薯蓣皂苷元对人骨肉瘤细胞自噬的影响

目的 探讨薯蓣皂苷元对人骨肉瘤细胞自噬的影响。方法 MTT法检测薯蓣皂苷元对人骨肉瘤MG63和U2OS细胞增殖的影响,透射电镜技术观察细胞超微结构,免疫荧光法观察细胞自噬蛋白Beclin1表达,Western blot法检测细胞自噬分子标记物LC3、Beclin1和PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达。薯蓣皂苷元联合PI3K通路抑制剂LY294002处理MG63和U2OS细胞,RT-qPCR法检测细胞Beclin1 mRNA表达;联合自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)处理MG63和U2OS细胞,MTT法检测细胞增殖抑制率,Western blot法检测细胞cleaved-caspase3蛋白表达,RT-qPCR法检测细胞caspase3 mRNA表达。结果 薯蓣皂苷元能抑制骨肉瘤MG63和U2OS细胞增殖,促使自噬体生成,增加LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达(P<0.05,P<0.01),降低LC3 I蛋白表达(P<0.01),可抑制PI3K/Akt/mTOR通路蛋白磷酸化水平(P<0.05,P<0.01);联合自噬抑制剂干预后...     

自噬在骨肉瘤化疗中作用的体内研究

目的:探讨自噬的调节对骨肉瘤化疗的影响。方法:建立裸鼠骨肉瘤动物模型,自噬抑制剂3甲基腺嘌呤(3MA)和顺铂(DDP)干预肿瘤的生长,观察不同药物对骨肉瘤的生长情况的影响,检测肿瘤大小变化,HE染色观察病理表现。结果:对照组、DDP组、3MA+DDP组3组之间用药前后体积的比较差异具有统计学意义。DDP确实能较有效的抑制肿瘤的生长,加入3MA干预后能增强其敏感性,肿瘤的生长得到了进一步的抑制。HE染色见3MA+DDP组移植瘤组织中明显的坏死区。结论:3MA联合DDP化疗能提高对骨肉瘤细胞的杀伤率。     

苦参碱诱导人白血病耐药细胞K562/IM自噬和凋亡的研究

目的观察苦参碱对人白血病耐药细胞K562/IM自噬和凋亡的影响。方法 (1)苦参碱及伊马替尼对细胞增殖及自噬情况检测:分别设空白对照组、不同浓度(0.25、0.50、1.00、2.00、5.00mg/mL)苦参碱组和(0.05、0.25、0.50、5.00、20.00μmol/L)伊马替尼组,MTT检测K562细胞和K562/IM细胞抑制率。分别设置空白对照组、0.4 mg/mL苦参碱组和0.5μmol/L伊马替尼组,免疫荧光激光共聚焦检测K562细胞和K562/IM细胞自噬现象,Western Blot检测细胞中自噬标志蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62的表达。(2)苦参碱联合3-甲基腺嘌呤(3-MA)或雷帕霉素(rapamycin,Rapa)诱导K562/IM细胞自噬及凋亡情况变化的检测:实验分6组,空白对照组、苦参碱组(0.4mg/mL苦参碱处理)、3-MA组(5mmol/L 3-MA处理)、Rapa组(0.5μmol/L Rapa处理)、苦参碱+3-MA组(0.4mg/mL苦参碱+5mmol/L3-MA处理)、苦参碱+Rapa组(0.4mg/mL苦参碱+0.5μmol/L Rapa处理),采用MTT检测细胞的抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡水平;Western Blot检测细胞自噬标志蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62及凋亡相关蛋白Caspase-3表达。结果 (1)苦参碱和伊马替尼作用K562、K562/IM细胞,细胞增殖受抑制明显(P0.05),LC3-Ⅱ/Ⅰ的聚集明显增加,Beclin-1及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达升高,P62蛋白表达减少(P0.05),以K562/IM细胞更明显(P0.05)。(2)苦参碱组K562/IM细胞增殖抑制率(36.32±2.21)%,凋亡率(15.35±0.39)%。苦参碱+3-MA组K562/IM细胞增殖抑制率升高[(65.25±2.06)%,P0.01)],凋亡率升高[(21.70±0.48)%,P0.05],同时Beclin-1及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达下降,P62蛋白表达增强,Caspase-3表达增强(P0.05);而苦参碱+Rapa组作用则相反。结论苦参碱和伊马替尼均可抑制K562、K562/IM细胞增殖的同时可诱导自噬,以耐药K562/IM细胞株自噬明显。通过3-MA抑制自噬可增强苦参碱对细胞K562/IM作用的敏感性,而雷帕霉素减弱苦参碱作用。     

