Ad-hLIF转基因饲养层细胞对CD34+造血干/祖细胞增殖和分化的影响

目的 用腺病毒载体介导的人白血病抑制因子基因(Ad-hLIF)感染WI-38人胚肺成纤维细胞制备饲养层细胞,体外观察转基因细胞对CD34+造血干/柑细胞增殖和分化的影响,体内研究对辐射损伤SCID小鼠造血功能恢复的效果.方法 用RT-PCR和ELISA法鉴定Ad-hLIF转基因饲养层细胞目的 基因的表达后,将经免疫磁珠法分离和流式细胞术检测后的CD34+细胞在饲养层和/或细胞因子培养体系中扩增28 d,检测不同时间点的单个核细胞(MNC)数量及CD34+细胞阳性率;扩增后的MNC经CFDA SE荧光标记后移植入辐射损伤SCID小鼠体内,RT-PCR和细胞荧光标记法检测小鼠内含Alu基因人源细胞的门巢情况.结果 感染50MOI(multiplicity of infection)Ad-hLIF的饲养层细胞均有绿色荧光,RT-PCR和ELISA法结果 显示hLIF目的 基因能在WI-38饲养层细胞中表达,免疫磁珠法分离的CD34+造血干/祖细胞经流式细胞术检测其纯度可达95.60%±2.58%,MNC在Ad-hLIF转基因饲养层培养体系持续扩增,最高可达356.95±0.87倍,其中CD34+细胞仪在0～14 d能维持较高水平,最高可扩增52.11±1.13倍,以后逐渐降低.将其移植辐射损伤SCID小鼠后,可明显提高小鼠存活率,4周内小鼠骨髓中不仅可观察到CFDA SE荧光标记的细胞,而且经RT-PCR法搭定后.还可检测到表达Alu人源基因的人脐血造血归巢细胞.结论 成功建立的Ad-hLIF转基因饲养层细胞不仅体外可以有效地扩增CD34+造血干/祖细胞,并延缓其分化.扩增的CD34+细胞对辐射损伤SCID小鼠具有造血功能恢复的功能.     

SCID小鼠在脐血造血干/祖细胞移植研究中的应用

严重联合免疫缺陷 (SCID)小鼠是研究人造血干细胞增殖分化的一个理想的体内试验模型 ,近年来脐血造血干 /祖细胞体外扩增的研究成为干细胞移植领域备受关注的课题 ,通过采用有效的体内试验模型来进一步深入了解扩增后脐血造血细胞的移植潜能和造血活性。本文就SCID小鼠在脐血造血干 /祖细胞体外扩增和移植中应用作一综述     

014 SCID小鼠在脐血造血干/祖细胞移植研究中的应用

严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠是研究人造血干细胞增殖分化的一个理想的体内试验模型,近年来脐血造血干/祖细胞体外扩增的研究成为干细胞移植领域备受关注的课题,通过采用有效的体内试验模型来进一步深入了解扩增后脐血造血细胞的移植潜能和造血活性.本文就SCID小鼠在脐血造血干/祖细胞体外扩增和移植中应用作一综述.     

SCID小鼠在脐血造血干／祖细胞移植研究中的应用

严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠是研究人造血干细胞增殖分化的一个理想的体内试验模型，近年来脐血造血干／祖细胞体外扩增的研究成为干细胞移植领域备受关注的课题，通过采用有效的体内试验模型来进一步深入了解扩增后脐血造血细胞的移植潜能和造血活性。本文就SCID小鼠在脐血造血干／祖细胞体外扩增和移植中应用作一综述。     

脐血造血干/祖细胞移植SCID小鼠的实验研究

目的 :检测扩增后脐血造血干 祖细胞的体内移植能力和造血活性 ,建立脐血细胞体外扩增优化方案和体内移植的SCID小鼠模型。方法 :采用无基质接触的液体悬浮培养方法扩增脐血CD34 细胞 ,将扩增前后的细胞移植给预先经过亚致死量辐照的SCID小鼠 ,4w后通过免疫荧光标记、PCR等检测存活小鼠体内的人源细胞。结果 :连续培养一定时间后 ,FL TPO SCF IL 6组脐血细胞得到持续扩增 ,并能维持一定比例的CD34 细胞 ;SCF IL 3 IL 6 GM CSF EPO组在第 2周时集落形成数已降低 ,第 4周时集落形成的细胞、CD34 细胞已基本检测不到。移植至少 4w后 ,在存活小鼠体内检测到人CD4 5 细胞和Alu基因。结论 :因子组合FL TPO CSF IL 6可以有效扩增脐血CD34 细胞 ,而且扩增后的细胞具有较高的移植效率和造血活性     

