包载人基质金属蛋白酶组织抑制因子1重组腺病毒微球的制备及其表征

背景:高分子载药微球可控释药物,易于实现靶向给药,是近年发展快速的的新剂型。目的:制备携带人基质金属蛋白酶组织抑制因子1的重组腺病毒微球,并进行表征分析。方法:采用可降解的生物材料聚乳酸-聚乙烯醇包被携带人基质金属蛋白酶组织抑制因子1基因的重组腺病毒制成微球,体外检测其形态大小、包封率、载病毒率及释放规律。重组腺病毒微球感染人肝癌细胞株HepG2,检测感染效率,明胶酶谱分析测定微球对HepG2分泌TIMP-1的影响,Western blot检测人基质金属蛋白酶组织抑制因子1蛋白的表达,MTT实验检测细胞增殖率,体外侵袭小室实验检测细胞侵袭力。结果与结论:构建的包载人基质金属蛋白酶组织抑制因子1重组腺病毒的PELA微球直径约1.965μm,包封率为60.0%,载病毒率为10.5×108/mg,在120h内释放病毒量接近60%,总释放时间长于240h。腺病毒微球感染HepG2细胞,当微球>10mg时,感染效率可达90%以上。微球感染HepG2细胞后经Western blot检测可见人基质金属蛋白酶组织抑制因子1蛋白的表达。MTT实验及体外侵袭实验结果均提示重组腺病毒微球对HepG2细胞的体外增殖和侵袭有抑制作用,腺病毒微球组细胞增殖率较低(P<0.05),腺病毒微球感染的HepG2细胞体外侵袭力明显降低(P<0.01)。结果证实,制备的人基质金属蛋白酶组织抑制因子1重组腺病毒微球,高效缓释,可明显抑制肝癌HepG2细胞体外增殖和侵袭。     

细胞外基质、基质金属蛋白酶及其抑制因子的研究进展

细胞外基质(ECM)主要包括胶原、糖蛋白、蛋白多糖、糖胺多糖和弹性纤维等五大类,其中最重要也是近年研究最多的是胶原,至今已发现19型不同的胶原分子和34种不同的α肽链.正常活体组织ECM处于产生和降解的动态平衡,多种因子介导的细胞增殖能促进ECM产生增多;脯肽酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬酰胺蛋白酶、糖苷酶、基质金属蛋白酶(MMPs)等六大酶系参与ECM的降解,其中以MMPs最为重要.金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)是MMPs的特异性抑制因子,能调节MMPs的活性.MMPs/TIMPs的表达受多种生长因子和细胞因子的调节,MMPs/TIMPs对细胞增殖也有反作用.     

基质金属蛋白酶及其抑制因子与肝纤维化

肝纤维化 (ｈｅｐａｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓ)是指各种致病因子引起的肝脏损害和炎症 ,进而导致纤维结缔组织广泛增生和沉积。其本质是肝脏对各种损害的一种愈合反应。但这种反应的结果导致肝脏功能受损〔1〕。在这个进行性的病理过程中 ,涉及多种细胞与分子因素的作用 ,引起细胞外基质合成与降解过程调节机制上的改变 ,这种改变有利于促进细胞外基质 (ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ ,ＥＣＭ)合成、沉积增多 ,而降解相对减少甚至抑制 ,其结果是肝细胞功能进一步受损、肝脏结构破坏而最终导致肝硬化。其中心过程是肝星状细胞(ｈｅｐ…     

基质金属蛋白酶及其组织抑制因子在心肌梗死后心室重构中的作用

心肌梗死后心室重构是心力衰竭产生的重要原因,其中细胞外基质的改建是重要的分子机制。基质金属蛋白酶(MMPs)是降解细胞外基质的重要蛋白水解系统。基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)是MMPs的内源性抑制系统。MMPs/TIMPs平衡失调是心肌梗死后胶原网络重构的重要调节因素之一。现就MMPs和TIMPs在心肌梗死后心室重构中的作用及基质金属蛋白酶抑制剂抗重构治疗的研究进展作一综述。     

