4种血清型登革病毒外膜蛋白重组抗原的表达

摘要 目的 在大肠杆菌中表达重组1－4型登革病毒外膜蛋白,为研制登革病毒抗体快速检测试剂提供原材料。方法 根据基因序列设计、合成引物并经PCR方法扩增1－4型登革病毒部分外膜蛋白基因片段,克隆至表达载体pET30a(+)并在大肠杆菌中诱导表达。小量表达以及纯化后的重组蛋白做SDS-PAGE分析并经WB实验验证其免疫活性。结果 酶切消化及电泳结果表明4种重组质粒均构建成功。经IPTG诱导后,4种重组大肠杆菌均可表达相应的重组蛋白。纯化前后的重组蛋白经WB实验表明,4种重组蛋白均能与对应型别的病毒感染者血清反应。结论 利用大肠杆菌表达系统,成功表达重组1－4型登革病毒外膜蛋白,4种型别的重组蛋白可被各自血清型的抗体结合,均具有免疫反应活性。     

钙网织蛋白重组腺病毒载体构建及体外表达

目的构建钙网织蛋白(CRT)基因重组腺病毒载体,并检测其在293LP细胞中的表达。方法根据Genbank中提供的CRT基因序列,设计并合成引物,以人乳腺癌组织cDNA文库为模板采用RT-PCR技术扩增人CRT基因片段,测序后将CRT基因片段定向克隆至pShuttle-CMV重组穿梭载体,进而将穿梭载体克隆至PacⅠ限制性内切酶线性化的腺病毒载体pAdxsi。结果重组穿梭载体pShuttle-CRT经EcoRI/KpnⅠ酶切鉴定连接成功。酶切穿梭载体将CRT片段克隆至腺病毒载体pAdxsi得到Ad-CRT,鉴定证实Ad-CRT载体构建成功。Ad-CRT转染293LP细胞并通过Western印迹法和Real-time PCR法证实其体外表达。结论成功构建CRT重组腺病毒载体Ad-CRT并证实其在293LP细胞中表达。     

人QKI6基因重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞中的表达鉴定

目的:构建人RNA结合蛋白（QKI6）基因的重组腺病毒载体,并在心肌细胞中表达。方法:利用PCR技术,从原始质粒中扩增出QKI6目的基因片段,酶切后连接到pShuttle-GFP-CMV重组穿梭质粒上。再将pShuttle-GFP-QKI6 转移到pAdxsi载体上,得到带有QKI6目的基因及GFP荧光指针的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6。酶切、PCR鉴定重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6,并完成扩增与纯化。经Pacl线性化后,转染HEK 293细胞进行腺病毒包装,并测定病毒的滴度及目的基因的表达。以包装好的重组腺病毒感染大鼠新生心肌细胞,通过GFP表达观察病毒感染效率。用PCR检测目的基因QKI6在感染的心肌细胞中的表达。结果:含QKI6基因及GFP荧光指针的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6构建成功,酶切、PCR鉴定及DNA测序证实了其正确性。重组腺病毒可重复感染HEK 293细胞,荧光显微镜下可见GFP表达,且QKI6基因的表达明显升高。包装的重组腺病毒可有效感染新生心肌细胞,并表达目的基因QKI6。结论:成功地构建QKI6基因重组腺病毒载体,以其感染293细胞及新生心肌细胞后,可有效地表达QKI6基因,为进一步研究QKI6基因在糖尿病心肌细胞凋亡的机制以及在糖尿病性心肌病治疗中的应用奠定实验基础。     

牛分枝杆菌ESAT-6-CFP-10融合基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建表达牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,为研制能有效防治牛结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础。方法以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到融合基因。将融合基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV中,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ESAT-6-CFP-10,限制性内切酶消化、菌液PCR、序列分析验证无误后,PmeⅠ酶切,转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAd-CMV-ESAT-6-CFP-10。PacI酶切线性化的重组质粒pAd-CMV-ES-AT-6-CFP-10转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。PCR、Western blot检测包装病毒的融合基因及其表达情况。结果成功构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,包装病毒用PCR、Western blot检测到包装病毒的融合基因及其表达。结论本研究成功地构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒,为下一步在动物体内进行免疫效果研究打下基础。     