Ad-hOSM转基因饲养层细胞对脐血CD34~+造血干/祖细胞增殖及归巢能力的影响

目的:建立转人抑瘤素M(hOSM)基因腺病毒载体的饲养层细胞,观察转基因细胞对脐血CD34+造血干/祖细胞扩增的影响,比较扩增前、后造血干/祖细胞体外迁移能力的变化。方法:建立转hOSM基因腺病毒载体的饲养层细胞,并用RT-PCR法和ELISA法鉴定目的基因;采用免疫磁珠法分离脐带血CD34+造血干/祖细胞,流式细胞术(FCM)检测纯度;将CD34+造血干/祖细胞与饲养层细胞共培养,FCM检测各组增殖效果;扩增后的造血干/祖细胞用跨膜迁移实验(Transwell实验)检测自发迁移率和SDF-1诱导迁移率以鉴定体外扩增的造血干/祖细胞的归巢能力。结果:建立的转基因饲养层细胞均有绿色荧光,RT-PCR法和ELISA法证实有目的基因表达,免疫磁珠法分离的脐血CD34+造血干/祖细胞纯度可达(96.8±2.28)%,与Ad-hOSM转基因饲养层细胞共培养7 d后CD34+造血干/祖细胞可扩增15.73倍,表面黏附分子CXCR4和CD54表达量仍较高,培养后的细胞用Tran-swell板做体外迁移实验,与转基因饲养层细胞共培养的干细胞,其诱导迁移率为(40.68±1.35)%,明显高于对照组,可以较好的保持其归巢能力。结论:转hOSM基因腺病毒载体的饲养层细胞可有效扩增脐血CD34+造血干/祖细胞,延缓其分化,并且体外扩增后仍保持较高的归巢能力。     

培养前后脐血CD34~＋细胞在NOD/SCID鼠体内造血重建功能的比较

目的:以NOD/SCID小鼠为模型, 经半致死剂量照射后输注新鲜或培养后的造血细胞, 以比较培养前后脐血CD34 细胞的造血重建功能.方法:从新鲜脐血中分离单个核细胞(MNC), 采用干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、Flt3配体(FL)、白细胞介素3(IL-3)和白细胞介素6(IL-6)细胞因子组合体外培养14 d.通过MiniMACS免疫磁性吸附柱从新鲜或培养后的MNC中分离CD34 细胞, 4×105个CD34 细胞和5×106CD34-细胞混合后通过尾静脉输注入NOD/SCID小鼠中.饲养过程中动态观察外周血象恢复情况, 6周后检测小鼠骨髓和脾脏细胞中人源细胞及各系造血细胞的含量.结果:体外培养MNC 14 d后, 总细胞扩增了1.78倍;细胞移植6周后, 输注新鲜和培养后造血细胞的小鼠均存活, 在小鼠骨髓和脾脏中均可检测到人源细胞及各系人源血细胞和人特异ALU基因序列, 小鼠外周血象恢复到辐照前水平.培养后CD34 细胞在小鼠体内的植入水平与新鲜CD34 细胞的相近, 而其各系人源血细胞的含量高于新鲜CD34 细胞. 结论:体外培养14 d后的CD34 细胞仍保持了体内植入和重建造血的能力, 且其多系造血重建能力优于新鲜CD34 细胞.     

脐血CD34+造血干/祖细胞基因表达图谱的研究

目的：通过脐血CD34^＋造血干／祖细胞的基因表达分析，理解造血干／祖细胞生物学特性。方法：利用MiniMACS免疫磁珠法从脐血细胞中分离CD34^＋造血干／祖细胞，提取总RNA，用SMART-PCR技术从微量RNA中扩增产生足够量的cDNA用于高密度点阵膜分析检测CD34^＋造血干／祖细胞表达的基因。结果：在所检测的588个基因中，发现63个基因具有显著的表达水平，其中18个基因强表达。这些基因主要涉及造血干细胞增殖、分化、应激响应、凋亡、转录调节以及细胞周期等。结论：对理解脐血干／祖细胞生物学性质以及指导造血干细胞体外培养提供了分子生物学基础。     

