嗜肺军团菌荧光定量PCR法的建立和初步应用

目的建立嗜肺军团菌特异、快速检测方法,探讨南京地区公共场所环境水样嗜肺军团菌污染状况。方法根据嗜肺军团菌的mip基因保守序列设计引物和探针,通过对嗜肺军团菌标准株ATCC33152、嗜肺军团菌南京分离株及大肠埃希菌ATCC25922、鼠伤寒沙门菌ATCC14028、福氏2a志贺菌ATCC12022进行检测,验证该方法的特异性。并应用该法对南京地区某商场、宾馆、办公楼、医院共计13家的中央空调系统的冷却水、淋浴水和景观水共计88份环境水样进行了PCR检测及军团菌的分离培养。结果该法对嗜肺军团菌有特异性扩增曲线,而对其他细菌无阳性扩增曲线。88份水样中荧光定量PCR方法检测出28份阳性,阳性率为31.8%;传统培养方法分离出17株军团菌,分离率为19.3%。结论本文建立的荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性,可用于环境水中军团菌污染状况调查。南京地区中央空调冷却水中检出率最高,存在发生军团菌病的可能,应引起足够重视。     

中央空调系统嗜肺军团菌传统细菌培养与荧光PCR结果比较

目的中央空调系统嗜肺军团菌传统细菌培养与TaqMan荧光定量PCR检测结果比较。方法对9家商场、宾馆、医院、办公楼公共场所中央空调系统的冷却塔水、生物膜、淤泥三环节样本进行军团菌检测,用传统细菌分离培养法分离鉴定,并用TaqMan荧光定量PCR法加以验证。结果本次对9家单位的水冷式中央空调系统三环节采样18份,其中传统细菌培养法检出4份军团菌,检出率为22.2%;冷却塔水、生物膜、淤泥检出率分别为22.2%、25.0%、20.0%。用荧光PCR法检出9份,检出率为50.0%;冷却塔水、生物膜、淤泥检出率分别为44.4%、50.0%、60.0%。结论金华市中央空调系统中存在嗜肺军团菌,荧光PCR检出率高于传统细菌培养法。     

嗜肺军团菌荧光定量PCR检测

目的 建立特异、快速、敏感的TaqMan探针荧光定量PCR方法,用于检测嗜肺军团菌mip基因.方法 嗜肺军团菌及其他军团菌DNA模板来自中国疾病预防控制中心呼吸道室,嗜肺军团菌地方株及其他对照株由本中心菌种室供给.利用嗜肺军团菌mip基因保守序列设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量PCR反应条件和反应体系进行优化,并对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性等.结果 该方法在检测多株嗜肺军团菌时,均出现阳性信号,而对非嗜肺军团菌和其他细菌则未有阳性扩增结果出现.检测灵敏度达10个拷贝/反应,从菌株核酸的提取至检测完成仅需2 h左右,可减少常规PCR操作的污染机会.结论 TaqMan荧光定量PCR方法可定量检测嗜肺军团菌,具有特异性高、快速、敏感等特点,适于外环境污染源状况的调查及应急事件的快速定量检测.     

酶底物法定量检测嗜肺军团菌的应用研究

目的开展嗜肺军团菌检测新方法的应用研究,利用酶底物法定量检测技术应用于辖区公共场所不同水样的嗜肺军团菌检测中。方法 2018年—2021年收集辖区公共场所淋浴热水、水龙头水样以及集中空调冷凝水、冷却水样,采用酶底物法进行检测,对检出的阳性样本经细菌分离技术与TaqMan荧光定量PCR实验验证确认。结果应用酶底物定量检测法在336件水样中检出阳性样本81件,阳性率为24.1%。嗜肺军团菌计数结果在<1 MPN/100 ml～2 272.6 MPN/100 ml。对81件阳性样本经细菌分离培养、血清分型实验、荧光定量PCR实验加以验证确认,无假阳性,方法特异度为100%。结论通过应用酶底物法检测嗜肺军团菌,操作简便、结果快速、定量、灵敏,具有推广应用的价值。     

泰州市116份公共场所集中空调冷却水嗜肺军团菌监测结果

目的 为了解泰州市公共场所集中空调冷却水中嗜肺军团菌污染状况,为军团病的防控提供数据。方法 于2013-2015年采集了泰州市公共场所集中空调冷却水116份,进行了嗜肺军团菌分离培养,同时进行嗜肺军团菌核酸检测。结果 116份冷却水样本中26份分离培养出嗜肺军团菌,检出率为22.4%,荧光PCR法嗜肺军团菌核酸检测结果31份核酸阳性,检出率为26.7%。宾馆(饭店)、商场(超市)冷却水样中分离培养检出率分别为19.7%、27.5%,荧光PCR法嗜肺军团菌核酸阳性检出率分别为22.3%、35.0%。结论 泰州公共场所的集中空调冷却水嗜肺军团菌污染情况严重,已对长期在此环境下工作人群健康构成潜在威胁。     

