TNF-α 3'-UTR双荧光素酶报告基因系统的构建及丹参酮类药物筛选

目的构建并鉴定p GL3-TNF-α3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统,以此基于调控TNF-α转录后水平对丹参酮类成分进行筛选。方法反转录人脐静脉内皮细胞HUVEC的mRNA成c DNA,以之为模板,PCR扩增含TNF-α3'-UTR的DNA片段全长,经酶切后连接至荧光素酶报告载体p GL3-control上,构建出p GL3-TNF-α3'UTR全长的荧光素酶报告基因载体并进行鉴定。将所构建的p GL3-TNF-α3'UTR与p SVRenilla质粒组成双荧光素酶报告系统共转染至单核巨噬细胞RAW264.7,经脂多糖诱导后利用该双荧光素酶报告基因表达系统判定丹参酮类成分对TNF-α转录后调控是否有影响。结果成功构建p GL3-TNF-α3'UTR荧光素酶报告基因,克隆获得的DNA片段大小及序列与Genbank报道的一致。脂多糖(LPS)可以明显诱导转入p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光强度。丹参酮类成分中隐丹参酮可以明显降低LPS诱导的p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光素酶活性。结论成功构建含TNF-α3'UTR区的双荧光素酶报告基因表达系统,并以此从丹参酮类化合物中筛选出隐丹参酮,可以对TNF-α的转录后水平进行抑制调控。     

FSHB启动子基因多态性与多囊卵巢综合征的相关性研究

目的 克隆人卵泡刺激素β亚基(Follicle Stimulating Hormone β-subunit,FSHB)的启动子;构建FSHB启动子的报告基因载体并进行活性分析.方法 设计合成FSHB启动子引物,采用PCR技术从人基因组DNA中扩增FSHB启动子序列;将扩增片段插入载体并利用酶切与测序进行鉴定;亚克隆该基因至PGL6-TA荧光报告基因载体;瞬时转染进Hela细胞,收集细胞裂解液后,用荧光素酶报告基因系统检测报告基因载体的活性.结果 PCR扩增得到人FSHB基因启动子;成功构建pGL6-FSHB-promoter报告基因载体,测序结果表明启动子序列正确;双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的报告基因载体具有启动子活性.通过荧光素酶相对表达效率比较,在Hela细胞的体外实验中发现,FSHB-211G→T突变后荧光素酶表达具有更高的效率,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建人FSHB基因启动子的克隆及其报告基因载体的构建,为深入研究FSHB转录表达的调控机制提供基础.     

人白介素-15基因系列启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的克隆人白介素-15(IL-15)基因系列启动子,构建IL-15基因启动子荧光素酶报告基因载体。方法通过PCR方法从HaCaT细胞基因组DNA中获得IL-15基因编码序列5′上游七段逐步缺失的IL-15启动子序列;双酶切后,分别重组到含萤火虫荧光素酶的报告基因pGL3-Basic载体上,构建IL-15基因系列启动子报告基因载体;用脂质体转染法将含最长启动子序列的报告基因载体转染至HaCaT细胞,并设置空白对照组和LPS组分别处理;24 h后采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。结果经PCR方法扩增出七段逐步缺失的IL-15基因启动子片段,PCR及双酶切鉴定各重组体构建正确;瞬时转染HaCaT细胞后经报告基因检测得知所克隆最长序列具有启动子活性。结论成功构建了IL-15系列启动子报告基因载体,并在HaCaT细胞中初步活性分析得知所克隆IL-15基因调控系列内包含启动子核心区域,为进一步研究IL-15表达调控机制奠定了实验基础。     

人多巴胺D2受体基因内含子区51103 T/C多态性对基因转录活性的影响

目的：探讨人多巴胺D2受体(DRD2)基因第3内含子区51103 bp位点单核苷酸多态性(rs2075652)对DRD2基因转录活性的影响,进一步揭示DRD2基因第3内含子区的单核苷酸多态性影响创伤后应激障碍发病风险的分子机制。方法以人全血基因组DNA为模板,扩增DRD2基因第3内含子区序列(399 bp),51103 bp处分别为T或C,与报告基因载体pmirGlo相连接,构建重组荧光素酶表达载体,经限制性内切酶酶切及测序得以鉴定,然后分别与pRL-CMV共转染人胚肾癌细胞株HEK293,检测细胞中荧光素酶的相对表达量。结果双酶切及测序结果证实成功构建重组质粒pmirGlo-T/pmirGlo-C,荧光素酶检测结果显示,当第3内含子区51103 bp位点为C时荧光素酶活性显著高于为T时(P<0．01)。结论成功构建了pmirGlo-T/pmirGlo-C报告基因重组质粒,DRD2基因第3内含子区rs2075652位点由T突变为C后,可能增强基因转录活性,该结果为进一步研究DRD2基因内含子区的功能奠定了基础。     

