GAD_(67)-GFP基因敲入小鼠脊髓背角GABA能神经元与不同5-HT受体亚型的共存研究

为初步探讨5-HT受体亚型对脊髓背角内抑制性GABA能神经元的介导作用,本研究以GAD67-GFP基因敲入小鼠为工具,利用免疫荧光双标记方法,检测了5-HT受体亚型与脊髓背角GABA能阳性神经元的共存情况。结果显示,GABA能阳性细胞与5-HT1A,5-HT2A和5-HT3等受体亚型共存,且共存率存在明显不同。以上结果提示5-HT受体各亚型在脊髓水平发挥不同的作用,从而参与完成5-HT复杂的生理效应。     

GAD67-GFP基因敲入小鼠三叉上核内向三叉神经运动核投射的GFP阳性神经元表达c-fos的研究

本文综合应用逆行束路追踪(将四甲基罗达明-TMR注入一侧三叉神经运动核)和免疫荧光组织化学三重标记技术,在激光共聚焦显微镜下对谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲入小鼠在口周部给予伤害性刺激时,三叉上核(Vsup)内向对侧三叉神经运动核(Vmo)投射的呈GFP阳性的GABA能神经元表达c-fos的情况进行了研究。结果显示:(1)Vsup内可观察到许多GFP阳性神经元,细胞较小;(2)也可观察到许多TMR或c-fos单标神经元较密集地分布于Vsup内,其中c-fos阳性产物只见于神经元的胞核,在胞浆内未见表达;(3)在激光共聚焦显微镜下可进一步观察到部分神经元同时呈GFP/TMR、TMR/c-fos、GFP/c-fos双重标记或GFP/TMR/c-fos三重标记。其中GFP/TMR双标神经元分别占GFP或TMR阳性神经元的17.8%和19.2%;TMR/c-fos双标神经元分别占TMR或c-fos阳性神经元的34.9%和31.3%;GFP/c-fos双标神经元分别占GFP或c-fos阳性神经元的21.2%和20.5%;而GFP/TMR/c-fos三标神经元分别占GFP、TMR或c-fos阳性神经元的11.1%、12%和10.8%。以上结果表明小鼠Vsup内部分GABA能神经元可接受来自同侧的口面部伤害性信息,并对这些信息进行整合后,直接发出投射纤维至Vmo;故Vsup内部分GABA能运动前神经元可能参与口面部伤害性反射局部环路的构成。     

GAD67-GFP基因敲入小鼠5-羟色胺样和P物质样阳性终末与三叉神经中脑核神经元的联系

本研究应用免疫荧光组织化学三重标记技术,在激光共聚焦显微镜下观察了GAD67-GFP基因敲入小鼠三叉神经中脑核(Vme)内5-HT样和P物质(substanceP,SP)样阳性终末分别与小白蛋白(parvalbumin,PV)样和GFP阳性神经元之间的联系。结果显示:(1)Vme内有较多的PV样阳性神经元,这些神经元绝大多数为大、中型的假单极神经元,直径约为18～40μm;也可观察到少量的GFP阳性神经元,多为小的多极神经元,直径约为8～15μm;(2)5-HT样阳性终末广泛分布于Vme内,其中有部分阳性终末分别聚集在PV样或GFP阳性的Vme神经元的胞体周围,计数结果表明:大约有77.7%和22.3%的5-HT样阳性终末分别与PV样或GFP阳性胞体相接触;(3)SP样阳性终末也广泛分布于Vme内,并分别与PV样或GFP阳性神经元的胞体形成密切接触,其中有78.2%和21.8%的阳性终末分别与PV样或GFP阳性胞体相接触。以上结果提示,在口面部本体感觉信息向更高一级中枢传递过程中,5-HT能和SP能神经终末不仅对初级传入发挥直接的调控作用,还可能通过影响Vme内的GABA能神经元的活动,从而间接对该信息的传递发挥调控作用。     

GAD67-GFP转基因小鼠三叉神经脊束核吻侧亚核和极间亚核内GABA和甘氨酸共存神经元的观察

本文以GAD67-GFP基因敲入小鼠为研究工具,利用免疫荧光组织化学双重染色技术观察了小鼠三叉神经脊束核(spi-nal trigeminalnucleus,V)的吻侧亚核(Vo)和极间亚核(Vi)神经元内谷氨酸脱羧酶67[GAD67,γ-氨基丁酸(GABA)能神经元的标识物质]和甘氨酸(glycine,Gly)的定位分布和共存情况。结果显示,在Vo和Vi内均有比较密集分布的GAD67和Gly阳性神经元。此外,在Vo和Vi内也可见一些GAD67阳性神经元同时呈Gly阳性反应,即存在GAD67/Gly双标神经元。结果表明,Vo和Vi内有GABA和Gly共存神经元,它们可能在初级传入信息的传递和调制中发挥重要作用。     