黄芪多糖可能通过调控细胞自噬提高宫颈癌HeLa细胞对顺铂的敏感性北大核心CSCD

该研究旨在探讨黄芪多糖可能通过调节细胞自噬提高宫颈癌HeLa细胞对顺铂的化疗敏感性,并探讨其作用的可能机制。该实验将HeLa细胞分为对照组、顺铂组、黄芪多糖组和黄芪多糖联合顺铂组,分别运用MTr法检测各实验组宫颈癌HeLa细胞增殖抑制情况;流式细胞术检测各实验组HeLa细胞的凋亡及周期情况;RT-PCR法检测自噬相关蛋白beclinl,LC3II,1062的mRNA表达情况;Western blot法检测自噬相关蛋白beclinl,LC3Ⅱ,LC3Ⅰ,p62的表达水平。MTT结果显示,与对照组相比,各给药组均可明显抑制HeLa增殖（P〈0．05）,联合给药组的抑制作用更加显著（P〈0．01）。流式细胞术结果显示,与对照组相比,各给药组HeLa的凋亡率均明显增加（P〈0．05）,其中联合给药组的凋亡率显著增加（P〈0．01）;与对照组相比,各给药组HeLa细胞均发生了明显的周期阻滞,以G0／G1期的阻滞最为明显,其中联合给药组G0／G1期的阻滞显著。RT-PCR和Westernblot结果显示,与对照组相比,beclinl、LC3Ⅱ基因及蛋白表达上调,p62基因及蛋白的表达下调,联合给药组的上述相应变化更加显著。通过以上实验结果的分析,推测黄芪多糖可能通过调节细胞自噬来增加宫颈癌HeLa细胞对顺铂的化疗敏感性,这一作用的可能机制是通过上调自噬相关蛋白beclinl,促进LC3I转化为LC3Ⅱ,下调自噬标记蛋白p62,增强HeLa细胞自噬活性,从而增加HeLa细胞对顺铂化疗的敏感性。     

吴门调脂颗粒对大鼠平滑肌细胞自噬的干预研究

目的:探究吴门调脂颗粒对大鼠平滑肌细胞(VSMCs)的自噬在细胞、蛋白质、基因等水平的影响。方法:运用血清药理学方法,以调脂颗粒含药血清、6-氨基-3-甲基嘌呤(3-MA)、雷帕霉素(Rapamycin)诱导处理VSMCs,通过MTT检测调脂颗粒含药血清对细胞生长增殖的影响,Western blotting检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的相对表达量变化,免疫荧光法检测细胞内自噬小体的数目变化,Real time PCR检测自噬相关基因表达变化。结果:调脂颗粒含药血清处理VSMCs后,细胞生存率无明显改变,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的相对表达上调,自噬小体数量增多,自噬相关基因表达上调(P0.05)。雷帕霉素联合调脂颗粒含药血清处理VSMCs后,细胞生存率下降,较雷帕霉素组LC3-Ⅱ的相对表达下降,自噬小体数量显著减少,自噬相关基因表达下调(P0.05或P0.01)。结论:吴门调脂颗粒可以通过多个层面抑制平滑肌细胞的异常增殖及过度自噬,促进平滑肌细胞适度自噬。     