hIFN-β基因重组腺病毒载体的构建

目的构建hIFN—β基因的腺病毒载体，为探索hIFN—β在肿瘤基因治疗中的作用作准备。方法从健康人外周血中提取出基因组DNA，pyrobest Taq酶PCR法扩增出hIFN—β基因片段。将目的基因克隆入中间载体pMD-18T载体，经蓝白筛选和PCR筛选后测序证实序列无误。酶切目的基因并将之克隆入穿梭载体pAdTrack—CMV中，将新形成的pAdTrack—CMV—hIFN—β用限制性内切酶Pme Ⅰ线性化，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌株BJ5183细胞中。卡那霉素及酶切筛选出重组子pAd—hIFN-β，内切酶pacⅠ再次将重组子线性化，脂质体转染细胞株HEK293。借助GFP的表达可以在转染的2—3天观察到包装病毒Ad—hIFN—β产生，7—10天出现病毒斑。结果经PCR法及酶切证实各中间过程载体，且最终的包装病毒中携带有目的基因hIFN—β。结论大肠杆菌内同源重组法能有效和较为方便的构建出含有目的基因的腺病毒载体Ad—hIFN—β，重组子能够在HEK293细胞中扩增，病毒包装的成功为进一步研究hIFN—β基因治疗肿瘤提供了一个良好的转导载体。     

表达呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的重组人5型腺病毒的构建

目的 筛选并构建成功表达A亚型人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus, HRSV)融合前构象F蛋白的重组人5型腺病毒(Recombinant Human type5 adenovirus, rHADV-5),为制备和研发HRSV重组腺病毒载体疫苗奠定基础。方法 在真核表达载体pcDNA3.1(+)上插入具有不同突变位点的HRSV F蛋白编码序列,利用融合前F蛋白单克隆抗体AM14和D25筛选HRSV F蛋白突变体;通过同源重组将筛选出的前构象F蛋白突变体编码序列插入非复制型人5型腺病毒载体,在HEK293细胞中进行重组病毒的包装和扩增,经氯化铯密度梯度法获得纯化的重组病毒;应用夹心ELISA法和Western blot鉴定F蛋白的表达及构象。结果 通过AM14和D25单克隆抗体筛选出了2个稳定维持在融和前构象的HRSV F蛋白序列(SC-3M和SC-5M)。将SC-3M和SC-5M编码序列插入非复制型人5型腺病毒载体,对两种重组人5型腺病毒(pAd5-SC-3M和pAd5-SC-5M)和空载体(pAd5-vector)纯化,病毒滴度分别达到...     

人肝细胞生长因子基因重组腺病毒载体的构建

目的:利用ADEASYTM系统,构建高效而又安全的肝细胞生长因子(HGF)基因腺病毒载体(AdHGF),以研究HGF基因在心脏内的表达。方法:从人胎肝中抽提总RNA,并以该肝细胞总RNA为模版,利用合成的1对引物,采用RTPCR技术获得HGF基因的cDNA,并引入酶切位点,先转入感受态质粒,再转化大肠杆菌进行扩增,筛选阳性菌落,经酶切及测序,证实目的HGF基因已经转入,再将该基因转入pUC18质粒,pUC18质粒与AdEASY质粒进行同源重组,用PacⅠ酶切成线性化DNA,利用脂质胺转染293细胞,经3轮扩増,制备高效表达并用绿色荧光标志AdHGF。并将该载体作实验组,与HGF组作比较,观察对VEC的抗凋亡作用。结果:在荧光显微镜发现293细胞发光率为100%,AdHGF的HGFcDNA经过测序鉴定与基因库序列一致。结论:AdHGF的成功构建,为冠心病转基因治疗的基础与临床研究奠定了基础。     

人Rob04基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建人Rob04（hRob04）基因的重组腺病毒表达载体,为研究Rob04的功能和作用机制以及Rob04的基因治疗奠定基础。方法采用DNA重组与细菌内同源重组技术,通过PCR方法以hRob04的表达质粒为模板扩增得到hRob04的编码序列,克隆到穿梭质粒pDC316-hRob04中,经测序验证后,将骨架质粒（pBHGlox_E1）和穿梭质粒共转染到HEK293细胞中,同源重组产生重组腺病毒;包装收获病毒颗粒;PCR鉴定该重组腺病毒是否携带目的基因。结果PCR及限制性内切酶酶切鉴定表明成功构建携带人Rob04基因的腺病毒载体。结论运用同源重组技术能够构建携带人Rob04基因的重组腺病毒载体。     