细胞外基质,基质金属蛋白酶及其抑制因子的研究进展

细胞外基质（ＥＣＭ）主要包括胶原、糖蛋白、蛋白多糖、糖胺多糖和弹性纤维等五大类,其中最重要也是近年研究最多的是胶原,至今已发现１９型不同的胶原分子和３４种不同的ａ肽链,正常活体组织ＥＣＭ处于产生和降解的动态平衡,多种因子介导的细胞增殖能促进ＥＣＭ产生增多;脯肽酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬酰胺蛋白酶、糖苷酶、基质金属蛋白酶（ＭＭＰｓ）等六大酶系参与ＥＣＭ的降解,其中以ＭＭＰｓ最大为重要。     

基质金属蛋白酶及其组织抑制因子与胶质瘤新生血管形成

胶质瘤的侵袭生长与转移依赖新生血管形成。而基质金属蛋白酶(MMPs)与其组织抑制因子(TIMPs)的动态平衡与肿瘤新生血管形成密切相关，现对这一关系作一综述。     

基质金属蛋白酶及其组织抑制物与肿瘤侵袭转移

基质金属蛋白酶（MMPs）是降解细胞外基质成分的一大类含2价锌离子水解酶,基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIMPs）则是基质金属蛋白酶（MMPs）的天然抑制物,两者在细胞外基质代谢中的相互作用是肿瘤细胞的侵袭及转移的关键因素;探讨MMPs与TIMPs在不同类型肿瘤及在不同表型的分泌和表达水平,对临床肿瘤的预防、诊断及预后有重要意义,也可为临床肿瘤治疗提供新的方向和新的策略。     

肝纤维化时基质金属蛋白酶-2及其组织抑制因子的表达

目的：了解基质金属蛋白酶-2（MMP-2）及其组织抑制因子（TIMP-2）在不同病因致有肝纤维化病理阶段中的变化。分析MMP-2/TIMP-2与肝病理损害的关系。方法：用免疫组织化学（LsAB法）,在正常肝组织,慢活肝伴早期肝纤维化,肝癌伴早期肝纤维化、胆汁性肝硬化、坏死后性肝硬化病例中MMP-2及TIMP-2的联合检测,行半定量研究。结果：正常肝组织MMP-2/TIMP-2的比值高于病肝组;早期肝纤维化组MMP-2/TIMP-2比值高于肝硬化组;早期肝纤维化组组间,肝硬化组组间MMP-2/TIMP-2比值无显著差异。结论：早期肝纤维化MMP-2表达相对增高,对肝纤维化的始动和进展起重要作用。肝硬化时TIMP-2表达明显增高,抑制MMP-2,细胞外基质（ECM）降解障碍而大量沉积,加重肝病理损害。     

口腔疣状癌基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9和金属蛋白酶组织抑制因子-2的表达及其相关性的研究

目的:研究口腔疣状癌中基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9及金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-2)的表达.探讨其在口腔疣状癌发生发展过程中的作用和意义.方法:取25例口腔疣状癌,10例正常口腔黏膜,25例口腔鳞癌(高、低分化鳞癌各为15、10例),应用免疫组织化学法检测上述标本中MMP-2、MMP-9及,TIMP-2的表达和分布.结果:正常口腔黏膜组织TIMP-2为阴性表达:MMP-2、MMP-9的阳性表达率分别为10.00%、20.00%.口腔疣状癌MMP-2阳性表达率为28.00%.MMP-9阳性表达率为44.00%,TIMP-2阳性表达率为72.00%.口腔疣状癌、口腔高分化鳞癌、口腔低分化鳞癌MMP-2、MMP-9、TIMP-2表达均高于正常口腔黏膜(P<0.05).结论:在口腔疣状癌,口腔高分化鳞癌、口腔低分化鳞癌中.MMP-2与MMP-9的阳性表达率呈正相关,与TIMP-2呈负相关;相关分析发现,MMP-2、MMP-9和TIMP-2的袁达两两相关,同时3者的表达可能单独或共同参与.     

