孤啡肽联合阿霉素逆转K562/ADM细胞多药耐药及其分子机制研究

本实验室已研究证实,在细胞水平孤啡肽(OFQ)单独用药可逆转K562/ADM细胞多药耐药。本研究目的是探索OFQ联合阿霉素(ADM)逆转K562/ADM细胞多药耐药的分子机制及其与MDR1 mRNA/P-gp表达的相关性。MTT法检测OFQ和ADM单药及两者联合后对K562/ADM细胞增殖能力的影响,流式细胞术检测细胞凋亡率,实时荧光定量PCR检测MDR1 mRNA表达水平,Western blot检测P-gp的相对表达量。结果显示,OFQ(0.1μmol/L)联合ADM(15 mg/L)后细胞增殖抑制率增加,与ADM组比较,48 h数据具有统计学意义(P<0.05),细胞凋亡率显著提高(P<0.01);OFQ联合ADM作用于细胞后MDR1 mRNA/P-gp表达水平明显低于ADM单独用药组(P<0.01),且MDR1 mRNA(r=0.91)及P-gp(r=0.98)表达水平在48 h内呈时间依赖性。结论:OFQ联合ADM可时间依赖性的逆转K562/ADM细胞多药耐药性,48 h为最佳逆转时间,逆转机制与下调MDR1 mRNA和P-gp的表达量相关。     

K562细胞多重耐药机制的实验研究

目的探讨K562细胞多重耐药性形成的分子机制。方法采用MTT法分别测定K562及阿霉素耐药的K562细胞对顺铂的耐药程度，采用RT-PCR检测细胞表面MDR、MRP、GST及MGMT分子表达水平，并确定其与耐药性的关系。结果顺铂对K562细胞的抑制率明显高于阿霉索耐药的K562细胞，同时阿霉素耐药的K562细胞的表面MDR、MRP、GST及MGMT的表达明显增高。结论MDR、MRP、GST及MGMT的高表达是K562细胞形成多重耐药性的重要机制之一。     

汉防己甲素、托瑞米芬及其联合应用逆转K562/A02细胞多药耐药的研究

本研究探讨汉防己甲素（Tet）、雌激素受体抑制剂托瑞米芬（Tor）及其联合应用对K562/A02细胞多药耐药的逆转作用。采用噻唑蓝法（MTT）测定阿霉素（ADR）的半数抑制量,RT-PCR法检测MDR1基因mRNA表达水平,FCM检测P-gp的表达和细胞内ADR浓度。结果表明：ADR对K562/A02和K562细胞的IC50分别为57.43和1.16mg/L,Tet（1μmol/L）和Tor（2.5μmol/L）单用及两药联用处理K562/A02细胞时,ADR的IC50值分别为14.12,20.74和9.14mg/L。Tet及Tor单独作用后耐药株MDR1 mRNA下调微弱,联合用药下调效果明显。Tet及Tor均可降低P-gp蛋白的表达,且具有协同作用。Tet及Tor作用后细胞内ADR浓度增加,两药联合作用时效果增强。结论：Tet及Tor均可逆转K562/A02细胞多药耐药,联合作用时效果增强。     

汉防己甲素与5-溴汉防己甲素逆转耐药机制与降低MRP7表达水平有关(英文)

