血管内皮生长因子C及膜突蛋白促宫颈癌恶性进展的作用研究

 【目的】 研究宫颈癌恶变过程中血管内皮细胞生长因子C （vascular endothelial growth factor C, VEGF-C）及膜突蛋白 （moesin）的表达变化，并在培养的宫颈癌细胞中初步探讨VEGF-C对膜突蛋白的调控作用。【方法】利用临床上活体取材的不同临床分期的宫颈癌组织标本及正常对照宫颈组织，蛋白免疫印迹法检测VEGF-C及moesin蛋白的表达情况。体外培养宫颈癌细胞株Hela细胞，蛋白免疫印迹法测定VEGF-C对moesin蛋白的表达和磷酸化的调控作用。【结果】 随着宫颈癌临床分期的增高，VEGF-C、moesin蛋白及磷酸化moesin蛋白表达水平均随之增加。与正常宫颈组织比较，宫颈原位癌（CIN）组织中VEGF-C、moesin、磷酸化moesin蛋白表达分别增加了（45±9）％、（63±12）％、（74±16）％（P < 0.05）；宫颈鳞癌I期各蛋白增高幅度分别为（94±18）％、（104±27）％、（123±30）％（P< 0.01）；宫颈鳞癌Ⅱ期（未放疗化疗）各蛋白表达增高更为显著，其幅度分别为（186±24）％、（246±37）％、（194±28）％（P < 0.001）。在培养的宫颈癌细胞株HeLa细胞上，VEGF-C（100 ?g/L）处理24 h后，可显著增高moesin蛋白、磷酸化moesin蛋白的表达。VEGF-C单克隆抗体可抑制VEGF-C对moesin蛋白表达及磷酸化的上调作用。【结论】 VEGF-C、moesin蛋白表达与宫颈癌恶性程度密切相关，VEGF-C可能通过上调moesin表达及其磷酸化水平而促进宫颈癌的恶性进展。     

血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶-9在宫颈癌演进中与微血管密度的关系及其意义

目的探讨VEGF和MMP-9在宫颈癌的演进过程中其表达与局部微血管生成间及临床病理参数间的关系。方法采用免疫组化SP法检测40例宫颈浸润癌（ICC）、52例宫颈上皮内瘤样病变（CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ）和15例正常宫颈上皮（NCE）组织中VEGF和MMP-9的表达并检测其中微血管密度（MVD），分析VEGF和MMP-9在宫颈癌的演进过程中与MVD的关系。结果NCE、CIN及ICC组中MVD值分别为（12．31&#177;3．82）、（35．66&#177;6．35）和（48．19&#177;10．82），逐渐升高，各组比较差异有显著性（P〈0．01）。VEGF、MMP-9在NCE、CIN、ICC中的阳性表达率分别为0％、19．23％；67．50％、13、33％；42．31％、77．50％，逐渐升高，各组比较差异有显著性（P〈O．05）；在CIN和Icc中，当VEGF、MMP-9均呈阳性表达时，MVD值（50．33&#177;11．22），显著较VEGF、MMP-9均呈阴性表达时的MVD值（25．06&#177;7．63）高（P〈0．01）。VEGF和MMP-9的表达有正相关性（rs=0．284，P〈0．05）。结论微血管生成及VEGF、MMP-9参与宫颈癌发生、发展的全过程；VEGF及MMP-9在宫颈癌微血管生成中起正性调节及协同作用；MVD值升高提示宫颈癌侵袭转移潜能增加，VEGF、MMP-9可作为预测宫颈癌转移的生物学指标。     