人肝细胞生长因子基因腺病毒重组体的构建及转染血管平滑肌细胞的表达

为探讨构建能表达肝细胞生长因子基因的腺病毒重组体的方法，以及这种腺病毒重组体能否在血管平滑肌细胞表达。将含有肝细胞生长因子基因片段的质粒用限制内切酶酶切，以琼脂糖凝胶电泳回收得到目的基因片段：将它用DNA连接酶插入至腺病毒穿梭质粒中，并用限制内切酶鉴别插入方向，得到插入方向正确的重组腺病毒穿梭质粒。用限制内切酶酶切重组腺病毒穿梭质粒和表达载体，使它们线性化；以电转化方法使它们共转化至BJ5183细胞中进行同源重组，构成肝细胞生长因子基因腺病毒重组体。以脂质体为转染介质，将肝细胞生长因子基因腺病毒重组体转染到人胚肾细胞中进行包装，使病毒复性具有感染能力。用包装后的肝细胞生长因子基因腺病毒重组体感染体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞；经逆转录一聚合酶链反应和蛋白印迹检测发现肝细胞生长因子呈现过表达。此外，酶切及测序发现重组腺病毒穿梭质粒和肝细胞生长因子基因腺病毒重组体是正确的；绿色荧光蛋白标记对重组体在人胚肾细胞中的包装及包装后感染大鼠主动脉平滑肌细胞进行了荧光示踪。结果提示，肝细胞生长因子基因腺病毒重组体构建成功，为血管疾病转基因治疗奠定了基础，具有一定临床价值，     

含Apoptin基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的:构建携凋亡素(Apoptin)基因重组腺病毒,为进一步研究Apoptin基因抗肿瘤作用分子机制建立基础.方法:利用BamH Ⅰ和Spe Ⅰ双酶切质粒pVAXl Apoptin,获得Apoptin片段并连接入pacAd5 CMV K-N pA,构建含Apoptin基因的穿梭质粒pacAd5-Apoptin.利用尸盘Pac Ⅰ单酶切对pacAd5-Apoptin和腺病毒基因组质粒(pAd5)进行线性化处理后应用脂质体介导法共转染AAV-293细胞,分别利用蚀斑纯化和RT-PCR、Westem blot等方法对重组病毒进行筛选和鉴定,并测定所获得重组病毒的滴度.结果:所构建重组腺病毒中的Apoptin基因得到了正确转录,表达产物的相对分子质量约为13 kDa,与CVA阳性对照一致;所获得重组腺病毒可有效表达Apoptin蛋白,该蛋白与CAV阳性血清具有反应原性,重组病毒滴度为1011PFU/L.结论:成功构建含Apoptin基因的重组腺病毒,所获得重组病毒的滴度可以满足体内外实验要求.     

Midkine启动子调控的HSV-TK基因重组腺病毒的构建

目的构建以人midkine（MK）启动子调控的TK基因的重组复制缺陷型腺病毒。方法以Adeno-XTM表达试剂盒为基础,应用分子克隆技术,将穿梭质粒pShuttle的CMV启动子替换为MK启动子,并将由pHSV-106获取HSV-TK基因的编码序列亚克隆至其下游,酶切鉴定阳性重组穿梭质粒pShuttle-MK-TK。通过I-CeuⅠ和PI-SceⅠ两个稀有酶切位点．将目的基因与腺病毒质粒DNA（pAdeno-X）进行体外连接,获得含目的基因的重组腺病毒质粒DNA,后者经限制性内切酶PacⅠ切割后,两端露出反向末端重复序列（ITR）,利用脂质体转染293细胞,获得含有目的基因重组腺病毒上清,PCR检测。结果酶切结果显示．MK启动子与TK基因均正向插入pShuttle中．TK位于MK启动子的下游。PCR检测显示重组腺病毒中含有MK启动子及TK基因片段。结论体外连接法可成功构建以人MK启动子调控的TK基因的重组腺病毒。     