本研究的目的是探索汉防己甲素(Tet)与5-溴汉防己甲素(BrTet)逆转耐药的机制是否与调节多药耐药相关蛋白7(MRP7)表达水平有关。采用MTT法检测柔红霉素(DNR)对人白血病敏感细胞株K562与人白血病耐药细胞株K562/A02细胞增殖的抑制作用,计算半数抑制浓度(IC50)及耐药倍数。将细胞分组,加入BrTet、Tet,用实时PCR法检测细胞MRP7 mRNA表达,Western bolt法检测细胞MRP7蛋白和P-糖蛋白(P-gp)的表达,流式细胞术检测细胞内DNR蓄积。结果表明:K562/A02对DNR的耐药倍数为23.65倍。分别加入1μmol/L Tet与2.0μmol/L BrTet后,K562/A02细胞的MRP7 mRNA相对表达水平分别降低至2%和12%,MRP7蛋白表达降低了53.2%与83.7%,P-gp表达分别下调58.47%与52.20%;1.0μmol/L Tet与2.0μmol/L BrTet分别使K562/A02细胞内DNR提高了94.32%与271%。结论:BrTet与Tet均可逆转耐药,其逆转机制除了抑制P-gp的表达之外,还可能与抑制MRP7的表达,增加肿瘤细胞内抗肿瘤药物浓度有关。在相同摩尔浓度下,Tet与BrTet对MRP7表达的下调作用无显著性差异。     

低氧诱导因子-1α抑制剂逆转K562/A02细胞多药耐药机制研究

目的 探讨低氧诱导因子抑制剂3-(5'-Hydroxymethyl-2'-furyl)-1-benzylindazoh(YC-1)对人白血病耐阿霉素细胞K562/A02的耐药逆转作用,并探讨逆转机制.方法 采用MTT法检测不同浓度YC-1和阿霉素(ADM)单独或联合使用48 h对K562/A02细胞和K562细胞增值抑制效应及耐药逆转效应;用流式细胞术检测0、5、10和20 μmol/L YC-1单独或联合1 mg/L阿霉素作用K562/A02细胞48 h后细胞凋亡率及联合应用后细胞内阿霉素浓度;半定量RT-PCR检测各组细胞低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、mdr1基因mRNA表达变化;Western blot方法检测各组细胞HIF-1α、P-糖蛋白(P-gp)表达变化.结果 K562与K562/A02细胞对阿霉素的IC50值分别为(1.56±0.07)mg/L和(42.98±3.15)mg/L,耐药倍数为27.55倍.予5、10和20μmol/L YC-1作用后,K562/A02细胞对阿霉素的耐药倍数分别为24.63、16.38和10.71倍;0、5、10和20μmol/L YC-1单独或联合1 mg/L阿霉素处理K562/A02细胞48 h后,凋亡率分别为(1.9±0.9)%、(4.9±0.9)%、(5.8±1.1)%和(9.3±1.4)%与(2.3±0.7)%、(8.2±1.2)%、(19.0±1.7)%和(34.5 ±2.4)%.0、5、10和20 μmol/L YC1联合1 mg/L阿霉素处理K562/A02细胞48 h后细胞内阿霉素荧光强度分别为232±33、1300±219、1961±240和3342±269;随着YC-1浓度增加,HIF-1α mRNA表达没有明显差异,mdr1 mRNA逐渐下调,HIF-1±和P-gp表达均下调.结论 YC-1可以通过抑制HIF-1α蛋白表达,下调mdr1 mRNA水平和P-gp水平,增加细胞内阿霉素药物浓度,部分逆转K562/A02细胞耐药.     

细胞因子诱导杀伤细胞联合阿霉素逆转人红白血病耐药细胞株K562/ADR的研究

目的 探讨细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞与阿霉素对肿瘤多药耐药逆转作用的影响.方法 体外诱导、扩增人外周血单个核细胞(PBMC)作为效应细胞,联合不同浓度的阿霉素与其耐药靶细胞K562/ADR进行共培养,经四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法计算半数抑制浓度(IC50)、耐药倍数和逆转倍数;流式细胞仪检测细胞内阿霉素相对含量和P糖蛋白(Pgp)表达水平;RT-PCR检测mdr-1基因mRNA表达.结果 阿霉素对K562和K562/ADR的IC50分别为(0.68±0.04)μmol/L和(66.23±4.38)μmol/L;K562/ADR对阿霉素的耐药倍数为97.43倍;经CIK细胞联合阿霉素处理48 h(效靶比1:5、ADR 1.1 μmol/L)后,IC50为(32.15±0.79)μmol/L,联合逆转倍数为2.06倍.细胞内的阿霉素相对含量增加的同时Pgp表达降低.mdr-1基因mRNA相对表达值也呈下调趋势.结论 CIK细胞联合阿霉素可增加化疗药物阿霉素对耐药靶细胞K562/ADR的敏感性,提高耐药靶细胞内的阿霉素浓度,有效下调mdr-1基因及Pgp的表达,使CIK联合阿霉素对多药耐药的逆转效果得以显现.     