rhG-CSF动员正常供者与恶性血液病患者外周血造血干细胞质量的比较

目的探讨正常供者与恶性血液病患者使用重组人粒细胞集落刺激因子（rhG—CSF）动员后,用血细胞分离机采集的外周血造血干细胞,通过形态学观察PBSC中淋巴细胞比例及单个核细胞活力。方法分别对15例正常供者和14例恶性血液病患者使用rhG—CSF动员剂,用血细胞分离机采集外周血中单核细胞（MNC）,观察有核细胞数、有核细胞分类、MNC计数及细胞活力。结果（1）正常供者组采集的PBSC有核细胞总数为（4．31&#177;1．41）&#215;10^8／kg,恶性血液病患者组有核细胞总数MNC数为（6．21&#177;4．37）&#215;10^8／kg。（2）恶性血液病组采集的PBSC有核细胞数高于供者组（P〈0．01）。（3）用淋巴细胞比值乘以有核细胞总数计算单个核细胞,正常供者组（2．82&#177;1．03）&#215;10^8／kg、恶性血液病患者组（2．58&#177;1．79）&#215;10^8／kg,正常供者组与恶性血液病组单个核细胞数比较差异无统计学意义（P〉0．05）。（4）正常供者组MNC计数为（96．7&#177;5．1）％,其中淋巴细胞占（65．9&#177;9．4）％、粒细胞占（16．3&#177;8．7）％、单核细胞占（16．5&#177;4．0）％;恶性血液病组MNC计数为（92．7&#177;15．6）％,其中淋巴细胞占（55．3&#177;16．7）％、粒细胞占（24．3&#177;16．5）％、单核细胞占（14．9&#177;9．1）％。（5）正常供者组冻存前后细胞活力分别为（91．5&#177;4．3）％、（67．4&#177;9．1）％,恶性血液病组冻存前后细胞活力分别为（82．9&#177;11．1）％、（56．5&#177;20．1）％;两组冻存前后细胞活力差异均有显著性（P〈0．01）。（6）rhG—CSF动员前后正常供者组及恶性血液病组T细胞在CD3单克隆抗体＋rhIL-2刺激下,外周血T淋巴细胞的增生能力在应用rhG—CSF后下降[（68．5&#177;15．1）％vs（52．3&#177;12．5）％（P〈0．05）。结论单用rhG—CSF或化疗联合rhG—CSF动员均可采集到足够数量的外周血造血干细胞,应用淋巴细胞乘以有核细胞数作为外周血造血于细胞移植时计算输入外周血造血干细胞数量的指标时简便、快捷,不失为一良好的临床检测方法。     

调控microRNA-99b表达对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的作用

【目的】探讨上调microRNA-99b（miR-99b）表达对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的作用及可能的机制。【方法】宫颈癌SiHa细胞分正常对照组、阴性对照组和miR-99b调控组。利用siPORT NeoFX Transfection Agent，阴性对照组细胞转染Cy3 dye labeled PremiR Negative Control，miR-99b调控组细胞转染Pre-miR-hsamiR-99b miRNA Precursor。实时定量PCR方法检测miR-99b表达，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blot检测靶基因细胞分裂周期25A（CDC25A）蛋白表达。【结果】实时定量PCR结果显示，miR-99b调控组细胞，miR-99b表达增加107．23倍。正常对照组、阴性对照组和miR-99b调控组细胞增殖率分别为（3．26&#177;0．44）％、（3．65&#177;0．47）％和（2．24&#177;0．45）％，细胞凋亡率分别为（8．12&#177;1．54）％、（8．75&#177;1．67）％和（14．26&#177;1．70）％，细胞CDC25A蛋白表达分别为0．50&#177;0．06、0．59&#177;0．05和0.31&#177;0．05。与正常对照组和阴性对照组比较，miR．99b调控组细胞增殖率、凋亡率和CDC25A蛋白表达差异均有统计学意义（P〈0．05）。【结论】上调miR-99b表达可通过降低靶基因CDC25A表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，miR-99b可能成为宫颈癌治疗的靶基因。     