人血管内皮生长因子受体3胞外1-3区基因的克隆与表达载体的构建

目的构建人血管内皮生长因子受体(VEGFR)-3胞外1-3区基因原核表达体系。方法提取人胎盘组织上总RNA,经反转录制备cDNA;从Genebank获取该基因序列,设计引物进行聚合酶链反应(PCR)以扩增VEGFR-3胞外1-3区基因片段,回收和纯化PCR产物并将其插入pMD18T载体中进行克隆;测序正确后,将目的基因克隆入原核表达载体pBV220,对获得的原核表达质粒进行初步鉴定。结果构建了pBV220-VEGFR-3质粒表达载体,经DNA测序鉴定序列正确。结论应用基因工程技术,成功构建了VEGFR-3原核表达载体。     

Nfic 基因 3′UTR 双荧光素酶报告质粒的构建及其与 miR-20a 靶向关系的验证

摘要： 目的 构建核因子 C（nuclear factor I-C, Nfic）基因 3′非编码区（3′UTR）荧光素酶报告质粒, 利用双荧光素酶报告基因验证 microRNA-20a（miR-20a）与其潜在靶基因 Nfic 的靶向关系。 方法 通过 microRNA 靶基因预测软件 Targetscan 获取 miR-20a 与 Nfic 基因 3′UTR 潜在的互补结合位点; PCR 扩增出 Nfic 基因 3′UTR 序列, 将此序列克隆至荧光素酶报告载体 pMIR-Report Luciferase; 将重组荧光素酶报告质粒与 miR-20a mimics（ 实验组） 或 NC mimics（对照组）共同转染 293-AD 细胞, 收集细胞后通过双荧光素酶报告系统检测 2 组细胞的荧光素酶活性, 从而对 Nfic 与 miR-20a 的靶向调节关系进行鉴定。 将 miR-20a mimics 和 NC mimics 分别转染骨髓基质细胞系 ST2, 裂解细胞提取蛋白后采用 Western blotting 检测 NFIC 蛋白的表达水平。 结果 构建的重组荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确。 双荧光素酶报告基因检测显示, 与对照组相比, miR-20a 可以抑制 Nfic 3′UTR 报告基因载体的荧光素酶活性（P < 0.05）;Western blotting 结果显示, 与对照组相比, ST2 细胞转染 miR-20a mimics 后 NFIC 蛋白表达水平明显下调。 结论 成功构建了 Nfic 基因 3′UTR 荧光素酶报告质粒,而 miR-20a 可以直接作用于 Nfic 基因 3′UTR,抑制其荧光素酶活性。     

人多巴胺D2受体基因内含子区51103T/C多态性对基因转录活性的影响

目的探讨人多巴胺D2受体（DRD2）基因第3内含子区51103 bp位点单核苷酸多态性（rs2075652）对DRD2基因转录活性的影响,进一步揭示DRD2基因第3内含子区的单核苷酸多态性影响创伤后应激障碍发病风险的分子机制。方法以人全血基因组DNA为模板,扩增DRD2基因第3内含子区序列（399 bp）,51103 bp处分别为T或C,与报告基因载体pmir Glo相连接,构建重组荧光素酶表达载体,经限制性内切酶酶切及测序得以鉴定,然后分别与pRL-CMV共转染人胚肾癌细胞株HEK293,检测细胞中荧光素酶的相对表达量。结果双酶切及测序结果证实成功构建重组质粒pmir Glo-T/pmir Glo-C,荧光素酶检测结果显示,当第3内含子区51103 bp位点为C时荧光素酶活性显著高于为T时（P〈0.01）。结论成功构建了pmir Glo-T/pmir Glo-C报告基因重组质粒,DRD2基因第3内含子区rs2075652位点由T突变为C后,可能增强基因转录活性,该结果为进一步研究DRD2基因内含子区的功能奠定了基础。     

