利用pcDNA3．1／TOPO~TA克隆构建ANNEXIN A2基因的真核表达载体

目的克隆人类ANNEXIN A2基因,构建其正义真核表达质粒。方法采用逆转录聚合酶链式反应技术,从人类正常肺组织中扩增出人类ANNEXIN A2基因的完整编码区全长序列,通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3．1／TOPO(?)TA真核表达载体上,构建出人类ANNEXIN A2基因正义表达质粒。通过DNA 测序方法对重组表达质粒进行鉴定。结果通过测序分析证实,构建的重组表达质粒目的基因片段为人类 ANNEXIN A2基因的完整编码区1 032 bp。结论构建真核表达载体的方法快速简便,适于进一步研究基因的细胞生物学作用。     

利用pcDNA3.1/TOPO(R)TA克隆构建ANNEXIN A2基因的真核表达载体

目的克隆人类ANNEXIN A2基因,构建其正义真核表达质粒.方法采用逆转录聚合酶链式反应技术,从人类正常肺组织中扩增出人类ANNEXIN A2基因的完整编码区全长序列,通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3.1/TOPO(R)TA真核表达载体上,构建出人类ANNEXINA2基因正义表达质粒.通过DNA测序方法对重组表达质粒进行鉴定.结果通过测序分析证实,构建的重组表达质粒目的基因片段为人类ANNEXINA2基因的完整编码区1 032 bp.结论构建真核表达载体的方法快速简便,适于进一步研究基因的细胞生物学作用.     

IL-37b基因克隆及其真核的表达载体构建

目的 克隆IL-37b编码区基因,并构建其真核表达载体.方法 通过RT-PCR扩增IL-37b编码区基因,DNA测序鉴定后,将阳性克隆提取质粒,通过酶切连接将目的片段定向克隆至真核表达载体pcDNA 3.1,通过菌落PCR和DNA测序等进行鉴定.结果 凝胶电泳显示RT-PCR扩增出1条大小约650 bp特异条带,DNA测序结果显示获取了大小为654 bp的IL-37b编码区基因.PCR和DNA测序对所构建的真核表达载体鉴定结果表明IL-37b编码区基因正确插入真核表达载体pcDNA3.1.结论 成功克隆了IL-37b编码区基因,并成功构建其真核表达载体,为下一步IL-37b生物学作用的深入研究奠定了基础.     

人CCR7基因真核表达载体构建及表达

目的构建人CCR7基因真核表达质粒,使其在真核细胞中稳定表达,为其临床应用奠定基础。方法以RT—PCR法从临床肺腺癌标本中扩增出CCR7编码区序列,定向克隆至载体pEGFP—N1中构建质粒pEGFP—CCR7,采用脂质体介导的基因转染技术将重组质粒DNA导人肺腺癌A549细胞中,加入G418对细胞进行筛选获得稳定表达CCR7的细胞,并用流式细胞仪对重组质粒的表达进行鉴定。结果PCR、酶切及测序结果证明重组质粒pEGFP—CCR7构建正确,荧光显微镜及流式细胞术在稳定转染A549细胞中检测到人CCR7的表达。结论人CCR7基因真核表达质粒已成功构建并稳定转染肺癌A549细胞株;本研究为临床应用提供了实验依据。     

染色体脆性位点抑癌基因FHIT真核表达质粒的构建

目的构建人染色体脆性位点抑癌基因FHIT真核表达质粒。方法以通过全基因合成的FHIT cDNA为模版,用PCR技术扩增,扩增片段用BamHI/Xho I双酶切后克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,用DNA测序法鉴定重组质粒。结果质粒DNA测序显示与文献报道的人FHIT cDNA序列一致。结论成功构建出含人FHIT基因的真核表达质粒。     