川楝素诱导K562细胞凋亡及其与自噬关系的体外研究

目的 研究川楝素诱导人慢性髓系白血病K562细胞发生凋亡,并探讨凋亡与自噬的关系.方法 采用MTT比色法,检测不同浓度川楝素对K562细胞增殖抑制率的影响,流式细胞术检测细胞凋亡率,透射电镜观察K562细胞超微结构的改变,免疫细胞化学法检测蛋白Apaf-1、LC3-Ⅱ的表达.结果 川楝素对K562细胞有明显增殖抑制作用,呈时间和浓度依赖性(P＜0.01).50nmol/L川楝素处理细胞72h后,K562细胞早期凋亡率为54.20％,与川楝素处理组相比,3-MlA预处理组,凋亡率为68.30％.透射电镜下可见典型的凋亡小体和自噬体.免疫细胞化学法结果显示,K562细胞Apaf-1、LC3-Ⅱ蛋白表达较对照组增强(P＜0.01).结论 川楝素能够有效诱导K562细胞同时发生凋亡和自噬性死亡,当阻断自噬的发生,加速了凋亡的进程,在此过程中Apaf-1、LC3-Ⅱ蛋白上调.     

基于Keap1/Nrf2通路介导的自噬探讨紫草素对膀胱上皮癌BUC细胞化疗敏感性的影响

目的基于Kelch样ECH相关蛋白1/核因子E2相关因子2(Kelch-likeECH-associated protein-1/nuclearfactor E2-related factor 2,Keap1/Nrf2)通路介导的自噬探讨紫草素对膀胱上皮癌BUC细胞化疗敏感性的影响。方法体外培养人BUC细胞BIU-87,CCK-8法检测不同质量浓度(10、20、40、80、160μg/mL)顺铂和不同浓度(2、4、8、16、32μmol/L)紫草素+顺铂(40μg/mL)对BIU-87细胞增殖的影响。细胞转染实验,设置对照组、顺铂组(40μg/mL)、紫草素组(40μg/mL顺铂+8μmol/L紫草素)和NC组(转染negative control-Nrf2+40μg/mL顺铂+8μmol/L紫草素)和Nrf2组(转染hsa-Nrf2mimic+40μg/mL顺铂+8μmol/L紫草素),实时荧光定量PCR(q RT-PCR)法检测转染后BIU-87细胞中Nrf2 mRNA表达情况;CCK-8法检测各组BIU-87细胞增殖情况;流式细胞仪检测各组BIU-87细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测BIU-87细胞中Keap1、Nrf2、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)?、LC3II蛋白表达情况。结果与对照组相比,10、20、40、80、160μg/mL顺铂可显著抑制BIU-87细胞增殖(P0.05);2、4、8、16、32μmol/L紫草素联合顺铂可显著抑制BIU-87细胞增殖(P0.05)。细胞转染实验中,与对照组相比,顺铂组BIU-87细胞增殖抑制率、凋亡率、细胞中Nrf2和LC3II蛋白表达水平显著升高,细胞中Keap1、LC3?蛋白表达水平显著降低(P0.05);与顺铂组相比,紫草素组BIU-87细胞增殖抑制率、凋亡率、细胞中Keap1和LC3?蛋白表达水平显著升高,Nrf2和LC3II蛋白表达水平显著降低(P0.05);紫草素组、NC组以上指标差异不具有统计学意义(P0.05);与NC组相比,Nrf2组BIU-87细胞增殖抑制率、凋亡率、细胞中Keap1、LC3?蛋白表达水平显著降低,Nrf2蛋白和mR NA及LC3II蛋白表达水平显著升高(P0.05)。结论紫草素可能通过抑制Keap1/Nrf2通路介导的自噬反应,增强BUC细胞BIU-87对顺铂的敏感性。     