外源基因在人造血干祖细胞中的转移和表达

应用逆转录病毒载体介导基因转移法将ｎｅｏ~ｒ基因导入人造血干祖细胞，并经体外液体长期培养。结果表明，产重祖病毒细胞ＰＡ３１７／Ｎ２的病毒滴度最高达６．５×１０~５ＣＦＵ／ｍｌ，用ＰＣＲ法从体外培养２、４、６ｗ及加入ｒＩＬ－１、ｒＩＬ－６的悬浮和贴壁的转染细胞中均可扩增出ｎｅｏ~ｒ基因ｃＤ－ＮＡ片段，非同位素化学发光法标记ｎｅｏ~ｒ探针与之杂交显示阳性结果。表明逆转录病毒介导目的基因已有效地转入体外培养的人造血干祖细胞中，并进行表达。     

造血干/祖细胞在基因治疗中的应用

基因治疗进入临床试验后,为了使带有目的基因的细胞在病人体内长期或永久地表达,必须选一种能在体内自我更新和自我维持的永不消亡的细胞,作为目的基因的宿主细胞。本文综述了造血干/祖细胞的特性、体外扩增、定向分化、诱导和造血细胞作为基因导入靶细胞的基因治疗及其临床应用,以及存在的问题、改进措施和应用前景。     

Hematopoietic engraftment in recipients of unrelated donor umbilical cord blood is affected by the CD34+ and CD8+ cell doses.

Umbilical cord blood (UCB) transplantation is limited by the low number of hematopoietic stem cells in UCB units, which results in a low engraftment rate in transplant recipients. Here, we measured the total nucleated cell count and CD34(+), CD3(+), CD4(+), CD8(+), CD14(+), and CD16(+)/56(+) cell doses in each UCB unit and evaluated their influence on engraftment and other outcomes in 146 recipients. Multivariate analysis showed a significant association between a higher incidence of successful engraftment and a dose of CD34(+) and CD8(+) cells above the median (1.4 x 10(5) and 15.7 x 10(5) cells/kg, respectively). Engraftment occurred 4 days earlier in patients who received UCB with more than the median dose of CD34(+) cells than those receiving UCB at or below the median. Stratification of the group according to CD34(+) cell dose revealed a significant influence of the CD8(+) cell dose on the time to achieve neutrophil engraftment in patients receiving a lower CD34(+) cell dose, whereas there was no significant influence in the patients receiving a higher CD34(+) cell dose. These results suggest that consideration of CD34(+) and CD8(+) cell doses in UCB units may improve the engraftment in recipients of UCB transplantation.     

脐血浆神经营养活性蛋白成分对CD34+细胞增殖分化的影响

背景：迄今为止,人们对于脐血浆中是否存在活性成分及其对于神经发育及神经损伤修复的作用认识尚不足,有待深入研究。 目的：检测脐血浆生物活性成分,观察其在神经发育及神经损伤修复中的作用。 方法：采用抗体芯片技术对脐血浆和健康青年女性静脉血浆活性成分进行对比分析,采用免疫磁珠从脐血中分选出CD34⁺细胞,经体外培养计数观察CD34⁺细胞增殖能力,通过免疫组化法观察细胞分化情况。 结果与结论：脐血浆中有31种蛋白分子的含量显著高于静脉血浆,其中具有促进神经再生和神经修复潜能的活性蛋白10种,包括FGF4、Frizzled-3、IL-3、RAGE、CRIM-1、Neuritin、Neuropilin-2、Neurturin、SFRP-3、Tomoregulin-1;在CD34+细胞培养液中加入脐血浆能显著促进细胞增殖,促进细胞向神经细胞分化。     

CD26 inhibition on CD34+ or lineage- human umbilical cord blood donor hematopoietic stem cells/hematopoietic progenitor cells improves long-term engraftment into NOD/SCID/Beta2null immunodeficient mice