肥胖MC4R重组腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建黑素皮质素受体-4（MC4R）重组腺病毒表达载体,为肥胖症的基因治疗研究奠定基础。方法 PCR扩增犬MC4R目的基因后与T载体连接,双酶切鉴定正确的T-A载体获得具有黏性末端的MC4R目的基因;将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,构建穿梭载体pShuttle-CMV/MC4R;PmeⅠ单酶切pshuttle-CMV/犬MC4R后,转化到含pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,采用细菌内同源重组法构建腺病毒载体pAdeasy-1/pshuttle-CMV/MC4R;筛选阳性克隆子;PacⅠ酶切鉴定。结果线性化的pShuttle-CMV/MC4R转化含pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,16 h后获得阳性克隆子,经PacⅠ酶切鉴定出一大于20 kb的大片段和3.0 kb的特征性片段,通过BglⅡ、XhoⅠ双酶切切下约1000 bp的片段,含MC4R目的基因的重组腺病毒载体构建成功。结论细菌内同源重组法可高效、快捷的制备含犬MC4R的重组腺病毒载体;该载体为人类肥胖症的基因治疗研究奠定了基础。     

XAF1基因重组腺病毒载体的构建及其在人肝癌细胞体内外的表达

目的利用携带35型腺病毒纤毛的嵌合型5型腺病毒载体系统Ad5/F35构建XAF1基因重组腺病毒,体内外感染人肝癌细胞SMMC7721并使XAF1基因有效表达。方法将真核表达质粒pcDNA3.1-XAF1和穿梭质粒pDC316用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切、筛选、测序获得重组穿梭质粒pDC316-XAF1。将测序正确的pDC316-XAF1和骨架质粒pBHG-fiber5/F35用Lipofectamine2000共转染HEK293细胞,进行细胞内同源重组,得到重组腺病毒Ad5/F35-XAF1。予终点稀释法测定重组腺病毒的感染滴度。用同样的方法得到携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的报告病毒Ad5/F35-EGFP。建立人肝癌细胞株SMMC7721裸鼠移植瘤模型,将Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-EGFP重组腺病毒分别感染人肝癌细胞株SMMC7721和瘤内注射;荧光显微镜观察EGFP在细胞和移植瘤冰冻切片中的表达;RT-PCR和Westrenblot法检测XAF1的mRNA和蛋白在细胞和移植瘤组织的表达。结果重组腺病毒Ad5/F35-EGFP感染肝癌细胞和瘤内注射后,予荧光显微镜均可见细胞和冰冻切片中呈现绿色荧光;Ad5/F35-XAF1感染肝癌细胞和瘤内注射后,XAF1mRNA和蛋白表达均显著高于对照组和报告病毒组。结论成功构建重组腺病毒Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-EGFP。该腺病毒载体可携带目的基因在人肝癌细胞株SMMC7721体内和体外进行有效表达。     

幽门螺杆菌Mr26000外膜蛋白真核载体的构建及表达蛋白的鉴定

目的　构建含人幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,H pylori) 2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因的真核重组载体 ,并在COS- 7细胞中表达 ,为核酸疫苗的开发奠定基础。方法　从原核表达质粒 pET32a(+) / 5 94中 ,酶切H pylori 2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因片段 ,将目的基因与同样进行酶切、纯化的载体pcDNA3 1进行连接 ,而后转化并筛选含有目的基因的重组载体pcDNA3 1/ 5 94 ,并在COS - 7细胞中表达 ,以RT -PCR ,Dotblot法检测其表达产物。 结果　经酶切证实插入的基因片段为H pylori 2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因 ;采用RT -PCR方法 ,能够从转染COS - 7细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段 ;同时Dotblot法等检测显示 ,该重组质粒能够在COS - 7细胞中表达目的蛋白。结论　成功地构建了真核重组载体 pcDNA3 1/ 5 94 ,并在COS - 7细胞中表达 ,为H pylori核酸疫苗的研制奠定了良好的基础。     