MIBP1基因敲除载体的构建

目的:构建MIBP1基因敲除载体。方法:以小鼠129胚胎干细胞基因组DNA为模板,根据GenBank注册序列,扩增小鼠MBP-2基因启动子区5′端片段(5′arm)和内含子区3′端片段(3′arm),然后分别克隆进敲除载体pKOScramblerNTKV-1906,酶切鉴定后即得到MIBP1基因敲除载体pNTKV-3′,5′arm。用SalⅠ对pNTKV-3′,5′arm线性化,用于胚胎干细胞电转染。结果:成功扩增并克隆到小鼠129胚胎干细胞MBP-2基因的5′arm和3′arm片段,构建了MIBP1基因敲除载体。结论:成功构建了MIBP1基因敲除载体。     

ASAP3真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建ASAP3的真核表达载体并鉴定。方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肝癌细胞株HepG2克隆ASAP3基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性。结果:DNA测序和酶切鉴定证明ASAP3基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点。结论:成功构建ASAP3的真核表达载体p ASAP3。     

利用DNA洗牌技术一次性克隆多个基因

目的探讨DNA洗牌技术(DNA shuffling)对蛋白质组学和代谢组学等研究的意义。方法利用DNA洗牌技术一次性克隆多个基因片段到表达载体,并同时突变基因内部的2个氨基酸位点,PCR、酶切、测序检测构建表达载体的准确性。结果成功地一次性克隆了3个编码小RNA的串联短片段MSb1、MSb2、MSb3以及3个蛋白编码基因Fok I、MS2、Fok I,并一次性将PLRV-P0基因内部2个编码色氨酸(W)的密码子TGG突变为编码丙氨酸(A)的GCG密码子。结论 DNA洗牌技术可应用于基因组学、多基因功能鉴定、融合基因表达和一次性构建基因内部多个点突变的研究,具有精确、快速和高效的特点。     

HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体的构建及鉴定

目的　设计并合成人8 羟基鸟嘌呤 DNA糖苷酶(HOGG1)特异性的锤头状核酶(hammerheadribozyme)基因并构建其真核表达载体。鉴定含有核酶靶基因HOGG1cDNA保守序列的真核表达载体。方法　运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ) ,将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA 3 1中,重组子由BamHI和EcoRI酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序证实。含有HOGG1基因cDNA保守序列的真核表达载体经BamHI和EcoRI酶切电泳鉴定。结果　RZ人工合成后与pcDNA 3 1连接,酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI位点之间,命名为pcDNA 3 1 RZ。1 3kb的HOGG1基因cDNA保守序列准确克隆于pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI酶切位点之间,命名为pcDNA 3 1 HOGG1。结论　成功合成HOGG1特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体,以及核酶靶基因的真核表达载体。     

维生素D受体基因Fok Ⅰ多态对CYP3A4转录调控的影响

目的：研究人维生素D受体（human vitaminDreceptor,hVDR）基因翻译起始密码子Fok Ⅰ突变介导CYP3A4诱导表达的调控能力与野生型比较有无统计学差异。方法：从肝脏组织标本中提取总RNA,RT-PCR法扩增获得野生型hVDR基因cDNA序列,并用定点诱变的方法获得含Fok Ⅰ突变的hVDRcDNA序列,构建野生型和突变型的真核表达载体;同时构建含CYP3A4近端ER6元件的荧光素酶报告基因载体。将hVDR真核表达载体、CYP3A4报告基因载体和内对照载体共同瞬时转染COS-7细胞,转染24 h后用1、10、100 nmol/L的1,25（OH）2D3孵育48 h,最后裂解细胞分析荧光素酶活性。结果：Fok Ⅰ突变型和野生型hVDR真核表达载体以及CYP3A4荧光素酶报告载体均构建成功。瞬转后胞内荧光素酶活性检测显示,各浓度1,25（OH）2D3孵育后hVDR基因Fok Ⅰ突变型组与野生型组均可激活CYP3A4的转录;但各维生素D3（vitamin D3,VD3）浓度下,突变型组与野生型组的荧光素酶比活性值没有统计学差异。结论：与VD3结合后,hVDRFokI突变型与野生型均能激活CYP3A4的诱导表达,但与野生型比较,FokI突变不能导致VDR蛋白转录激活调控能力     