Given the tremendous need for and potential of umbilical cord blood (CB) to be utilized as a donor source for hematopoietic stem cell (HSC) transplantation in adults, there is a strong push to overcome the constraints created by the limited volumes and subsequent limited HSC and hematopoietic progenitor cell (HPC) numbers available for HSC transplantation from a single collection. We have previously described the use of CD26 inhibitor treatment of donor cells as a method to increase the transplant efficiency of mouse HSCs and HPCs into a mouse recipient. To study the use of CD26 inhibitors as a method of improving the transplantation of human CB HSCs and HPCs, we utilized the nonobese diabetic/severe combined immunodeficient/beta 2 microglobulin null (NOD/SCID/B2m(null)) immunodeficient mouse model of HSC transplantation. We report here significant improvements in the engraftment of long-term repopulating cells following the treatment of either CD34(+) or lineage negative (lin()) donor CB with the CD26 inhibitor, Diprotin A, prior to transplant. These results establish a basis on which to propose the use of CD26 inhibitor treatment of donor CB units prior to transplantation for the purpose of improving transplant efficiency and subsequently patient outcome.     

Effects of intravenous human umbilical cord blood CD34+ stem cell therapy versus levodopa in experimentally induced Parkinsonism in mice

Introduction

Parkinsonism is a neurodegenerative disease with impaired motor function. The current research was directed to investigate the effect of CD34+ stem cells versus levodopa in 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced Parkinsonism.

Material and methods

Mice were divided into 4 groups; saline-injected, MPTP: received four MPTP injections (20 mg/kg, i.p.) at 2 h intervals, MPTP groups treated with levodopa/carbidopa (100/10 mg/kg/twice/day for 28 days) or single intravenous injection of 10⁶ CD34+ stem cells/mouse at day 7 and allowed to survive until the end of week 5.

Results

Levodopa and stem cells improved MPTP-induced motor deficits; they abolished the difference in stride length, decreased percentage of foot slip errors and increased ambulation, activity factor and mobility duration in parkinsonian mice (p < 0.05). Further, they significantly (p < 0.05) increased striatal dopamine (85.3 ±4.3 and 110.6 ±5.3) and ATP levels (10.6 ±1.1 and 15.5 ±1.14) compared to MPTP (60.1 ±3.9 pmol/g and 3.6 ±0.09 mmol/g, respectively) (p < 0.05). Moreover, mitochondrial DNA from mice treated with levodopa or stem cells was in intact form; average concentration was (52.8 ±3.01 and 107.8 ±8.6) and no appreciable fragmentation of nuclear DNA was found compared to MPTP group. Regarding tyrosine hydroxylase (TH) immunostaining, stem cell group showed a marked increase of percentage of TH-immunopositive neurons (63.55 ±5.2) compared to both MPTP (37.6 ±3.1) and levodopa groups (41.6 ±3.5).

Conclusions

CD34+ cells ameliorated motor, biochemical and histological deficits in MPTP-parkinsonian mice, these effects were superior to those produced by levodopa that would be promising for the treatment of PD.     

Ad-LIF-OSM双基因转染饲养细胞对脐血造血细胞体外增殖和分化的影响

目的 构建表达人白血病抑制因子(LIF)和抑瘤素M(OSM)双基因的WI-38人胚肺成纤维细胞,并以此细胞作为饲养层细胞观察其对CD34+.造血干/祖细胞体外增殖和分化的影响.方法 以双启动子转移载体pAdTrack-CMV-LIF-polyA+promoterΔ为基础,将OSM基因片段酶切后插入,构建出转移质粒pAdTrack-CMV-LIF-polyA+promoterΔ -OSM.将构建正确的转移质粒与腺病毒骨架质粒共转化,获得重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-LIF-polyA+promoter△-OSM,通过包装,收获重组腺病毒(AdLIF-OSM).将重组腺病毒感染饲养层细胞,经RT-PCR、ELISA法检测外源基因在细胞中的表达;体外与CD34+造血干/祖细胞共培养后,通过Transwell法和细胞计数检测,比较各实验组干/祖细胞体外扩增与分化情况.结果 测序结果显示重组载体中的LIF和OSM基因序列正确;转基因饲养层细胞中能检测到外源LIF和OSM基因的转录和表达;外源LIF和OSM基因在造血干/祖细胞体外培养中能够发挥作用.结论 成功构建携带人LIF和OSM的双基因重组腺病毒载体(Ad-LIF-OSM),Ad-LIF-OSM在造血干/祖细胞体外培养的过程中能够有效地扩增CD34+造血干/祖细胞,并延缓其分化.