传统细菌培养法与荧光PCR法分离公共场所嗜肺军团菌结果比较

目的：对公共场所环境样本（水、土壤、气溶胶）进行嗜肺军团菌监测,掌握南京市公共场所中军团菌的污染情况和菌型分布。方法：对12家商场、医院中央空调系统采集水样（冷却水、景观水、淋浴水、自来水）,土壤类样品（背景土、花卉土、风管积尘、景观土）,采用传统细菌培养法及荧光PCR法进行嗜肺军团菌的分离鉴定。结果：12家单位共采样234份（水样88份、土壤146份）,传统细菌培养法检出嗜肺军团菌9份（主要类型为Lp1型）,检出率为3.85%;而实时荧光PCR法检出47份阳性（主要类型为Lp1型）,检出率为20.08%。两者检出阳性率比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：南京市公共场所存在嗜肺军团菌污染,荧光PCR法总检出率明显高于传统细菌培养法,荧光PCR方法较培养法灵敏性较好。     

嗜肺军团菌环介导等温扩增快速检测方法的建立与应用

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测嗜肺军团菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(LAMP),针对嗜肺军团菌mip基因设计5条引物(2条内引物、2条外引物及1条环引物),并对LAMP反应条件和反应体系进行优化.为验证该方法的特异性、敏感性,针对种系背景明确的12株嗜肺军团菌实验对照菌株、45株嗜肺军团菌地方分离株、6株非嗜肺军团菌、11株其他细菌以及59份外环境水样本进行检测,并将其结果与传统培养分离方法及定量PCR方法比较.结果 所检测的菌株样本中不同血清型嗜肺军团菌经LAMP检测均呈绿色为阳性,非嗜肺军团菌及其他菌株检测均呈橙色为阴性.实验结果表明,LAMP方法的检出率高于传统培养分离方法及定量PCR.应用该方法从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右,该体系检测灵敏度为5 cfu/ml,而且其检测结果在日(灯)光下通过肉眼即可判断.结论 实验建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测嗜肺军团菌,适合基层检验部门及小型实验室与现场监测等使用.     

实时荧光定量PCR检测痰标本中军团菌属

目的建立荧光定量PCR方法,用于检测军团菌属特异性16S rRNA基因,并探讨广州地区军团菌属感染状况。方法利用军团菌属特异性16S rRNA基因保守序列设计引物和探针,优化反应条件和反应体系,对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性,对广东省中医院采集的532例肺部感染患者痰液标本进行检测。结果该方法检测军团菌属所有标准菌株均出现阳性信号,其他非军团菌属细菌检测结果均为阴性;检测灵敏度为102CFU/ml,临床检测532例肺部感染患者的痰液标本,荧光法检出军团菌阳性43例,阳性率为8.08%,16S rRNA PCR法加基因测序验证阳性率为7.71%,两者检测结果差异无统计学意义,表明其具有较好的符合性和等效性。结论 16S rRNA基因荧光定量PCR法检测患者痰液标本中军团菌属,具有快速、敏感、特异等特点,适用于临床军团菌属感染调查及快速检测。     

广东新会地区公共环境冷却塔水系军团菌污染状况调查

目的查明广东新会地区公共环境冷却塔水系军团菌分布状况,为预防和控制军团菌病暴发流行提供依据。方法自2004-2006年8～10月,在新会区各大宾馆、饭店、学校、医院和公共娱乐场所共采集中央空调冷却塔水样112份,进行军团菌分离培养和PCR快速鉴定。结果在新会区采集的112份公共环境中央空调冷却塔水样中分离培养检出嗜肺军团菌26株,检出率23.2%;PCR直接检测嗜肺军团菌(LP-DNA)阳性57份,阳性率50.9%。结论在广东新会地区环境水源中嗜肺军团菌污染具有普遍性,PCR检测嗜肺军团菌是一种快速、敏感、特异性良好的检测法。     