黄芪多糖可能通过调控细胞自噬提高宫颈癌HeLa细胞对顺铂的敏感性

该研究旨在探讨黄芪多糖可能通过调节细胞自噬提高宫颈癌HeLa细胞对顺铂的化疗敏感性,并探讨其作用的可能机制。该实验将HeLa细胞分为对照组、顺铂组、黄芪多糖组和黄芪多糖联合顺铂组,分别运用MTT法检测各实验组宫颈癌HeLa细胞增殖抑制情况;流式细胞术检测各实验组HeLa细胞的凋亡及周期情况;RT-PCR法检测自噬相关蛋白beclin1,LC3Ⅱ,p62的mRNA表达情况;Western blot法检测自噬相关蛋白beclin1,LC3Ⅱ,LC3Ⅰ,p62的表达水平。MTT结果显示,与对照组相比,各给药组均可明显抑制HeLa增殖(P0.05),联合给药组的抑制作用更加显著(P0.01)。流式细胞术结果显示,与对照组相比,各给药组HeLa的凋亡率均明显增加(P0.05),其中联合给药组的凋亡率显著增加(P0.01);与对照组相比,各给药组HeLa细胞均发生了明显的周期阻滞,以G0/G1期的阻滞最为明显,其中联合给药组G0/G1期的阻滞显著。RTPCR和Western blot结果显示,与对照组相比,beclin1、LC3Ⅱ基因及蛋白表达上调,p62基因及蛋白的表达下调,联合给药组的上述相应变化更加显著。通过以上实验结果的分析,推测黄芪多糖可能通过调节细胞自噬来增加宫颈癌HeLa细胞对顺铂的化疗敏感性,这一作用的可能机制是通过上调自噬相关蛋白beclin1,促进LC3Ⅰ转化为LC3Ⅱ,下调自噬标记蛋白p62,增强HeLa细胞自噬活性,从而增加HeLa细胞对顺铂化疗的敏感性。     

莪术醇诱导人骨肉瘤MG63细胞自噬的实验研究

目的观察莪术醇对人骨肉瘤MG-63细胞自噬性凋亡的作用。方法体外人骨肉瘤MG-63细胞单独或和莪术醇共同培养,MTT法检测莪术醇对骨肉瘤细胞系MG-63的增殖抑制作用;FITC-annexinⅤ/PI染色流式细胞术分析细胞凋亡;PI和hochest33258活细胞染色观察凋亡细胞核形态学变化;EGFP-LC3b细胞转染,荧光显微镜观察细胞自噬;微管相关蛋白1轻链3-β(LC3)蛋白和自噬相关蛋白Beclin-1表达水平用Western blotting方法分析。结果 MTT检测显示莪术醇可抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖,并具有浓度-时间依赖性;流式细胞术检测显示莪术醇可显著诱导MG-63细胞凋亡;活细胞荧光染色显示MG-63细胞核凝聚并碎裂成小体;细胞质内凝集荧光增强;LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白比值,Beclin-1蛋白表达明显增强;自噬抑制剂3-MA可明显逆转上述现象。结论莪术醇能明显抑制人骨肉瘤MG-63细胞的增殖,其机制主要是通过诱导自噬性凋亡。     

氧化槐定碱体内体外通过AKT/mTOR通路调控自噬抑制HBV诱发肝纤维化＊

目的 观察氧化槐定碱抑制HBV诱发肝纤维化的机制。方法 采用细胞间非接触式的共培养体系进行培养，同时建立HBV诱发肝纤维化的动物模型，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测LX-2细胞抑制率，qRT-PCR法检测α-SMA、collagen I mRNA水平，Western blot检测细胞纤维化、自噬、AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达水平，运用AKT-siRNA、雷帕霉素、自噬抑制剂（3-MA）探讨自噬对肝纤维化的影响。结果 体外实验显示：0.5-32 mg·L^-1氧化槐定碱抑制LX-2细胞的增殖（P<0.05）；与对照组比较，氧化槐定碱4、8、16、32 mg·L^-1组α-SMA、collagen I mRNA表达水平降低，Beclin-1、LC3 II/LC3 I水平上调，p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平下调（P<0.05）；与氧化槐定碱16 mg·L^-1组比较，氧化槐定碱16 mg·L^-1+AKT-siRNA组抑制率、LC3 II/LC3 I明显增加，p-AKT/AKT、collagen I明显降低（P<0.05）；与氧化槐定碱16 mg·L^-1组比较，氧化槐定碱16 mg·L^-1+3-MA组抑制率、LC3 II/LC3 I明显降低，p-AKT/AKT、collagen I明显增加（P<0.05）。体内实验显示：与氧化槐定碱组比较，氧化槐定碱+雷帕霉素组ALT、AST、collagen I、p-mTOR/mTOR水平明显下调，LC3 II/LC3 I水平明显上调；氧化槐定碱+3-MA组LC3 II/LC3 I水平明显下调，collagen I、p-mTOR/mTOR明显上调（均P<0.05）。结论 氧化槐定碱能调控肝细胞自噬，上调细胞纤维化水平，其机制可能与调控AKT/mTOR信号通路有关。     