伊贝沙坦对糖尿病大鼠肾氧化应激、NF-kB活性和ICAM-1 mRNA表达的影响

【目的】探讨伊贝沙坦对糖尿病大鼠肾脏氧化应激、NF—kB活性和ICAM-1mRNA表达水平的影响。【方法】将33只SD大鼠随机分为3组：正常对照组（C）、糖尿病组（D）和伊贝沙坦组（I）。糖尿病大鼠模型用链脲佐菌素诱导。大鼠饲养12周后,观察24h尿微量白蛋白排泄率（UAER）,取出肾脏作肾组织病理检查,测定肾组织中丙二醛（MDA）含量与超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱苷肽过氧化物酶（GSH—PX）活性变化。逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法检测肾组织中细胞间粘附因子-1（ICAM-1）mRNA的表达。凝胶电泳迁移率变动分析（EMSA）检测核因子（NF）-kB的活性。【结果】UAER在D组（3784-100）及I组（149&#177;58）均显著高于C组（30&#177;13）．P〈0．01;I组UAER较D组显著降低,P〈0．01。与C组大鼠比较,D组大鼠肾组织MDA含量显著增高（5．8&#177;0．9 vs 3．5&#177;0．2）,P〈0．01;SOD、CAT及GSH—PX活性均显著降低（22．3&#177;3．1,11,7&#177;0．7,11．3&#177;1．7vs39．2&#177;2．0,18．2&#177;0．5,23．2&#177;3．9）,P〈0．01;I组肾组织MDA含量（4．3&#177;0．6）明显低于D组．P〈0．01;SOD、CAT及GSH—PX活性（30．7&#177;1．6,13．3&#177;0．4,15．8&#177;2．8）明显高于D组,均P〈0．01。NF-kB活性在D组大鼠肾组织（44．3&#177;0．4）明显高于C组（14．6&#177;0．8）,P〈0．01;I组（37．7&#177;0．3）明显低于D组,P〈0．01。D组肾组织ICAM-1mRNA表达（2．14&#177;0．2）明显高于C组（0．36&#177;0．1）,P〈0．01;I组肾组织ICAM-1mRNA（1．37&#177;0．1）表达明显低于D组,P〈0．01。【结论】伊贝沙坦可能部分通过减轻氧化应激反应以及下调糖尿病大鼠肾组织中NF—kB的活性,降低ICAM-1mRNA的表达水平实现对糖尿病大鼠肾脏的保护作用。     

EphB4和EphrinB2 mRNA在子宫颈癌组织中的表达及其与血管生成的关系

目的检测EphB4和EphfinB2mRNA在子宫颈癌组织中的表达，探讨其在子宫颈癌发生、发展及血管生成过程中的作用。方法采用逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）法检测90例子宫颈癌、15例子宫颈上皮内瘤样病变（CIN）和15例正常宫颈组织中EphB4和EphrinB2mRNA的表达，同时利用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接（SP）法检测上述组织的微血管密度（MVD），分析EphB4和EphfinB2mRNA的表达与各种临床病理参教和血管生成的关系。结果尽管所有子宫颈组织中均可检测出EphB4和EphrinB2mRNA的表达，但是EphB4mRNA在子宫颈癌（125．59&#177;16．63）和CIN（122．61&#177;17．30）组织中的表达强度均高于其在正常宫颈组织中的表达（95．72&#177;4．63）（P均〈O．05）。EphfinB2mR．NA在子宫颈癌组织中的表达强度（111．11&#177;22．86）明显高于其在CIN（94．48&#177;6．30）和正常宫颈组织中的表达（93．56&#177;7．89）（P均〈O．05）。EphB4mRNA在子宫颈癌组织中的表达强度与子宫颈癌的临床分期和肿瘤直径密切相关（P均〈O．05）。EphdnB2mRNA在子宫颈癌组织中的表达强度只与子宫颈癌的肿瘤直径密切相关（P〈0．05）。正常宫颈组织、CIN和子宫颈癌组织中MVD逐渐增加，分别为（11．33&#177;2．38），（26．47&#177;7．47）和（42．97&#177;9．99）。子宫颈癌组织中EphB4和EphrinB2mRNA的表达均与MVD呈正相关。结论EphB4和EphfinB2在子宫颈癌的发生、发展及血管生成过程中可能起重要的作用。     

骨肉瘤端粒酶逆转录酶的表达及其临床意义

目的研究骨肉瘤中人端粒酶逆转录酶（hTERT）的表达,为分子免疫学方法治疗骨肉瘤提供基础。方法分别用免疫细胞／组织化学法检测人宫颈癌细胞株HeLa、人骨肉瘤细胞株U2－OS、MG－63、SAOS－2及15例骨肉瘤组织中hTERT表达及端粒酶活性状态。结果HeLa细胞hTERT表达率最高,为95．16％&#177;3．83％;MG-63、SAOS-2、U2-OS细胞系中hTERT阳性率分别为8．75％&#177;1．31％、5．26％&#177;1．22％、2．33％&#177;0．83％;骨肉瘤组织中hTERT表达阳性率26．7％（4／15）。结论hTERT在骨肉瘤的表达率相对较低,仍需用新的研究方法寻找其他分子免疫学治疗骨肉瘤的靶点。     