构建人基质金属蛋白酶1基因重组腺病毒载体及体外降解Ⅲ型胶原的检测

背景：基质金属蛋白酶1能够降解以Ⅰ型胶原为主的细胞外基质,有望逆转纤维化组织。目的：利用Gateway技术构建含人基质金属蛋白酶1基因的重组腺病毒载体,并观察其在体外降解Ⅲ型胶原蛋白的能力。方法：从携带人基质金属蛋白酶1基因片段的pcDNA3.1质粒中PCR扩增出人基质金属蛋白酶1基因片段,双酶切连接入门载体pENTERTM 1A形成入门克隆,利用LR反应与目的载体pJTITM R4 Dest CMV-N-EmGFP pA Vector同源重组构建表达克隆pAd- hMMP-1-eGFP。经PacⅠ酶切线性化转入HEK293A细胞包装获得重组腺病毒 Ad-hMMP-1-eGFP,RT-PCR 及 Western-Blot 法分别检测目的基因与蛋白表达。细胞分为3组：①空白对照组：HEK293A细胞。②AD-EGFP组：Ad-eGFP感染HEK293空白对照组。③AD-HMMP1-EGFP组：Ad-hMMP-1-eGFP感染HEK293空白对照组。分别加入相同含量Ⅲ型胶原蛋白,在24,48,72 h用ELISA试剂盒检测Ⅲ型胶原蛋白水平。结果与结论：经酶切及测序鉴定证实入门载体和目的载体中均含有人基质金属蛋白酶1目的基因。重组腺病毒Ad- hMMP-1-eGFP感染293A细胞后4 d观察到绿色荧光表达,10 d荧光强度达最高,12d收集病毒液;测定病毒滴度为4.84·1010 PFU/mL,Western-Blot法检测目的蛋白高效表达。随时间延长,空白对照组和AD-EGFP组胶原蛋白含量无明显变化,AD-HMMP1-EGFP组24,48,72 h胶原蛋白降解率分别为24%,56%,81%,与空白对照组、AD-EGFP组相比AD-HMMP1-EGFP组降解胶原效果显著（P 〈0.01）。利用Gateway技术成功构建含人基质金属蛋白酶1基因的重组腺病毒载体,与传统构建方法相比具有高效性和特异性,分泌基质金属蛋白酶1检测其降解Ⅲ型胶原蛋白效果显著。     

人分化抑制因子3重组腺病毒的制备及鉴定

目的构建人细胞分化抑制因子3(Id3)重组腺病毒载体,制备并鉴定人Id3重组腺病毒,为研究Id3基因在细胞中的表达及其对细胞功能的影响奠定基础。方法以pUC57-Id3为模板扩增人Id3基因,克隆到质粒pUC18中,pUC18-Id3经EcoR I和HindⅢ双酶切补平之后与载体pAxCAwtit连接,构建重组粘粒载体pAxCAwtit-Id3,包装试剂盒包装重组粘粒,转染大肠埃希菌,鉴定正确后大量制备重组pAxCAwtit-Id3,经酶切线性化后,用脂质体法转染HEK293A细胞,包装成重组腺病毒Ad-Id3,制备高滴度的重组腺病毒Ad-Id3,利用TCID50法计算重组腺病毒滴度,经RT-PCR及western blot检测Id3基因的表达。结果Id3基因成功克隆到腺病毒载体中,重组腺病毒滴度为1.8×1010PFU/ml,用RT-PCR检测到Id3基因的转录产物,westernblot检测到Id3在A549细胞中的高水平表达。结论成功构建Ad-Id3重组腺病毒载体,并在A549细胞中得到高效表达。     

急性冠状动脉综合征患者血清基质金属蛋白酶-9及其抑制物水平变化

目的:观察不同类型冠心病患者血清基质金属蛋白酶-9、组织金属蛋白酶抑制物-1水平的变化,进一步了解血清基质金属蛋白酶-9及组织金属蛋白酶抑制物-1在冠状动脉粥样硬化发生发展中的作用及临床意义.方法:采用酶联免疫吸附法测定60例冠心病患者(急性冠状动脉综合征患者30例、稳定性心绞痛患者30例)、30例非冠心病患者(对照组)血清基质金属蛋白酶-9,组织金属蛋白酶抑制物-1的水平.结果:急性冠状动脉综合征组血清基质金属蛋白酶-9水平高于稳定性心绞痛组及对照组(P<0.01),而血清组织金属蛋白酶抑制物-1水平低于稳定性心绞痛组及对照组(P<0.01).稳定性心绞痛组血清基质金属蛋白酶-9水平高于对照组(P<0.01),血清组织金属蛋白酶抑制物-1水平低于对照组(P<0.01).急性冠状动脉综合征患者治疗后血清基质金属蛋白酶-9水平低于治疗前,组织金属蛋白酶抑制物-1高于治疗前(P<0.01).结论:血清基质金属蛋白酶-9水平增高及组织金属蛋白酶抑制物-1水平降低与粥样斑块破裂相关,可作为判断粥样斑块不稳定的血清学指标.血清基质金属蛋白酶-9水平增高及组织金属蛋白酶抑制物-1水平降低有助于评价冠状动脉病变的程度及冠心痛患者的预后.     