应用蛋白质芯片对汉防己甲素单用及与屈洛昔芬伍用逆转白血病细胞耐药机理的研究

本研究的目的是应用蛋白质芯片检测汉防己甲素(Tet)单独及与屈洛昔芬(Drol)伍用对作用的白血病细胞表面的耐药蛋白,包括P糖蛋白(Pgp)、多药耐药相关蛋白(MRP1)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)表达的作用,为逆转剂的临床应用提供理论依据。选择位于膜表面Pgp、MRP1、BCRP耐药蛋白及其相应的抗体为研究体系,制备蛋白芯片,直接对逆转剂作用12、24和48小时的K562/A02细胞进行检测。结果表明:Tet和Drol联合作用24小时时检测到Pgp表达下调(Tet Drol组:85.27±3.095,对照组:93.67±2.748,P<0.05)。经逆转剂单独及联合作用K562/A02细胞48小时时均检测到Pgp表达下调,且联合应用两药对Pgp表达下调作用明显(Tet Drol:82.62±3.227,Tet:86.44±2.906,Drol:87.23±2.049,对照组:93.67±2.748,P<0.05)。检测结果与流式细胞仪检测结果一致。结论:逆转剂Tet和Drol对K562/A02细胞的Pgp下调呈时间依赖性。联合作用24小时时出现下调Pgp表达,单独作用48小时均下调Pgp表达,联合用药时下调作用明显。不同检测时间均未见下调MRP1和BCRP的表达。     

汉防己甲素联合柔红霉素对K562／A02细胞株P21蛋白和P糖蛋白表达的影响

本研究旨在探讨汉防己甲素（TET）对人慢性髓系白血病（CML）急性红白血病细胞株K562／A02多药耐药的逆转作用,及其逆转耐药与细胞周期依赖性激酶抑制因子（p21）、P糖蛋白（P—gp）及其基因的关系,为TET的临床应用提供新的理论基础。K562／A02细胞实验分组为：①单用柔红霉素（DNR）对照组;②DNR＋TET0．5mg／L组;⑧DNR＋TET1．0mg/L组;④DNR＋TET2．0m8／／L组。采用Western blot法检测实验各组K562／A02细胞P21的表达。采用流式细胞仪（FCM）检测实验各组细胞P—gp的表达,采用半定量PCR（RT—PCR）测定细胞MDR1基因mRNA表达水平。结果表明：K562／A02细胞中P21蛋白的表达随着TET浓度的增加而增强,P—gp蛋白的表达随着TET浓度的增加而减低。K562细胞中mdr1基因几乎无表达,K562／A02细胞中mdrl基因高表达,随着TET浓度的增加K562／A02细胞mdrl基因表达不断降低。结论：TET对K562／A02耐药具有逆转作用且呈浓度依赖性,其逆转耐药可能与其上调P21蛋白的表达、下调mdrl及P—gp的表达有关,     