蒲公英萜醇通过mTOR信号通路诱导乳腺癌细胞自噬

目的:体外研究蒲公英萜醇对乳腺癌MCF-7细胞自噬的影响,并探讨相关作用机制。方法:体外培养乳腺癌MCF-7细胞,通过噻唑蓝(MTT)比色法检测蒲公英萜醇(12. 5,25,50,100,200μmol·L-1)对MCF-7细胞增殖的影响;采用吖啶橙(AO),免疫荧光染色和透射电镜观察蒲公英萜醇对乳腺癌MCF-7细胞自噬的影响;应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测蒲公英萜醇用药后细胞自噬相关蛋白表达以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的变化情况。结果:MTT比色法结果显示,蒲公英萜醇组可抑制MCF-7细胞的增殖能力;吖啶橙染色结果显示,与空白组比较,蒲公英萜醇组MCF-7细胞内酸性溶酶体增加;透射电镜观察到用药组细胞内出现明显的自噬体结构;蒲公英萜醇用药后,荧光显微镜下可见MCF-7细胞中出现较多的微管相关蛋白1轻链3(LC3)绿色荧光分布; Western blot结果显示,与空白组比较,蒲公英萜醇可上调LC3-Ⅱ和酵母Atg6同系物(Beclin-1)蛋白表达水平,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高(P 0. 05,P 0. 01);加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)后与蒲公英萜醇组比较,3-MA+蒲公英萜组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ降低(P 0. 05)。蒲公英萜醇用药后可显著下调细胞内p-mTOR和磷酸化的真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白(p-4EBP1)蛋白表达水平(P 0. 05,P 0. 01)。结论:蒲公英萜醇能够诱导MCF-7细胞发生自噬,其机制可能与抑制mTOR信号通路有关。     

萜类化合物Telekin通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导HGC-27细胞自噬

目的:研究从天名精中分离得到的萜类化合物Telekin诱导的胃癌细胞HGC-27自噬并探讨其分子作用机制。方法:MTT法研究Telekin对不同肿瘤细胞的细胞毒活性;透射电镜观察Telekin诱导的HGC-27细胞自噬;用mRFP-GFP-LC3点状聚集物的形成,评价HGC-27细胞内自噬流的变化;MTT法研究用不同自噬抑制剂氯喹(CQ)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)和mTOR抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)预处理时,Telekin对HGC-27细胞的细胞毒活性,研究自噬与细胞死亡的关系。Western blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路关键蛋白PI3K、Akt、mTOR、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-ULK1、ULK1、Beclin1、p-Beclin1、p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白的表达。结果:MTT实验结果表明Telekin对胃癌细胞HGC-27具有较好的细胞毒活性和一定的选择性;透射电镜和激光共聚焦显微镜观察到Telekin诱导HGC-27细胞发生了明显的自噬和显著的自噬流变化;用Rapamycin预处理时增强了Telekin的细胞毒性,IC_(50)值由22.78μM降为14.4μM。用3-MA和CQ预处理后降低了Telekin的细胞毒性,IC_(50)值从22.78μM增加为30.06μM和29.46μM,说明自噬促进了细胞死亡;Western blot结果显示Telekin降低了p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p62、LC3Ⅰ的表达,增强了p-ULK1、p-Beclin1、LC3Ⅱ的表达,而对PI3K、Akt、mTOR、ULK1、Beclin1总蛋白没有明显影响。结论:Telekin通过降低p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p62、LC3Ⅰ的表达水平,增强p-ULK1、p-Beclin1、LC3Ⅱ的表达水平,来诱导HGC-27细胞发生自噬,从而促进细胞死亡。     