同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶1及金属蛋白酶组织抑制剂1的影响

背景:同型半胱氨酸已被证实是动脉粥样硬化发生的一个独立危险因素。目的:观察同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶1及金属蛋白酶组织抑制剂1的分泌量和活性的影响。设计:自身对照观察。单位:吉林大学再生医学科学研究所病理室。材料:体外培养的鼠龄4～6周,体质量150g左右雄性Wistar大鼠的血管平滑肌细胞。大鼠由吉林大学白求恩医学部实验动物室提供。方法:实验于2001-05/2003-05在吉林大学再生医学科学研究所病理室完成。采用体外培养大鼠血管平滑肌细胞,分成5组,分别加入浓度为0(对照组),0.10,0.25,0.50和1.00mmol/L同型半胱氨酸作用48h,通过酶谱分析同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞细胞基质金属蛋白酶1活性的影响,Western blot技术和半定量RT-PCR方法观察细胞基质金属蛋白酶1和金属蛋白酶组织抑制剂1分泌量及其mRNA的表达。主要观察指标:细胞基质金属蛋白酶1的活性,金属蛋白酶1和金属蛋白酶组织抑制剂1分泌量及其mRNA的表达。结果:①金属蛋白酶1和金属蛋白酶组织抑制剂1分泌量:半胱氨酸0.25,0.50和1.00mmol/L组金属蛋白酶1显著低于对照组(P<0.05～0.01);半胱氨酸0.10,0.25,0.50和1.00mmol/L组金属蛋白酶组织抑制剂1均高于对照组(P<0.05～0.01);②基质金属蛋白酶1活性随着半胱氨酸剂量增加而降低,0.50和1.00mmol/L组降低显著(P<0.01);③加入同型半胱氨酸4组金属蛋白酶1mRNA表达显著低于对照组(P<0.01)],半胱氨酸0.25mmol/L组金属蛋白酶组织抑制剂1mRNA高于对照组(P<0.05),0.50和1.00mmol/L组显著高于对照组(P<0.01))。结论:同型半胱氨酸通过抑制细胞基质金属蛋白酶1的分泌,抑制其酶活性,减少胶原降解而使胶原蓄积。提示同型半胱氨酸减少胶原降解可能是动脉粥样硬化的发病机制之一。     

低密度脂蛋白循环免疫复合物对U937细胞基质金属蛋白酶-1及其抑制物的作用

目的探讨低密度脂蛋白循环免疫复合物(LDL-IC)对U937细胞基质金属蛋白酶-1(MMP-1)及其抑制物组织金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)mRNA表达的影响。方法分别采用不同浓度的天然低密度脂蛋白(N-LDL)、氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)及其免疫复合物作用U937细胞,通过半定量RT-PCR分析U937细胞中MMP-1和TIMP-1基因表达的变化。结果正常U937细胞几乎不表达MMP-1,而高表达TIMP-1。N-LDL对细胞MMP-1和TIMP-1 mRNA表达没有影响。Ox-LDL能引起MMP-1轻度表达,但显著地下调TIMP的表达;而天然、氧化LDL的循环免疫复合物均非常显著地增加MMP-1和降低TIMP-1的mRNA表达(P<0.001),且较Ox-LDL对MMP-1的作用更为显著(P<0.001),并具剂量效应。结论N-LDL-IC和Ox-LDL-IC增强U937细胞MMP-1 mRNA表达,下调其抑制物TIMP-1的表达。     