异丙酚诱导GAD_(67)-GFP基因敲入小鼠意识消失过程中GABA能神经元的活化

探讨在系统性给予谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲入小鼠异丙酚后诱导的意识消失作用中的GA-BA能神经元的活化情况。GAD67-GFP阳性小鼠20只,腹腔注射异丙酚130mg/kg(对照组腹腔注射相同体积的生理盐水)。分别在注射后5min,30min,1h进行行为学评分,随后立即处死并取脑,应用免疫组织化学观察神经元活化标记物Fos在全脑的表达分布并用免疫荧光双标的方法观察Fos与GABA能神经元的共存情况。行为学结果表明在给予异丙酚后5min和30min均能达到适度或深度麻醉效果,而1h时则处于过渡状态,行为学评分为5min时13分,30min时14分,1h时为9分。与对照组相比,Fos在海马CA1区、杏仁核、丘脑室旁核、下丘脑室旁核、梨状核、下丘脑腹内侧核、中脑导水管周围灰质的表达在三个时间点都有明显增加(P<0.05),在嗅球外丛状层有表达但与对照组相比无明显差异(P>0.05)。注射后5min、30min和1h下丘脑腹内侧核有Fos与GABA共存,有共存的细胞占该区域Fos阳性神经元的80.3%、89.7%和91.6%。下丘脑腹内侧核GABA能神经元活化是异丙酚诱导意识消失的可能机制之一。     

谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白基因敲入小鼠三叉神经尾侧亚核内GFP阳性神经元的分布及与小白蛋白的共存

目的观察谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白（GAD67-GFP）基因敲入小鼠三叉神经尾侧亚核（Vc）浅层内，表达GFP的GABA能神经元的分布及其与小白蛋白（PV）的共存。方法分别运用原位分子杂交与免疫组织化学相结合；GFP与神经元标记物——神经元核蛋白（NeuN）或PV免疫荧光染色相结合的双重标记方法，在光学显微镜和激光共聚焦显微镜下进行观察。结果1．Vc浅层内90％以上的GFP阳性神经元同时表达GAD67 mRNA，而几乎所有表达GAD67 mRNA的阳性神经元都呈GFP阳性；2．GFP阳性神经元主要分布于Ｖc的Ⅰ－Ⅱ层内，细胞较小，尤其在Ⅱ层内可见大量密集分布的GFP阳性细胞和突起。GFP阳性神经元分别占Ⅰ、Ⅱ层内NeuN阳性神经元总数的19．4％和24．3％；3．GFP／PV双标神经元主要分布于Ｖc的Ⅰ－Ⅱ层，这些双标神经元大约占PV阳性神经元的62．4％，占GFP阳性神经元的12．8％。结论在Ｖc表达GFP的GABA能神经元主要密集分布于与外周伤害性信息传递关系密切的板层内，且大部分PV样阳性神经元属于GABA能神经元。     

GAD67-GFP精神分裂症小鼠行为学改变及海马齿状回颗粒细胞层GABA能神经元的表达

目的:探讨谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲入小鼠制备精神分裂症模型后学习与记忆功能的改变及海马齿状回颗粒细胞层GABA能神经元的表达。方法:利用聚合酶链式反应(PCR)鉴定GAD67-GFP基因敲入小鼠,MK-801连续腹腔注射2周制备精神分裂症动物模型,通过悬尾实验、Morris水迷宫实验、免疫荧光标记技术等,观察GAD67-GFP基因敲入小鼠的学习与记忆功能的改变及GABA能神经元在海马齿状回颗粒细胞层的表达。结果:停药后实验组与对照组比较:(1)实验组体重增加明显低于对照组(P0.05);(2)行为学改变:1悬尾实验:实验组不动时间明显小于对照组(P0.05);2Morris水迷宫实验:定位航行实验中实验组逃避潜伏期,游泳总路程明显长于对照组(P0.05),而其平均游泳速度与对照组没有明显差异(P0.05);空间探查实验中实验组经过平台所在点的次数和在平台所在象限的时间明显小于对照组(P0.05);(3)在海马齿状回颗粒细胞层中实验组的GFP阳性细胞明显多于对照组(P0.05)。结论:通过对GAD67-GFP基因敲入小鼠进行腹腔注射MK-801制备精神分裂症模型后,其学习与记忆功能显著下降,且海马齿状回颗粒细胞层GABA能神经元明显增加。提示精神分裂症后学习记忆功能减退可能与GABA能神经元的表达有关。     