米非司酮逆转K562/A02细胞多药耐药的研究

目的研究孕激素拮抗剂米非司酮对白血病多药耐药细胞K562／A02的逆转作用及其机制。方法MTT法检测米非司酮作用72h后K562／A02细胞增殖及其对阿霉素杀伤敏感性的变化；流式细胞术检测米非司酮作用前后K562／A02细胞表面P糖蛋白的表达和细胞内柔红霉素的浓度；免疫组化法观察米非司酮作用前后K562／A02细胞凋亡相关蛋白bcl-2、Bax、caspase-3的表达；RT—PCR检测米非司酮作用后对K562／A02细胞内葡萄糖神经酰胺合成酶（GcS）mRNA表达的影响。结果2．5、5．0和10．0μmol／L米非司酮不抑制K562／A02细胞的增殖，但上述浓度的米非司酮作用后K562／A02细胞对阿霉素的敏感性较前分别增强了1．68、4．17和10．71倍。K562／A02细胞表面P糖蛋白的表达为（49．03±5．32）％，10μmol／L米非司酮作用72h后降低到（28．60±2．13）％（P〈0．01）；K562／A02细胞内柔红霉素的浓度为（61．07±8．61）％，而10μmol／L米非司酮作用后升高到（92．72±3．48）％（P〈0．01）。经10μmol／L米非司酮作用后，bcl-2蛋白表达由（56±9）％降低到（37±6）％（P〈0．05）；Bax蛋白由（40±5）％升高到（87±10）％（P〈0．01）；caspase-3蛋白则由（36±7）％升高到（89±6）％（P〈0．01）。RT—PCR结果显示K562／A02细胞GcS mRNA的表达较K562细胞明显升高，10μmol／L米非司酮能明显降低K562／A02细胞内GcS mRNA的表达。结论米非司酮可逆转白血病K562／A02细胞的多药耐药，且具有剂量依赖性。10μmol／L米非司酮能明显逆转白血病K562／A02细胞的多药耐药，其机制与降低P糖蛋白的水平，调节凋亡相关蛋白bcl-2、Bax、caspase-3的表达，降低GcS mRNA有关。     

雷公藤甲素对K562/A02细胞阿霉素敏感性的影响

本研究旨在探讨雷公藤甲素(TPL)对K562/A02细胞阿霉素敏感性的影响。采用MTT法检测TPL细胞毒性和阿霉素药物敏感性;流式细胞术检测P-糖蛋白表达和细胞内阿霉素浓度;双荧光素酶报告基因系统检测MDR1启动子活性。结果表明:TPL增强K562/A02细胞阿霉素敏感性。TPL作用后,K562/A02细胞P-糖蛋白表达相关平均荧光强度(MFI)由123±13下降到39±13(P<0.05);K562/A02细胞内阿霉素相关MFI由18±5上升到34±6(P<0.05),TPL能够有效抑制K562/A02细胞的药物外排。TPL降低MDR1启动子转录活性约75%。结论:TPL通过下调P-糖蛋白表达增强K562/A02细胞对阿霉素的敏感性,其有可能成为一种耐药逆转剂。     

甲诺孕酮和屈洛昔芬对K562/A02细胞株多种耐药机制的调节

目的研究甲诺孕酮（ＮＯＭ）和屈洛昔芬（ＤＲＯ）对Ｋ５６２／Ａ０２细胞株耐药基因ｍｄｒ１、谷胱甘肽Ｓ转移酶（ＧＳＴπ）、拓扑异构酶Ⅱα（ＴｏｐｏⅡα）和多药耐药相关蛋白（ＭＲＰ）的调节。方法应用细胞培养技术,采用ＭＴＴ比色法、免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应和流式细胞术分析。结果ＮＯＭ和ＤＲＯ均可明显提高Ｋ５６２／Ａ０２细胞株对阿霉素（ＡＤＭ）的敏感性,增加细胞内ＡＤＭ积累量。可显著下调ｍｄｒ１、ＧＳＴπ的ｍＲＮＡ和蛋白表达,明显上调ＴｏｐｏⅡα基因表达。Ｋ５６２敏感株的ＧＳＴπ基因表达同样被抑制。都具有明显的时间依赖性。ＭＲＰ基因表达的变化差异无统计学意义。结论ＮＯＭ和ＤＲＯ可明显逆转Ｋ５６２／Ａ０２细胞株对ＡＤＭ的耐药性。ＮＯＭ与异搏定逆转强度相似;两药对ｍｄｒ１、ＧＳＴπ和ＴｏｐｏⅡα基因表达均有明显调节作用。调节呈时间依赖性。     