家兔C型利钠肽基因的克隆及鉴定

目的克隆家兔C型利钠肽基因,为其真核表达载体的构建奠定基础。方法通过RT-PCR从家兔腹主动脉组织中克隆C型利钠肽基因全长编码区,将该DNA片段亚克隆至克隆载体pMD18-T中,用Pst Ⅰ单酶切筛选出负向插入片段,对重组质粒进行鉴定。结果PCR、酶切及测序鉴定证实,家兔C型利钠肽基因全长编码区被准确插入到载体pMD18-T的TA克隆位点中。结论成功克隆家兔c型利钠肽基因,为其真核表达载体的构建及开展糖尿病足C型利钠肽基因治疗奠定了基础。     

人肥大细胞类糜蛋白酶分泌型真核表达载体的构建

目的构建人肥大细胞类糜蛋白酶（MC—Chy）分泌型真核表达载体。方法以MC-Chy基因的质粒pDEST17／CMA为模板,通过PCR扩增出融合有免疫球蛋白K链信号肽的人MC—Chy基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA3．1,通过PCR、酶切和DNA测序鉴定。结果PCR扩增出免疫球蛋白K链融合人MC-Chy基因,DNA序列测定结果显示目的基因片段正确插入真核表达载体pcDNA3．1。结论成功构建了人MC-Chy分泌型真核表达载体,为下一步重组类糜蛋白酶的制备及其功能的深入研究奠定了基础。     

恶性疟原虫FCC-1/HN株环子孢子蛋白基因片段的亚克隆及表达

目的 构建恶性疟原虫FCC－1／HN株CSP基因的重组真核表达质粒pBK－CSP,在大肠杆菌中进行表达,并进行鉴定。方法 采用限制性内切酶法从重组的大肠杆菌－分枝杆菌穿梭质粒pBCG5.6/CSP中分离出经过测序鉴定的CSP基因片段,将其亚克隆于pBK－CMV真核表达载体,构建重组真核表达质粒pBK-CSP.经IPTG诱导,重组质粒在大肠杆菌DH5α中进行表达,并进行SDS－PAGE及免疫印迹分析。结果 从pBCG5.6/CSP中分离出SP基因片段,成功构建pBK-CSP重组质粒;SDS－PAGE及免疫印迹分析结果显示特异性蛋白条带的相对分子质量约为42000。结论 从pBCG5．6／CSP中成功分离出CSP基因片段,并成功构建pBK-CSP重组质粒,诱导表达CSP非融合蛋白,为恶性疟原虫DNA疫苗的研制奠定了基础。     

Mef2c真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的构建小鼠Mef2c基因真核表达质粒并转染HEK293T细胞。方法采用RT-PCR方法从小鼠心脏组织的总cDNA中扩增出小鼠的Mef2c的基因,采用基因重组技术将Mef2c的cDNA片段插入真核表达载体peD—NA3．1（＋）,构建小鼠Mef2c真核表达质粒,脂质体转染HEK293T细胞进行表达。结果酶切和测序结果证实Mef2c真核表达质粒构建成功,经脂质体转染293T细胞后,Western blot检测证明Mef2c蛋白在真核细胞中成功表达。结论成功构建真核表达质粒pcDNA3．1（＋）．Mef2c,为进一步研究小鼠Mef2c在心肌分化过程中的作用及其调控机制奠定了实验基础。     

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒构建

目的 构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（amastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。方法 提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pcDNA3.1（＋）,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。结果 扩增出大小约550bp的无鞭毛体蛋白基因;重组质粒pcDNA3.1-amastin经鉴定正确。结论 成功构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。     