GAD67-GFP基因敲入小鼠黑质网状部神经元GABA与氯离子转运体KCC2和NKCC1的共存

为了观察谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲入小鼠黑质网状部(SNr)内,表达GFP的GABA能神经元与一对功能相反的Cl-共转运体(K+-Cl-cotransporter2,KCC2;Na+-K+-Cl-cotransporter1,NKCC1)的共存情况,本研究分别运用原位分子杂交与免疫组织化学相结合以及GFP与KCC2或NKCC1免疫荧光染色相结合的双重标记方法,在光学显微镜和激光共聚焦显微镜下同时进行观察。结果显示:(1)SNr内95%以上的GFP阳性神经元同时表达KCC2 mRNA,而50%表达KCC2 mRNA的阳性神经元呈GFP阳性;(2)SNr内80%以上的GFP阳性神经元同时表达NKCC1 mRNA,约35%表达NKCC1 mRNA的阳性神经元呈GFP阳性;(3)SNr内90%以上的GFP阳性神经元同时表达KCC2,双标神经元约占KCC2阳性神经元的50.5%;(4)SNr内80.5%以上的GFP阳性神经元同时表达NKCC1,双标神经元约占NKCC1阳性神经元的42.5%。以上结果表明,SNr内表达GFP的GABA能神经元大部分与KCC2和NKCC1共存,提示氯离子共转运体可能对SNr内GABA能神经元起重要的调控作用。     

APPswe转基因小鼠海马结构中谷氨酸和γ-氨基丁酸能神经元的数量变化

目的:探讨谷氨酸和γ-氨基丁酸在阿尔茨海默病(AD)发生、发展中的作用.方法:利用硫磺素S染色技术检测APPswe转基因小鼠脑内沉积的老年斑;免疫荧光技术标记正常及APPswe转基因小鼠海马发育过程中谷氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)阳性细胞. 结果: 模型组小鼠海马CA1、CA3区以及齿状回谷氨酸阳性细胞的数量明显少于正常对照组,而海马各区的GABA阳性细胞在两者之间变化不明显.结论: 谷氨酸与GABA能神经元数量的改变与Aβ诱导的神经元凋亡以及AD的病理发生有关.     

一种适用于冷冻切片的GAD67-GFP基因敲入小鼠鼠脑样本的制备技术

随着生命科学的发展,基于冷冻样本的连续切片和成像技术[1]已发展的较为成熟,多种数字化模型的建立均以该技术为基础,如数字人体[2,3],数字大鼠[4]等,我们可基于该技术对连续的鼠脑冷冻切片成像,得到数字鼠脑,从而探究鼠脑构造信息.     

质粒型单纯疱疹病毒载体介导GDNF和GFP基因在体外培养的BHK细胞和大鼠脊髓、背根节神经元中的转移和表达

为了观察质粒型单纯疱疹病毒载体介导的外源性胶质细胞源性神经营养因子和绿色荧光蛋白基因在体外培养的金黄地鼠肾细胞以及脊髓神经元和背根节神经元中的转移和表达 ,本研究采用了以质粒型单纯疱疹病毒载体为基础构建的分别含有重组胶质细胞源性神经营养因子和绿色荧光蛋白基因的混合毒株 dv HSV-GDNF和 dv HSV-GFP感染体外培养的金黄地鼠肾细胞、脊髓神经元和背根节神经元。用免疫组织化学方法和荧光显微镜观测法分别检测了胶质细胞源性神经营养因子和绿色荧光蛋白基因的转移和表达。结果发现 :质粒型单纯疱疹病毒载体可以成功地将外源性胶质细胞源性神经营养因子和绿色荧光蛋白基因导入金黄地鼠的肾细胞以及脊髓神经元和背根节神经元中。提示质粒型单纯疱疹病毒载体可以作为转基因胶质细胞源性营养因子治疗脊髓损伤的转移载体 ,为脊髓损伤的基因治疗提供了实验基础。绿色荧光蛋白作为报告基因 ,也可因其适用广泛、观察简便等特性而得到更加广泛的应用。     