甲诺孕酮和屈洛昔分对K562／A02细胞株多种耐药机制的调节

目的 研究甲诺孕酮（ＮＯＭ）和屈洛昔芬（ＤＲＯ）对Ｋ５６２／Ａ０２细胞株耐药基因ｍｄｒｌ、谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴπ）、拓扑异构酶Ⅱα（ＴｏｐｏⅡα）和多药耐药相关蛋白（ＭＲＰ）的调节。方法 应用细胞培养技术，采用ＭＴＴ比色法、免疫组织化学、逆转录－聚合酶链反应和流式细胞术分析。结果 ＮＯＭ和ＤＲＯ均可明显提高Ｋ５６２／Ａ０２细胞株对阿霉素（ＡＤＭ）的敏感性，增加细胞内ＡＤＭ积累量。可显下调ｍ     

异硫氰酸苯乙酯对K562／A02细胞阿霉素耐药影响的研究

本实验研究探讨异硫氰酸苯乙酯（phenylhexyl isothiocyanate,PHI）对K562／A02细胞的阿霉素（ADM）耐药性与敏感性的影响,并研究其可能的相关机制。运用MTT法分别检测阿霉素（ADM）以及PHI＋ADM对K562／A02细胞的生长抑制率,计算其耐药倍数;用流式细胞仪检测PHI作用前后细胞的凋亡、细胞内ADM浓度的变化和MRPI蛋白变化;分光光度仪测定细胞内还原性谷胱目肽（GSH）的含量;RT—PCR半定量检测PHI作用前后MRP1 mRNA的水平。结果显示,随着PHI浓度的增加,细胞生存率降低;两药联合应用时K562／A02细胞凋亡率均增加;当PHI≥20μmol／L时其耐药倍数有显著差异（P〈0．05）,两种细胞内ADM浓度增加亦有显著差异（P〈0．05）。单独运用1μg/ml ADM时K562／A02细胞内的GsH含量下降5％,单独运用PHI时K562／A02细胞内的GSH含量随着PHI浓度的增加先是轻度升高尔后下降,GSH含量下降点约在10μmoL／L;当PHI≥20μmol/L与1μg／ml ADM联合应用时,K562／A02细胞内的GSH含量随着PHI浓度的升高而进行性下降;而不同浓度的PHI的作用前后,两种细胞的MRP1的表达无论是蛋白水平还是基因水平都无显著差异（P〉0．05）。结论：PHI对K562／A02细胞的细胞毒作用与细胞内GSH耗竭无直接关系,PHI不但可以增强K562／A02细胞对ADM的敏感性,而且通过耗竭细胞内GSH部分地逆转K562／A02细胞对ADM的耐药。联合使用PHI可减少ADM的用量,从而降低其毒副作用。     

5溴汉防己甲素逆转多药耐药的体内体外研究

本研究旨在探讨5一溴汉防己甲素（BrTet）和汉防己甲素（Tet）对K562／A02细胞多药耐药性的逆转作用。采用MTT法检测阿霉素（ADM）联合应用BrTet、TeL,对K562／A02细胞和K562细胞增殖的影响;采用流式细胞术（FCM）检测细胞内ADM浓度和P糖蛋白（P—gp）的表达;采用RT—PCR测定细胞mdrl基因mRNA表达水平。建立裸鼠皮下移植瘤模型,比较BrTet、Tet在体内的逆转耐药作用。结果发现,BrTet在0．25、0．5以及1μmol／L浓度条件下对K562／A02细胞多药耐药性的逆转作用呈剂量依赖性。流式细胞术检测提示,BrTet显著增加K562／A02细胞内ADM浓度,并呈剂量依赖性,同时抑制P—gp的表达,下调mdrl mRNA的表达。在荷瘤鼠模型中,BrTet明显增加ADM对K562／A02移植瘤的抗肿瘤作用,从单用ADM的5．8％上升至26．1％,而在K562移植瘤中没有显著差异。结论：BrTet在体内体外试验中均显示出显著的逆转MDR作用,其活性可能与抑制P—gp的过度表达和增加抗肿瘤药物的积聚有关。     