乙型肝炎病毒X蛋白反式调节基因11剪切体的京核表达及蛋白纯化

目的克隆乙型肝炎病毒X蛋白反式调节基因11（XTP11）剪切体,构建其原核表达载体,表达并纯化该蛋白。方法应用逆转录聚合酶链反应及生物信息学技术从HepG2细胞中提取cDNA为模板并扩增,意外获得XTP11基因的剪切体基因,选用pGEM—T载体进行T—A克隆,通过限制性酶切分析及测序鉴定,再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a（＋）中,转化BL21（DE3）宿主菌,经异丙基-B—D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导XTP11剪切体融合蛋白的表达,表达产物进行SDS—PAGE分析,考马斯亮蓝染色,以鼠Hisprobe单克隆抗体进行Western blot分析鉴定证实表达蛋白的特异性,并纯化蛋白。结果成功扩增出XTP11剪切体基因,构建了pET-32a（＋）XTP11剪切体原核表达载体,经IPTG诱导获得了大小约为69kD的重组蛋白。结论发现的HBV XTP11剪切体及其融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

靶向Kus基因的串联短发夹状RNA表达系统对HepG2细胞中Ku70和Ku80的同时干预作用

目的在同一载体上串联针对不同靶基因的短发夹状RNA（shRNA）,探讨其同时干预不同靶基因的效应。方法在已筛选到高效干预靶基因Ku70、Ku80的shRNA表达载体的基础上,构建串联的shRNA表达载体psiRNAKus,该载体能同时表达针对Ku70的shRNA和针对Ku80的shRNA,酶切鉴定和DNA测序确定psiRNAKus构建成功后,将其转染入肝癌细胞株HepG2,转染后48 h提取细胞总RNA和蛋白质,RT-PCR和Western blot法检测其干预靶基因的效果。结果psiRNAKus表达的shRNAs能够同时抑制Ku70和Ku80在转录水平和翻译水平的表达。结论在同一载体上串联的针对不同靶基因的shRNA表达系统有望在实验和临床治疗中得到应用。     

霍乱弧菌毒素协同调节茵毛基因tcpA的克隆及序列分析

目的以新疆分离0139霍乱弧菌XJ93006株的DNA为模板，自行设计引物克隆毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因(包括侧序列)并构建重组载体。方法以0139霍乱弧菌新疆分离株XJ93006基因组DNA作为模板；根据0l群ElTor型霍乱弧菌N16961全基因组序列设计tcpA PCR引物，高保真酶扩增tcpA片段：限制性内切酶切PCR产物和pNEB193空质粒，T4DNA连接酶连接酶切产物，重组质粒转化大肠什菌TB1工程菌，蓝白斑菌落试验筛选阳性克隆；提取质粒经酶切鉴定后测序并利用生物信息数据库对该序列进行序列分析，比较.结果DNA限制性内切酶可从重组质粒pNEB193-tcpA的EcoRI和Sal I位点之间切出一个1037bp的DNA片段，测序结果与01群ETTor型霍乱弧菌N16961、O139霍乱弧菌标准株M045的tcpA同源性均达到99.9％以上。结论成功构建0139霍乱弧菌新疆分离株XJ93006毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因的重组质粒pNEB193-tcpA；序列分析表明霍乱弧菌毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因住01群ETTor型霍乱弧菌和0139霍乱弧菌中是一类高度保守的原核基因，可作为霍乱弧菌疫苗的候选基因。另外为研究0139霍乱弧菌的来源奠定基础。     