挤压伤后脊髓神经元NGF表达的变化

本研究运用免疫组织化学 ABC法和灰度值测定探讨脊髓挤压伤后 NGF在脊髓腹角和背角神经元表达的早期变化。结果显示 :NGF主要分布于脊髓灰质神经元的胞核及胞浆 ;腹角阳性神经元数量在损伤后 2 1d组较正常组明显增多 (P<0 .0 1) ,而背角的阳性神经元在损伤后 2 4h、7d及 2 1d组均较正常组明显增多 (P<0 .0 1)。腹角和背角神经元的阳性灰度值在挤压伤后各组均较正常组显著降低 (P<0 .0 1)。提示 ,内源性 NGF增加对脊髓损伤修复具有重要作用     

细胞周期标记物在不同胚胎发育阶段小鼠脊髓内的分布模式

本研究用免疫组织化学方法观察了细胞周期全程标记物Ki-67和有丝分裂期标记物磷酸化的组蛋白H3(P-H3)在不同胚胎发育阶段小鼠脊髓的分布状况。结果显示:在胚胎第12d(E12)和E13,Ki-67标记细胞密集分布在脑室带(VZ)。E14以后,随着胎龄的增长,VZ内的Ki-67标记细胞逐渐减少,而套层内Ki-67阳性细胞的数量逐渐增多并于E17达到高峰。在此阶段,套层内Ki-67阳性细胞的数量占其阳性细胞总量的87.3%。在各胚胎阶段的脊髓内,VZ和套层内Ki-67阳性细胞的分布无背腹方向上的差异。P-H3标记细胞在胚胎发育阶段脊髓内分布的时空模式与Ki-67相似,其在套层内的分布同样于E17时达到高峰。另外,我们在E16之后的脊髓白质内还观察到了Ki-67和P-H3的标记细胞,以E18时数量最多。本研究结果提示,在胚胎发育晚期的脊髓套层内存在着具有增殖活性的神经祖细胞,它们可能是脊髓神经细胞产生的另外的来源。     

脊髓神经细胞培养中γ—氨基丁酸能神经元的形态特征

实验取小鼠１２￣１４天的胚胎脊髓进行常规分离细胞培养，然后做γ－氨基丁酸免疫细胞化学染色。结果表明：培养中的小鼠γ－氨基丁酸能神经元以圆形最为多见，其次为不规则形，椭圆形，梨形和三角形少见，就γ－氨基丁酸能神经元的突起形态而言可分为短突起和长突起。     

猕猴海马结构和皮质内AChE阳性纤维的分布及年龄变化

用组织化学方法，结合体视学测量研究ＡＣｈＥ阳性纤维在猕海马结构，内嗅区皮质和前额区皮质的分布和年龄变化。结果显示海马结构和皮质内ＡＣｈＥ阳性纤维呈不同的板层样分布，前者纤维密度明显高于内嗅区皮质和前额区皮质，被检各区的密度随年龄增加呈降低－升高－降低的动态变化趋势（２－６岁纤维密度降低，６－１４岁升高，１４－２４岁再降低）。表明ＡＣｈＥ阳性纤维在猕猴海马结构，内嗅区皮质和前额区质的分布具有年龄相关     

脊髓慢性受压后神经性一氧化氮合酶表达的变化

目的　探讨慢性脊髓压迫性损伤时 ,脊髓组织神经性一氧化氮合酶 (nNOS)免疫组织化学的变化及其与脊髓病理变化之间的关系。　方法　健康家兔 18只 ,随机分为正常对照组、实验对照组及实验组。实验组采用泛影葡胺囊逐级压迫复制慢性脊髓压迫动物模型 ,并持续逐级压迫脊髓 12周。取 3组家免相应脊髓节段 ,用Nissl染色观察脊髓的病理变化 ;用免疫组织化学方法对脊髓组织nNOS阳性运动神经元分布特点和nNOS含量变化进行分析。　结果　Nissl染色可见实验组脊髓压迫节段前角运动神经元损伤 ;实验组家免脊髓压迫节段前角nNOS阳性运动神经元较正常及实验对照组各个脊髓节段异常增加。　结论　在慢性脊髓压迫时 ,神经性NO合成增加