肝素对脂多糖诱导内皮细胞损伤中基质金属蛋白酶及其组织抑制剂基因表达的影响

目的 探讨基质金属蛋白酶9(MMP-9)及其组织抑制剂-1(TIMP-1)在脂多糖(LPS)诱导内皮细胞损伤中的表达,并观察肝素对其水平的影响.方法 LPS 10μg/ml刺激人肺微血管内皮细胞(HPMEC)诱导损伤,肝素预处理组分别于LPS刺激前15 min加入0.1 U/ml及1 U/ml普通肝素,对照组加入等量磷酸盐缓冲液(PBS).分别在刺激2、6、12h收集细胞提取RNA,应用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测各组细胞中MMP-9及TIMP-1的mRNA表达.结果 与对照组比较,LPS刺激2h组MMP-9和TIMP-1的mRNA表达明显增高,12h达高峰(MMP-9 mRNA:4.26±0.81比1.00±0.46,TIMP-1 mRNA:4.93 ±0.08比1.00±0.13,均P＜0.05),以TIMP-1增高明显.预防性应用肝素可明显降低MMP-9和TIMP-1的mRNA表达(0.1 U/ml组:MMP-9 mRNA 2.74±0.30,TIMP-1 mRNA 2.96±0.13;1 U/ml组:MMP-9 mRNA 3.08±0.48,TIMP-1 mRNA 2.93±0.27,均P＜0.05).不同剂量肝素组间基因表达水平差异无统计学意义.结论 LPS诱导内皮细胞损伤时MMP-9、TIMP-1表达增加,肝素可能通过调节MMP-9、TIMP-1表达水平发挥其保护作用.     

EEF1A2嵌合型重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:克隆人类真核翻译延长因子1A2(EEF1A2)基因全长,构建其重组腺病毒载体。方法:应用RT-PCR方法从人胰腺癌组织中扩增人EEF1A2基因全长,经T-A克隆后,亚克隆到腺病毒穿梭质粒pDC316,构建穿梭质粒pDC316-EEF1A2。利用同源重组的方法将腺病毒骨架质粒pBHG35和穿梭质粒pDC316-EEF1A2共转染293细胞,获得腺病毒重组质粒Ad5/F35-EEF1A2,经过在293细胞中包装和扩增之后,获得高滴度的腺病毒重组质粒Ad5/F35-EEF1A2。PCR、WesternBlot检测EEF1A2基因的表达。结果:用RT-PCR方法,从人胰腺癌组织中扩增出1400bp的cDNA片段,经测序证实为人EEF1A2基因。构建及包装出高滴度的重组腺病毒载体Ad5/F35-EEF1A2。结论:成功地克隆了人EEF1A2基因全长,并构建其表达的重组腺病毒载体,为进一步研究人EEF1A2基因在相关疾病中的作用奠定了基础。     

急性冠状动脉综合征患者血清明胶酶B与基质金属蛋白酶组织抑制因子-1水平的临床探讨

目的 通过测定急性冠状动脉综合征(ACS)患者血清明胶酶B(MMP-9)及基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)水平,探讨MMP-9及TIMP-1与粥样斑块破裂的关系。评价血清MMP-9及TIMP-1水平作为粥样斑块破裂的血清学指标的意义。方法 选择稳定型心绞痛(SAP)患者30例,ACS惠者54例,并选择30例健康人作为对照。比较ACS组与SAP组及正常对照组之间血清MMP-9及TIMD-1水平的差异。结果 ACS组血清MMP-9水平高于SAP组及正常对照组,而血清TIMP-1水平低于SAP组及正常对照组,且具有统计学意义。SAP组血清MMP-9水平高于正常对照组,而血清TIMP—1水平低于正常对照组,也具有统计学意义。结论 血清MMP-9水平增高及TIMP-1水平的降低与粥样斑块破裂相关,可作为判断粥样斑块不稳定的血清学指标。     

慢性阻塞性肺疾病患者急性加重期血清基质金属蛋白酶抑制剂及基质金属蛋白酶9浓度与肺功能变化的关系

目的探讨慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)患者血清MMP-9、TIMP-1浓度的变化及其与肺功能变化的关系。方法应用酶联免疫吸附(ELISA)方法检测58例AECOPD患者和30名健康人血清中MMP-9、TIMP-1浓度。结果AECOPD患者血清MMP-9、TIMP-1浓度[(128.89±115.84)ng/mL、(228.28±107.133)ng/mL]明显高于对照组[(30.65±18.43)ng/mL、(133.69±41.41)ng/mL,P<0.01]。AECOPD组和对照组血清MMP-9、TIMP-1浓度与FEV1占预计值%具有负相关性(r=-0.591、-0.651,P<0.01);AECOPD组和对照组血清MMP-9、TIMP-1浓度与FEV1/FVC%具有负相关性(r=-0.558、-0.653,P<0.01);MMP-9/TIMP-1比率与FEV1占预计值%及FEV1/FVC%具有负相关性(r=-0.373、-0.356,P<0.05)。结论MMP-9、TIMP-1是引起肺功能下降很重要的因素。