白藜芦醇联合顺铂对肺癌A549/DDP细胞的作用机制研究

目的基于PI3K/AKT/mTOR信号通路,以人非小细胞肺癌耐顺铂细胞株A549/DDP为研究对象,探讨白藜芦醇联合顺铂对A549/DDP细胞增殖、凋亡、自噬的影响。方法以CCK-8法检测白藜芦醇、顺铂以及两药联用对A549/DDP细胞增殖的影响,并通过Isobologram分析两药联用的协同作用;将A549/DDP细胞分为空白对照组、白藜芦醇组、顺铂组、白藜芦醇+顺铂组;以Hoechst 33342染色和Annexin V/PI双染实验检测细胞凋亡率;免疫荧光实验检测自噬标志物LC3的表达;Western Blot实验检测各组细胞中凋亡相关蛋白、自噬标志物蛋白、PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达。结果与顺铂组比较,白藜芦醇与顺铂两药联用可以明显降低顺铂对A549/DDP细胞的IC50,Isobologram分析结果也表明二者联用对A549/DDP细胞具有协同抑制作用;与空白对照组、白藜芦醇组、顺铂组3组比较,白藜芦醇和顺铂联用可以明显增加A549/DDP细胞凋亡率(P0.01),降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平(P0.01),上调凋亡蛋白Bax、Caspase 3表达水平(P0.01),及增加自噬标志物蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表达水平(P0.01),降低p62表达水平(P0.01);此外Western Bolt实验结果表明两药联用可以明显下调p-PI3K、p-AKT,p-mTOR蛋白表达水平(P0.01)。结论白藜芦醇与顺铂联用可通过PI3K/AKT/mTOR通路,促进A549/DDP细胞自噬诱导细胞凋亡。     

南蛇藤总萜诱导自噬抑制结直肠癌细胞增殖的实验研究

目的:探讨南蛇藤总萜(COE)是否通过诱导自噬来抑制结直肠癌细胞增殖。方法:用不同浓度的COE处理体外培养的大肠癌HT-29细胞,噻唑蓝(MTT)法检查细胞存活率,透射电镜(TEM)观察细胞形态,免疫印迹法(Western blot)检测COE对细胞自噬相关蛋白表达的影响,并采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)联合COE干预HT-29细胞,用吖啶橙染色细胞、MTT法检测3-MA对COE抑制HT-29细胞增殖的影响。结果:COE抑制HT-29细胞的增殖,作用24h的IC50为156μg/m L;随着COE浓度的升高,TEM示细胞中自噬体明显增多,和COE治疗组比较,COE联合3-MA组的细胞生存率升高,而自噬泡(AVO)的数量显著下降,微管相关蛋白-Ⅱ(LC3-Ⅱ)表达也降低。结论:COE可能通过上调Bcl-2同源结构域蛋白抗体-1(Beclin-1)和LC3-Ⅱ的表达来增加HT-29细胞的自噬活性,从而抑制HT-29细胞的增殖作用。     

补阳还五汤对局灶性脑缺血小鼠半暗带细胞自噬水平的影响

目的:观察补阳还五汤预处理对小鼠局灶性脑缺血后半暗带细胞自噬水平的影响,进一步探讨其神经保护的作用机制。方法:将80只C57BL/6小鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组、补阳还五汤+Rapamycin(Rapa)组、Rapa组及5%DMSO组,每组12只,分别给以Rapamycin腹腔注射诱导细胞自噬及补阳还五汤灌胃给药,预处理7d后采用大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)法复制小鼠脑缺血模型,造模后3h运用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色测定脑梗死体积,计算相对梗死体积,HE染色观察半暗带组织病理形态变化,Western blot法检测自噬标记性蛋白LC3-II/LC3-I比值及P62蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组相对梗死体积增加(P0.05),半暗带组织形态出现缺血后病理改变,LC3-II/LC3-I比值增加(P0.05),P62蛋白则表达减少(P0.05);与模型组比较,补阳还五汤组相对梗死体积减少(P0.05),半暗带组织病理形态明显改善,LC3-II/LC3-I比值减少(P0.05),同时P62表达增加(P0.05),而Rapa组则与补阳还五汤组相反(均P0.05),5%DMSO组无显著差异(P均0.05);与补阳还五汤组比较,补阳还五汤+Rapa组相对梗死体积增加(P0.05),半暗带组织病理形态恶化,LC3-II/LC3-I比值增加(P0.05),同时P62表达减少(P0.05)。结论:补阳还五汤可能通过抑制脑缺血后半暗带自噬水平,减轻局灶性脑缺血小鼠脑组织损伤,发挥神经保护作用。     