人巨细胞病毒UL97基因耐药重组株的构建与鉴定

目的 构建含UL97基因耐药相关突变的重组人巨细胞病毒(rHCMV),并通过耐药表型和基因型加以鉴定.方法 采用重叠延伸剪接PCR在UL97基因中引入Pine I位点和耐药相关位点做定点突变,将所获突变基因片段按比例与人巨细胞病毒(HCMV)AD169标准株DNA混合,经脂质体介导共转染成纤维细胞MRC-5.利用间接免疫荧光检测HCMV PP65抗原,证实MRC-5已被rHCMV感染,观察同源重组病毒形成的细胞病变达100%后收获该重组病毒.用不同浓度更昔洛韦进行噬斑筛选纯化目的 病毒,并通过噬斑减少试验和耐药基因(UL97和UL54)序列分析对重组病毒进行鉴定.结果 成功构建目的 突变UL97基因片段,同病毒基因组DNA共转染7 d后可见明显细胞病变,PP65抗原检测证实为rHCMV感染灶.经过克隆筛选得到的重组病毒株UL97基因型分析结果与预期一致,UL54基因测序未发现突变.阳性克隆重组病毒对更昔洛韦敏感性显示半数抑制浓度(IC50)为15 μmol/L,是标准株的12倍,具耐药表型.结论 成功将HCMV基因组DNA与耐药突变目的 基因片段共转染MRC-5细胞,通过更昔洛韦筛选和噬斑纯化获得目的 重组病毒株.该方法的建立为在用药过程中不断出现的新的HCMV耐药突变株的鉴定分析提供了有效的技术平台.     

EEF1A2基因对胰腺癌细胞生长和增殖的影响

目的 探讨EEF1 A2转基因对胰腺癌细胞SW1990生长和增殖的作用.方法 应用腺病毒载体将EEF1A2基因转染人胰腺癌细胞SW1990,采用MTT法检测细胞的增殖,软琼脂克隆形成试验检测细胞的生长,应用流式细胞仪检测细胞周期的变化.结果 带EEF1 A2的腺病毒感染SW1990细胞后,EEF1 A2 mRNA表达增加,72 h的A750值为1.2996±0.2091,培养6 d的细胞数为81250±1767,14 d的克隆形成率为82%,均较空载体腺病毒组和PBS组显著增加(P<0.05);G1期细胞比例为28.5%,S期细胞比例为60.9%,前者较空载体腺病毒组和PBS组显著减少,后者较空载体腺病毒组和PBS组显著增加(P<0.05).结论 EEF1 A2基因可以显著促进人胰腺癌细胞SW1990的生长和增殖.     

日本血吸虫大陆株粘蛋白样蛋白部分基因的克隆

目的构建日本血吸虫中国大陆株粘蛋白样蛋白(SjMLP)核酸疫苗。方法分子克隆常规操作将扩增产物 SjMLP 编码区基因序列克隆至载体 pUCm-T 中,然后亚克隆到真核表达载体 pcDNA3.1( )中。结果经酶切、PCR 及测序鉴定表明所构建的质粒 pUCm-T/SjMLP 和 pcDNA3.1( )/SjMLP 中含有所扩增的基因序列。结论成功地构建了含目的基因的真核表达质粒 pcDNA3.1( )/SjMLP,从而,为进一步对其进行 DNA 免疫系列研究工作奠定了基础。     

VEGF121和BMP2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及其在HEK293中的表达

目的构建人血管内皮生长因子121（VEGF121）与人骨形态发生蛋白2（BMP2）双基因共表达腺病毒载体Adv-BMP2-IRES-VEGF121,并观察其在人胚肾细胞株（HEK293）中的表达情况。方法对腺病毒质粒pShuttle-CMV-BMP2的目的基因BMP2进行PCR扩增。腺病毒质粒pShuttle-CMV-VEGF121-IRES-hrGFP-1经Kpn I/Xba I酶切后,将BMP2片段定向导入pShuttle-CMV-VEGF121-IRES,构建pShuttle-CMV-V EGF121-IRES-BMP2,并注入大肠杆菌DH5a中扩增,提取质粒。通过酶切分析、PCR检测和序列分析进行鉴定。将构建所得的质粒转染HEK293,采用RT-PCR法检测HEK293中的BMP2、VEGF121 mRNA,Western blot法检测其蛋白。结果成功构建了Adv-BMP2-IRES-VEGF121。酶切分析及DNA序列测定证实重组质粒构建正确。质粒转染后的HEK293 BMP2和VEGF121表达阳性。结论成功构建了Adv-BMP2-IRES-VEGF121,其转染HEK293后,VEGF121、BMP2在HEK293中共表达阳性。