴定神经干细胞。②取出生1～7dWistar大鼠大脑培养脑微血管内皮细胞,采用免疫细胞化学方法鉴定。③将培养传代纯化的脑微血管内皮细胞,用0.25%胰酶消化成单细胞液后接种于涂有多聚赖氨酸包被的盖玻片上,接种传3代后用胰酶消化的神经干细胞,以1∶10接种比例加入神经细胞完全培养液共培养。④用无菌石蜡油覆盖于低糖细胞培养液表面,制备低氧低糖溶液。对照组:正常神经干细胞置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养。缺氧共培养组:取共培养3d细胞,吸出培养液,用无菌Hank’s缓冲液清洗2次,加入低氧低糖溶液共同作用2,4,8,16h后换液,用PBS缓冲液冲洗3次后,换神经细胞完全培养液,置于细胞培养箱中复氧培养。缺氧单纯神经干细胞组:取传3代神经干细胞,用无菌Hank’s缓冲液清洗2次后,方法同上。实验评估:免疫组织荧光鉴定缺氧条件下神经干细胞的增殖与凋亡。结果:①免疫组织化学方法检测Nestin及Ⅷ因子相关抗原分别鉴定为神经干细胞及脑微血管内皮细胞。②对照组细胞胞体饱满,折光性强,周围有光晕。缺氧单纯神经干细胞组细胞胞体肿胀,折光性差,有大量细胞碎屑,仅有少量活细胞,并出现悬浮死细胞。缺氧共培养组细胞形态有所改善,细胞折光性仍较好,大部分细胞突起仍未见回缩,仅少数细胞肿胀,坏死。③随着缺氧时间的延长,细胞死亡明显增多,存活数明显下降。缺氧共培养组细胞存活数明显高于缺氧单纯神经干细胞组与对照组(321.76±22.20,180.00±17.89,255.33±10.33,P<0.01)。④缺氧条件下脑微血管内皮细胞对神经干细胞增殖及凋亡的影响:缺氧共培养组细胞存活数明显高于缺氧单纯神经干细胞组,细胞凋亡细胞数低于缺氧单纯神经干细胞组(P<0.05)。结论:脑微血管内皮细胞可以促进缺氧神经干细胞的增殖、减少其凋亡。     

雷帕霉素对胶质瘤干细胞的特异性凋亡作用

目的探索磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂雷帕霉素对胶质瘤干细胞的特异性凋亡作用。方法应用磁式分选系统将胶质瘤细胞分为CD133+和CD133-细胞。应用MTT法检测雷帕霉素对两种胶质瘤细胞的生长抑制作用。Annex-in V-FITC和碘化丙锭(PI)双染检测细胞凋亡。流式细胞仪检测细胞周期。Western blot检测PI3K蛋白表达。结果雷帕霉素以浓度依赖方式抑制胶质瘤细胞的生长,且对CD133+细胞的生长抑制作用显著强于CD133-细胞。比起CD133-细胞,雷帕霉素对CD133+细胞具有更强的凋亡作用。结论雷帕霉素对胶质瘤干细胞具有特异性的抗肿瘤效应,可能与胶质瘤干细胞具有较强的PI3K活性有关。     

低氧环境下白细胞介素1β诱导中脑源性神经干细胞的分化

背景：在体外某些外来信号的调控和诱导下,神经干细胞可定向诱导分化成与受体部位细胞类型与构成相似的细胞群体,使其更容易掺入靶组织,并可满足移植所需的细胞数量,提高移植细胞的存活率。目的：验证白细胞介素1β在低氧环境下体外诱导中脑源性神经干细胞的分化。方法：分离孕12d胎鼠中脑组织,培养神经干细胞、传代并鉴定。将鉴定后传代培养的中脑源性神经干细胞按分组接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12＋白细胞介素1β培养基;分别置于常氧（体积分数21%O2）和低氧（体积分数3%O2）环境下诱导分化,诱导分化9-11d后行小鼠抗大鼠酪氨酸羟化酶免疫细胞化学染色,检测酪氨酸羟化酶及神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率。结果与结论：与常氧组比较,低氧组尤其是低氧＋白细胞介素1β组中酪氨酸羟化酶阳性神经元的突起数目更多,且长度更为延长。孕12d胚鼠腹侧中脑组织可以在体外培养传代、并能诱导分化成多巴胺能神经元;在低氧环境或低氧＋白细胞介素1β诱导下,分化率均高于常氧组,其表型更成熟。说明在低氧或低氧和白细胞介素1β诱导下,可明显促进中脑源性干细胞分化为形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

转化生长因子β1诱导以纤维连接蛋白作为生长基质的神经干细胞迁移实验

背景：如伺使移植入脑的或自体激活的神经干细胞在迁移途中能大量存活并准确到达病灶部位，以修复和替代受损组织，是应用神经干细胞治疗神经系统损伤的关键问题。目的：观察转化牛长因子β1对以纤维连接蛋白为生长基质的神经干细胞定向迁移的影响。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2007-03／11在佳木斯大学神经科学研究所完成。材料：选取同一基因背景Wistar大鼠72只，随机数字表法分成3组：模型对照组、单纯神经干细胞移植组、转化生长因子β1与纤维连接蛋白包被的神经干细胞联合移植组（简称联合移植组），每组24只，移植后1，3，7，14d每个时间点6只。方法：各组大鼠均采用Zea Longa线栓法建立局灶性脑缺血模型。单纯神经干细胞移植组在左侧例脑室注入5μL已标记Brdu的神经干细胞悬液。联合移植组在左侧感觉运动皮质区注入100μg／L的转化生长因子2μL；左侧侧脑室注入5μL已标记Brdu的纤维连接蛋自包被神经干细胞悬液。各组分别于移植后1，3，7，14d取脑组织制备切片。主要观察指标：Brdu标记的的神经干细胞在宿主脑内的迁移。结果：体外培养的神经干细胞移植到大鼠脑缺血模型后，在侧脑室F区，移植1d时，各实验组均有细胞存活，3d时细胞逐渐增加，到7d时，Brdu阳性细胞从侧脑室大量迁出，侧脑室下区阳性细胞数明显增多达到高峰，联合移植组的阳性细胞数多于其他两组，且迁移趋势明显。在皮质区，神经干细胞移植3d时迁移到皮质区的细胞数量开始增加，7d时达到高峰，各时间点均多于对照组，差异有显著性。并且到达皮质区的神经干细胞最终能分化为神经元。结论：转化生长因子β1可以促进以纤维连接蛋白作为生长基质的神经干细胞定向迁移。转化生长因子β1与纤维连接蛋白在诱导神经干细胞迁移方面可能有协同效应。