乙氧基血根碱靶向CIP2A抑制SGC7901/DDP细胞增殖及活化自噬的作用机制研究

该文旨在探讨乙氧基血根碱(ethoxysanguinarine, Eth)对顺铂(cisplatin, DDP)耐药的人胃癌细胞的影响及其机制。选用SGC7901和DDP耐药的人胃癌细胞系SGC7901/DDP作为细胞模型;Western blot检测多药耐药相关蛋白在SGC7901和SGC7901/DDP细胞的表达水平;MTT实验检测DDP对SGC7901细胞和SGC7901/DDP细胞增殖的抑制作用;用增加浓度的Eth处理SGC7901和SGC7901/DDP细胞后,通过MTT实验检测Eth对SGC7901和SGC7901/DDP细胞增殖的影响;通过台盼蓝拒染实验、克隆形成实验和共聚焦高内涵成像分析系统检测Eth对SGC7901/DDP细胞增殖能力的影响;DAPI染色、Anne-xin V-FITC/PI染色流式细胞术检测Eth对SGC7901/DDP细胞凋亡的影响;GFP-LC3转染实验检测Eth对SGC7901/DDP细胞自噬的影响;Western blot检测凋亡相关蛋白caspase-9、caspase-3和PARP的表达、自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达、多药耐药蛋白P-gp...     

牛膝总皂苷对大鼠椎间盘髓核细胞外基质合成的影响

目的探讨牛膝总皂苷(ABS)对大鼠椎间盘髓核细胞外基质合成的影响。方法体外培养大鼠椎间盘髓核细胞,并建立氧糖剥夺(OGD)模型模拟退变微环境。采用不同浓度ABS单独或加入SIRT1抑制剂EX527、自噬抑制剂3-MA干预细胞。CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,caspase-3试剂盒检测caspase-3活性,实时定量PCR检测细胞外基质collagen II、Aggrecan mRNA表达, Western blot检测SIRT1、collagen II、Aggrecan及自噬相关蛋白ATG5、LC3II/LC3Ⅰ和p62的蛋白表达。结果 ABS(40μg/mL)可促进大鼠椎间盘髓核细胞存活(P<0.01);ABS干预可使OGD环境中的细胞存活率增加,细胞凋亡、caspase-3活性降低,collagen II、Aggrecan mRNA和蛋白表达均上调,SIRT1、ATG5和LC3II/LC3Ⅰ蛋白表达上调,p62蛋白表达下调(P<0.05);EX527、3-MA干预可抑制OGD环境中ABS介导的细胞增殖增加、凋亡减少,collagen II和Aggrecan的蛋白表达上调(P<0.05)。结论 ABS可通过SIRT1/自噬信号通路促进大鼠椎间盘髓核细胞存活和细胞外基质合成。     