广东地区环境水源和临床标本嗜肺军团菌培养与基因快速鉴定

目的建立嗜肺军团菌培养与基因快速鉴定方法,探讨广东地区环境水源和非典型肺炎患者嗜肺军团菌感染状况。方法对广东地区采集的57份中央空调冷凝塔水、30份湖泊水和53份临床标本,用本室改良BCYE-α培养基作培养和PCR试验。结果57份中央空调冷凝塔水培养检出嗜肺军团菌20株(35.1%),PCR检测LP-DNA阳性38份(66.7%);30份湖泊水细菌培养均阴性,PCR阳性4份(13.3%);53例非典型肺炎患者支气管洗液和痰液细菌培养均阴性,PCR阳性5例(9.4%);本实验设计的PCR扩增引物,只和标准嗜肺军团菌和本地分离株产生反应;不与其他病原菌扩增,而显示其良好特异性;本PCR敏感性可检出检体中0.6个细菌DNA含量。结论广东地区环境水源中普遍存在嗜肺军团菌,是引起非典型肺炎的重要病源之一。     

实时荧光定量PCR在副溶血性弧菌食物中毒检测中的应用探讨

目的:应用荧光定量PCR方法快速筛检副溶血性弧菌等食物中毒病原菌,以提高检测速度,与GB培养法比较,探讨两法的符合性和应用价值。方法:采用高度特异、敏感的实时荧光PCR作为初筛方法,用GB方法进行细菌分离培养,用ATB对分离到的病原菌进行鉴定。结果:21份食物中毒病人大便标本实时荧光定量PCR检出副溶血性弧菌特异性DNA核酸阳性18份,GB细菌培养检出18株副溶血性弧菌,两法的阳性符合率一致,检出率均为85.71%。结论:能用实时荧光定量PCR检测食物中毒中的病原菌。与GB培养法相比明显缩短检测周期,报告检验结果及时率提高,达到快速、及时的目的,在食物中毒事件中能更及时查明病因,对临床治疗、流行病学调查和食物中毒处置发挥积极作用。     

公共场所集中空调水系统中嗜肺军团菌传统分离和PCR检测

目的了解江干区公共场所集中空调水系统中嗜肺军团菌的污染状况,比较传统分离和PCR 2种检测方法的检出率。方法依据WS 394—2012《公共场所集中空调通风系统卫生规范》对样品进行分离培养及鉴定;同时对样品进行荧光定量PCR检测。结果共采集20份样品,传统分离和PCR法洗脱液中嗜肺军团菌检出率分别为10.0%和45.0%,2种方法检出率差异有统计学意义(P0.05);冷却水中嗜肺军团菌检出率显著高于冷凝水;分离出38株嗜肺军团菌,其血清型以LP7和LP1为主,分别占44.7%和21.1%。结论本区集中空调水系统嗜肺军团菌污染较严重,应加强冷却水塔的规范清洗消毒。在嗜肺军团菌检测中,传统分离和PCR检测可根据需要结合使用。     

嗜肺军团菌荧光定量PCR检测方法的建立

目的：建立嗜肺军团菌mip基因荧光定量PCR检测方法。方法：利用Primer Express软件设计特异性引物和探针,对质粒标准品、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他菌株进行检测,验证方法的特异性、敏感性和重复性,最后采集环境样本进行检测。结果：该方法特异性好,嗜肺军团菌呈现阳性结果,而非嗜肺军团菌及其他菌株均为阴性结果。检测灵敏度达293copies／μl;重复性较好,Ct值变异系数较小;检测的12份环境样本中5份阳性。结论：该方法快速且具有较好的特异性、敏感性、重复性,适于外环境嗜肺军团菌污染调查及应急事件的快速检测。     

多重PCR快速检测空调冷却塔水中军团菌

目的 传统的方法分离培养军团菌，时间长，价格贵，培养较困难，本文建立多重PCR方法，快速检测空调冷却塔水中军团菌属和嗜肺军团菌种。方法 利用军团菌属保守基因片段16SrRNA和嗜肺军团型菌巨噬细胞感染增强因子（mip）基因序列的特异性引物，对空调冷却塔水样中分离的疑似军团菌株进行特异性扩增，并且为了增强敏感性，运用递减温度PCR扩增。结果：PCR扩增的阳性结果与生化培养和血清学鉴定为军团菌的菌株结果—致。结论：与传统的分离培养方法相比，多重PCR方法检测军团菌，快速敏感，成本低，具有较好的特异性。     

环境水中嗜肺军团菌分离培养与巢式PCR检测研究

] 目的应用分离培养法与巢式聚合酶链反应法(PCR)检测深圳环境水中军团菌最新污染状况.方法 于2012年9月-2012年11月采集商场、宾馆和综合性医院三类场所的中央空调冷却水、淋浴水、自来水、景观水,分别用传统分离培养法与巢式聚合酶链反应法(PCR)检测嗜肺军团菌。结果本次共检测环境水样171份,其中传统分离培养法检出64份嗜肺军团菌,巢式聚合酶链反应法(PCR)检出130份嗜肺军团菌,水样的阳性率分别为37.4%和76%;结论 深圳多种水源存在军团菌污染;巢式聚合酶链反应法(PCR)检出率高于传统分离培养法。     