人胆固醇酯水解酶重组腺病毒载体的构建

目的构建人胆固醇酯水解酶（hCEH）基因重组腺病毒载体,并在人胚肾细胞（HEK293）中扩增。方法将hCEH基因整合入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-hCEH,线性化后与pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得含目的基因的重组质粒pAd-hCEH,酶切后用脂质体转染HEK293,包装成重组体腺病毒Ad-hCEH,经扩增和纯化得到高滴度重组病毒。采用PCR法进行鉴定,绿色荧光蛋白（GFP）追踪,荧光显微镜下观察并计算Ad-hCEH病毒滴度。结果重组穿梭质粒及其载体经鉴定后,电泳结果与预期相符。Ad-hCEH-EGFP感染HEK293后,随时间增加,HEK293表达绿色荧光的量也增加。hCEH碱基序列经测序与Genebank中已知序列完全吻合。Ad-hCEH电泳结果显示1 700 bp附近有一条带,与目的片段相符合。最终测得Ad-hCEH滴度为1.2×1010 pfu/ml。结论成功构建了携带hCEH基因的重组腺病毒载体。     

CXCR4-shRNA重组腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的选择性构建CXC趋化因子受体4（CXCR4）的特异RNA干扰载体。方法在GenBank中获取CXCR4基因的核苷酸序列,设计并合成3条短发夹RNA（shRNA）的DNA序列,并克隆到PL—Dest腺病毒骨架载体（shpAd／PL—Dest）中,组成人趋化因子受体重组腺病毒基因沉默子（shpAd—hCXCR4-eGFP）,采用酶切、PCR和DNA测序方法验证。将验证后3种沉默子经酶切后转染至HEK293A细胞包装病毒,得到CXCR4的腺病毒表达载体。结果构建的shRNA—Ad—hCXCR4-eGFP3种基因沉默子序列正确并成功克隆到腺病毒表达载体上。结论成功构建CXCR4-shRNA腺病毒表达载体。     

CARP基因重组腺病毒载体的构建

目的：利用Adeasy-1系统，构建并鉴定CARP基因重组腺病毒载体。方法：PCR扩增含有CARP全长cDNA的片段，经测序验证无误后，亚克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒，再与pAdEasy．1质粒在大肠杆菌BJ5 183中进行同源重组产生腺病毒载体质粒。经过抗性筛选以及酶切鉴定得到阳性的重组质粒，再在293细胞中进行包装扩增，利用Adeasy系统上的绿色荧光蛋白标签鉴定病毒表达。结果：测序证实PCR产物为CARP全长cDNA；抗性筛选及酶切鉴定均表明重组腺病毒载体构建成功；转染293细胞3天后可见绿色荧光，回收病毒可以重复感染293细胞，证明病毒包装成功。     

II型登革病毒NS1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

目的获得II型登革热病毒NS1基因并在昆虫细胞中表达,为进一步研发登革热血清学检测试剂盒提供抗原。方法RT-PCR扩增II型登革热病毒NS1基因并测序列,并定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBac-NS1。并将pFastBac-NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1。在脂质体介导下将rBacmid-NS1转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-NS1。rBV-NS1感染Sf9细胞后,通过SDS-PAG和Western blot检测NS1重组蛋白。结果成功克隆II型登革病毒NS1基因,SDS-PAGE、间接免疫荧光和Western blot检测表明NS1基因在昆虫细胞得到表达,能与登革患者血清发生特异性免疫反应,具有免疫原性。结论II型登革病毒非结构蛋白NS1在昆虫中表达,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定基础。     

TGF-β1重组腺病毒载体的快速构建及鉴定

目的应用简化的两步法细菌内同源重组高效制备TGF-β1基因重组腺病毒载体,为下一步的基因治疗奠定基础。方法应用PCR技术扩增TGF-β1-pcDNA3.1质粒中的目的基因片段,将TGF-β1目的基因片段定向克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,转化DH5a感受态细胞,用卡那霉素平板筛选阳性克隆,提取质粒,将酶切鉴定正确的质粒用PmeI线性化后采用两步法同源重组:先将pAdEasy-1转化入BJ5183细菌中,制备pAdEasy-1-BJ5183感受态细胞,再将PmeI线性化的pAdTrack-CMV-TGF-β1转入其中,进行同源重组,用卡那霉素平板筛选小的阳性克隆,提取质粒,酶切或PCR鉴定。结果经酶切,PCR鉴定成功构建了TGF-β1重组腺病毒载体。结论运用简化的两步法细菌内同源重组可以在大肠杆菌中快速高效地构建重组腺病毒载体。