五虎汤对RSV诱导的哮喘小鼠模型树突细胞自噬和炎性因子IL-17A和IL-17F水平的影响

目的探讨五虎汤对呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)诱导的哮喘小鼠模型树突细胞自噬和炎性因子白细胞介素-17A(interleukin-17A,IL-17A)、白细胞介素-17F(interleukin-17F,IL-17F)的影响。方法采用RSV联合鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)建立哮喘小鼠模型,将小鼠随机分为对照组、模型组及五虎汤低、中、高剂量(1.6、3.2、6.4g/kg)组和地塞米松(1.82mg/kg)组、雷帕霉素(1mg/kg)组,连续给药14d后采用苏木-伊红(HE)染色法观察各组小鼠肺组织病理变化,电镜观察肺组织自噬小体变化,Westernblotting法检测肺组织树突细胞中微管相关蛋白轻链3I(microtubule-associated protein lightc hain 3I,LC3I)和LC3II表达,ELISA法检测肺泡灌洗液中IL-17A、IL-17F的水平。SD大鼠随机分为对照组及五虎汤低、中、高(1.1、2.2、4.4 g/kg)组,各给药组ig相应药物,2次/d,连续给药7 d后腹主动脉取血,离心取血清,灭活后滤过。将分离的树突细胞与CD4⁺T细胞共培养,采用RSV联合OVA-17肽建立RSV诱导的树突细胞自噬模型,流式细胞术检测五虎汤含药血清对CD4⁺T细胞增殖与T细胞活化标志物CD69表达的影响。结果模型组小鼠气道狭窄,血管周围有大量炎症细胞浸润,肺组织自噬小体增加,自噬蛋白LC3II/LC3I表达水平显著升高(P<0.01),IL-17A和IL-17F水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,五虎汤组肺组织炎症表现减轻,肺组织自噬小体增加,LC3II/LC3I蛋白表达水平显著升高(P<0.01),IL-17A和IL-17F水平显著降低(P<0.05、0.01)。RSV联合OVA-17肽诱导的树突细胞自噬模型中,与对照组比较,模型组CD4⁺T细胞增殖与CD69表达均显著升高(P<0.01);与模型组比较,五虎汤中、高剂量含药血清组CD4⁺T细胞增殖与CD69表达显著降低(P<0.05、0.01)。结论RSV可诱导小鼠肺组织树突细胞自噬水平升高,上调IL-17A和IL-17F水平,从而介导炎症反应;五虎汤可通过上调RSV诱导的哮喘小鼠肺组织树突细胞自噬水平,下调IL-17A和IL-17F水平,从而改善哮喘气道炎症。     

栝楼薤白半夏汤对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌自噬及凋亡的影响

目的:观察栝楼薤白半夏汤对心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)大鼠心肌自噬及凋亡的影响。方法:将40只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、3-MA干预组及栝楼薤白半夏汤组,采用可逆性冠脉左前降支结扎缺血30 min、再灌注2 h复制MI/RI模型。利用全自动生化仪检测血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)含量,采用Western blot法测定心肌自噬基因Beclin-1、LC3II及促凋亡蛋白Bax表达水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠血清CK、LDH含量与心肌Beclin-1、LC3 II、Bax蛋白表达及LC3 II/LC3I水平均显著升高,与模型组比较,栝楼薤白半夏汤组及3-MA干预组能降低血清CK、LDH含量,下调心肌Beclin-1、LC3 II、Bax蛋白表达及LC3 II/LC3I水平,且栝楼薤白半夏汤抑制Beclin-1表达作用优于3-MA干预组。结论:心肌缺血再灌注可引起自噬反应增强,促进凋亡损伤,栝楼薤白半夏汤通过抑制自噬、改善心肌细胞凋亡而起到心肌保护作用。     

姜黄素对人胃癌AGS细胞自噬流的作用

目的探讨姜黄素对人胃癌AGS细胞自噬流的作用。方法 5、10、20μmol/L浓度的姜黄素处理AGS细胞24 h,采用MTT法观察姜黄素对AGS胃癌细胞增殖的抑制作用,Western blot检测姜黄素对微管相关蛋白LC3和泛素相关蛋白SQSTM1/p62蛋白表达的影响。Western blot检测自噬抑制剂氯喹与姜黄素联合使用对LC3和SQSTM1/p62蛋白表达的影响。结果 MTT结果显示,姜黄素可以明显抑制AGS胃癌细胞的增殖,并且呈剂量依赖性(P0.05,P0.01)。Western blot结果显示,随着姜黄素浓度的增加,LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62蛋白的表达均呈剂量依赖地上调(P0.05,P0.01),提示姜黄素可以引起自噬体的堆积。自噬抑制剂氯喹与姜黄素联合使用可以增强LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62蛋白表达的上调,进一步验证了姜黄素对自噬流的抑制作用。结论姜黄素可能通过阻滞人AGS胃癌细胞自噬体降解,抑制AGS胃癌细胞的自噬流,促进AGS胃癌细胞的死亡。