烈性呼吸道细菌多重荧光PCR检测方法建立

目的 建立多重实时荧光PCR检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌的方法.方法设计分别针对炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌毒力因子基因和特异性结构基因的引物和荧光双标记探针,优化反应体系,建立2套均可同时检测3种细菌的多重实时荧光PCR方法,以及3种分别针对上述单一细菌的二重实时荧光定量PCR方法.结果构建的多重和二重实时荧光PCR方法,检测敏感性分别达到100模板拷贝每反应和20模板拷贝每反应,并且高浓度模板对低浓度模板的扩增检测干扰不明显,对阳性菌株均100％检出,对常见杆菌检测均为阴性.结论多重实时荧光定量PCR具有可以同时筛查、经济、快速、特异性强、灵敏度好等优点,在炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌的病原体检测方面有较大应用价值.     

应用PCR检测环境水体中的嗜肺军团菌

目的　建立检测Mip基因的PCR方法,以检出环境水体中的嗜肺军团菌。　方法　采用Godkey软件设计引物,制备菌种模块,对模拟和环境水样进行处理,然后作PCR扩增及其产物检测。　结果　该方法检测军团菌的灵敏度为5 .8×10 2 cfu/ml,6株标准军团菌均扩增出65 0bp的条带,4株非嗜肺军团菌和4株非军团菌无条带出现;检测71份环境水样,5份阳性,阳性率为7.0 %。　结论　该方法快速、灵敏、特异,为水体中的嗜肺军团菌检测提供了有效方法     

温州市部分公共场所集中空调冷却水军团菌污染状况

[目的]了解温州市公共场所集中空调冷却水中军团菌污染状况. [方法]分别于2010年、2011年共抽取温州市区30家公共场所[包括医院、宾馆(酒店)、超市(商场)]集中空调系统的冷却水126份.采用分离病原培养法及荧光定量聚合酶链反应(PCR)法进行军团菌检测. [结果]公共场所冷却塔水的军团菌检出率,2010年为62.50％,2011年为33.93％.共分离56株军团菌菌株,33株为嗜肺军团菌Lp1～15型,以Lp6、Lp1型为优势血清型,其中Lp6型占19.64％(11/56),Lp1型占17.86％(10/56),而且主要分布于医院检出的菌株中.荧光定量PCR法检测结果显示,56株军团菌16S rRNA均为阳性;且有35株mip基因检测阳性,阳性率为62.50％. [结论]温州市公共场所集中空调冷却水存在军团菌污染,以嗜肺军团菌LP6、LP1型为优势菌型.     

空气中嗜肺军团菌的巢式PCR和荧光定量PCR测定方法比较

目的评价巢式PCR和荧光定量PCR方法在嗜肺军团菌气溶胶检测中的应用。方法于2012年8—10月在北京、南京、苏州和深圳四城市选取38家公共场所,使用带有虚拟浓缩器的Bio-sampler生物冲击式采样器采集气溶胶样品,分别应用巢式PCR和荧光定量PCR法检测样品中的嗜肺军团菌。结果共采集气溶胶样品165份。巢式PCR法测定嗜肺军团菌的阳性率为8.5%(14/165),荧光定量PCR法测定嗜肺军团菌的阳性率为26.1%(43/165),后者高于前者,差异有统计学意义(P0.05)。结论采用荧光定量PCR法测定空气中嗜肺军团菌的灵敏度优于巢式PCR法。     

环介导技术在感染性腹泻沙门菌检测中的应用与研究

目的建立并应用环介导等温扩增法(LAMP)检测肠道门诊感染性腹泻中的沙门菌。方法通过在线软件Primer Explorer V5设计针对沙门菌的保守区引物,建立LAMP检测方法,采用荧光定量PCR法、LAMP法和分离培养法,对本院2015年肠道门诊137例患者的粪便标本进行检测。对建立的方法进行特异度、灵敏度试验,与荧光定量PCR法和培养法进行比对。结果 137份标本中,荧光定量PCR法检出28份阳性,LAMP法检出28份阳性,分离培养法检出23份阳性。3种方法的检测结果差异无统计学意义(P0.05)。LAMP对6株沙门菌属扩增的结果均为阳性,而对志贺菌等5株致病菌株扩增的结果均为阴性。LAMP检测方法具有良好的灵敏度和特异度。结论 LAMP检测方法灵敏特异,简单快速,比荧光定量PCR法更适用于基层疾病预防控制机构,有着较为广泛的发展前景。