靶向siRNA沉默mdr1基因表达及对白血病耐药细胞系K562/ADM的耐药逆转作用

目的 研究小干扰RNA（siRNA）对白血病多药耐药细胞系K562／ADM细胞mdr1基因表达的沉默作用和凋亡抑制的逆转效应。方法 K562／ADM为靶细胞，设计、筛选和合成2对针对mdr1基因mRNA的siRNA（mdr1 siRNA-1和mdr1siRNA-2），用脂质体介导转染K562／ADM细胞；实时荧光定量PCR（real—time PCR）法检测mdr1 mRNA的表达；流式细胞术测定P-糖蛋白（P—gP）水平和caspase-3活性；细胞形态学和FITC标记的膜联蛋白V／碘化丙锭（Annexin V—FITC／PI）双染色法检测细胞的凋亡。结果 筛选出的mdr1 siRNA-1和mdr1 siRNA-2显著抑制K562／ADM细胞mdr1的表达，mdr1 mRNA的表达分别降低91．2％和82．0％，P-gp水平下降74．1％和84．4％；增强caspase-3活性，活化caspase-3增加约40％；K562／ADM耐药细胞对阿霉素诱导凋亡的敏感性增强，Annexin V—FITC／PI染色检测细胞凋亡率提高约60％。结论 siRNA通过沉默mdr1 ／P—gp表达而逆转K562／ADM多药耐药细胞的凋亡抑制现象。     

反义基因逆转肿瘤细胞多药耐药诱导细胞凋亡的研究

目的：探讨克服肿瘤细胞多药耐药（ＭＤＲ）的方法，提高化疗效果。方法：采用多药耐药反义基因（ｍｄｒ－１－ＡＳＰＳ－ＯＤＮ）逆转Ｋ５６２／ＡＤＭ肿瘤细胞的ＭＤＲ，而诱导肿瘤细胞凋亡。结果：ｍｄｒ－１－ＡＳＰＳ－ＯＤＮ诱导Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞产生大量ＤＮＡ断片，流式细胞仪检测发现几乎全部ｍｄｒ－１＋Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞发生凋亡。结论：ｍｄｒ－１－ＡＳＰＳ－ＯＤＮ能有效、特异地抑制ｍｄｒ－１基因表达，逆转肿瘤细胞的ＭＤＲ，促进阿霉素诱导Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞凋亡，为其临床应用提供理论依据。     

大蒜素联合红霉素逆转K562／A02细胞多药耐药机理的研究

本研究比较大蒜素、红霉素单用及两药联用逆转K562/A02细胞多药耐药的效果并探讨相关机制,为临床采用低剂量药物联合逆转多药耐药提供实验依据。采用MTT法比较非细胞毒剂量大蒜素、红霉素单用及两药联用对K562/A02细胞多药耐药的逆转效果差异及毒性叠加情况,RT-PCR检测K562/A02细胞mdr1基因表达情况,免疫组织化学法检测P-gp表达情况,流式细胞仪检测细胞内阿霉素平均荧光强度。结果表明:大蒜素1、4、8 mg/L对K562/A02细胞的逆转倍数分别为1.80、2.26、2.82,呈浓度依赖性。红霉素60 mg/L的逆转倍数为2.20,大蒜素与红霉素联用的逆转倍数为4.94,无毒性叠加作用。大蒜素与红霉素单独作用均可下调耐药株mdr1、P-gp的表达,增加胞内阿霉素浓度,而两药联合作用时上述作用明显增强。结论非细胞毒剂量的大蒜素和红霉素联合应用逆转K562/A02细胞多药耐药效果明显强于单用,且无毒性叠加作用。联合用药在下调mdr1/P-gp表达、增加细胞内化疗药物浓度方面具有协同作用。