宫颈鳞癌中Syk、VEGF-C的表达及临床意义

目的研究宫颈鳞癌组织中脾酪氨酸激酶（Syk）、血管内皮生长因子-C（VEGF—C）的表达及意义。方法采用免疫组织化学EnvisionTM法检测66例宫颈鳞癌、20例CINⅢ、12例CINⅡ、12例CINⅠ和10例正常宫颈组织的Syk、VEGF—C蛋白的表达。结果子宫颈浸润性鳞癌中Syk的表达阳性率为56．1％,而正常宫颈、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢSyk的表达阳性率则分别为100％、100％、91．7％、80．0％。浸润性鳞癌、CINⅢ与正常宫颈比较,有显著性差异;浸润性鳞癌和各组比较,有显著性差异（P〈0．05或P〈0．01）。子宫颈鳞癌VEGF—C表达阳性率为68．2％,而正常宫颈、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ则分别为0、8．3％、41．7％、40．0％,浸润性鳞癌、CINⅢ、CINⅡ与正常宫颈比较,有显著性差异;浸润性鳞癌和各组比较,有显著性差异（P〈0．05或P〈0．01）。宫颈从正常到CIN、浸润性鳞癌的癌变过程中,Syk表达减弱,VEGF—C的表达增强,二者呈负相关（r=-0．584,P=0．000）。Syk和VEGF—C表达都与临床分期、淋巴结转移有关,差异有显著性。结论Syk表达减弱、VEGF—C的表达增强可能在子宫颈鳞癌发生、侵袭、转移过程中发挥促进作用。     

消化道双向分化肿瘤的血管生成拟态研究

目的 探讨在消化道双向分化恶性肿瘤中是否存在血管生成拟态（VM）。方法采用免疫组化和PAS染色技术研究消化道双向分化恶性肿瘤的血管生成模式,收集消化道双向分化恶性肿瘤111例,包括恶性胃肠间质瘤80例;恶性黑色素瘤18例;癌肉瘤13例。分别进行血管内皮生长因子（VEGF）、CD31及PAS染色,通过体视学网格计数法计算VEGF的表达量、显微图像分析仪下分别计算CD31和PAS阳性图案围成的管道面积即微血管密度（MVD）与VM密度（VMD）,根据三者的表达量研究VM并比较分析三者之间的关系以及与肿瘤恶性程度的关系。结果消化道双向分化恶性肿瘤有VM形成,其内存在红细胞,含有VM的肿瘤其VEGF表达（89±20）及MVD（47±12）均低于无VM者（126±18,78±13,均P〈0．05）;随着肿瘤恶性程度的增高,VM肿瘤的比例逐渐增高,VM肿瘤VEGF的表达、MVD、VMD均逐渐增高,上述指标在各肿瘤的低度恶性（45±19,15±8,38±25）与高度恶性（128±42,81±17,122±39）之间差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论 消化道双向分化恶性肿瘤细胞具有可塑性,存在VM。肿瘤细胞通过VM可进一步获得血液供应和血道转移。     

促酰化蛋白受体C5L2在前脂肪细胞分化过程和脂肪酸负荷下的表达研究

目的 观察3T3-L1前脂细胞分化和游离脂肪酸（FFA）对3T3-L1（前）脂肪细胞C5L2基因和蛋白表达的影响。方法采用逆转录（RT）-PCR和流式细胞仪检测不同分化时段和FFA处理后（前）脂肪细胞C5L2mRNA和蛋白表达。结果 3T3-L1脂肪细胞C512mRNA表达呈分化依赖性增加,而C5L2蛋白表达水平在分化早期显著增强,诱导分化6hC5L2蛋白表达增加了21％（61％±18％VS51％±15％,P〈0．05）;分化12h达高峰,增加了38％（70％±12％VS51％±15％,P〈0．01）;分化3d基本恢复至0d水平。在3T3-L1成熟脂肪细胞,0．5mmol／L和1．0mmol／L油酸分别抑制46％（0．58±0．21 vs 1．08±0．46,P〈0．05）和84％（0．18±0．04VS1．08±0．46,P〈0．05）C5L2 mRNA表达,而0．125mmol／L油酸即能显著下调36％（35％±8％vs54％±7％,P〈0．01）C5L2蛋白表达。低浓度棕榈酸均能明显抑制C5L2mRNA和蛋白的表达,1．0mmol／L时c512mRNA和蛋白表达分别减少了41％（0．57±0．28vs0．97±0．41,P〈0．05）和55％（24％±13％VS54％±7％,P〈0．01）。油酸和棕榈酸对前脂肪细胞C512表达差异无统计学意义。结论促酰化蛋白／C5L2途径参与了脂肪细胞分化的调控过程。C512mRNA和蛋白表达的下调可能参与了油酸和棕榈酸诱导的成熟脂肪细胞胰岛素抵抗的发生。