小鼠核结合因子a1基因启动子报告载体的构建及鉴定

目的:构建小鼠核结合因子a1(Cbfa1)基因启动子萤光素酶报告载体,并检测其驱动报告基因的转录活性。方法:以小鼠基因组DNA为模板,巢式PCR扩增含有Cbfa1基因启动子(-1000～+200bp)的序列。限制性内切酶MluI和XhoI酶切这段序列后定向克隆到不含启动子的PGL3-Basic报告基因载体上,重组质粒命名为pGL3-Cbfa1。pGL3-Cbfa1瞬时转染成骨细胞系MC3T3-E1,检测其能否在Cbfa1基因启动子的调控下表达报告基因并提高萤光素酶活性。结果:pGL3-Cbfa1经酶切鉴定和序列分析证实与设计完全一致。细胞瞬时转染结果表明Cbfa1启动子具有转录活性,pGL3-Cbfa1的萤光素酶水平约是pGL3-Basic的35倍。结论:小鼠Cbfa1启动子报告基因载体的成功构建,为进一步将其用于抗骨质疏松药物的筛选与评价奠定了实验基础。     

乙酰肝素酶系列表达载体的构建

构建了人乙酰肝素酶基因系列真核表达载体，并在NIH3T3细胞中表达，以研究乙酰肝素酶的结构与功能的关系。采用PCR及GeneSOE的方法从人乙酰肝素酶cDNA中扩增得到hpaFL(Met^1-Iles^543)，hpal09(Met^1-Glu^109)及hpasp50(pro，Met^1-Ala^35 Lys^158-Iles^543)，然后插入真核表达载体pcDNA3．1中。采用脂质体介导法将其转染NIH3T3细胞，48h后RT-PCR检测转染细胞中外源乙酰肝素酶基因的转录。结果：酶切鉴定、测序结果以及RT-PCR分析结果表明成功构建了重组表达载体pcDNA-hpaFL，pcDNA-hpa109及pcDNA-hpasp50，并在NIH3T3细胞中有效转录。构建成功的乙酰肝素酶系列表达载体可为乙酰肝素酶结构与功能关系的研究奠定基础。     

HOTAIR上调miR-152靶向调控HLA-G的 生物信息作用预测与验证

摘要：目的 预测并验证HOX转录反义RNA（HOTAIR）通过上调miR-152-3p对人类白细胞抗原-G（HLA-G）靶 向调控作用。方法 利用生物信息学网站及软件预测miR-152-3p与HOTAIR和HLA-G基因3′非翻译区（UTR）的 结合位点,设计合成含有与 miR-152-3p 结合位点的 HOTAIR 和 HLA-G 基因 3′-UTR 序列及其突变序列,并构建 HOTAIR和HLA-G野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体。经双酶切电泳和测序鉴定后,HOTAIR和HLA-G野 生型与突变型双荧光素酶报告基因载体分别与 miR-152-3p 模拟物（mimics）和 miRNA 无义序列阴性对照（mimics NC）共转染HTR-8/SVneo细胞,检测荧光素酶活性,观察miR-152-3p对HOTAIR和HLA-G表达的影响。结果 双 酶切电泳和测序结果显示,野生型和突变型的HOTAIR和HLA-G基因载体片段大小、序列与实验预期一致,载体构 建成功。转染 miR-152-3p mimics 后的 HOTAIR 及 HLA-G 野生型荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）,而对突变型 HOTAIR和HLA-G载体的荧光素酶表达无明显抑制作用（P＞0.05）。结论 HOTAIR通过上调miRNA-152-3p靶向调控HLA-G。     

人乳腺癌转移抑制基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建乳腺癌转移抑制基因（BRMS1）的真核表达载体pcDNA3．1（-）B／myc-BRMSI,为进一步研究恶性肿瘤的转移机制及基因治疗提供物质基础。方法常规方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,Trizd法提取细胞株总RNA;设计一对特异性引物,经过逆转录反应获得BIIMS1 cDNA的CDS序列,连接到质粒pcDNA3．1／mye—His（-）B上,构建BRMS1的真核表达载体peDNA3．1（-）B／myc．BRMS1,行基因测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK-293,行Westernblot验证其是否表达。结果重组质粒pcDNA3．1（-）B／myc-BRMS1经双酶切及基因测序分析,验证了克隆的人BRMS1基因cDNA序列与GenBank[AF159141]公布的人BRMS1基因的cDNA序列吻合,重组体peDNA3．1（-）B／myc—BRMS1中插入的目的基因BRMS1是正向、单倍插入。结论成功构建了BRMS1真核表达载体pcDNA3．1（-）B／myc—BRMS1,为深入研究BRMS1基因功能和BRMS1基因治疗奠定了物质基础。     

人乳腺癌转移抑制基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建乳腺癌转移抑制基因(BRMS 1)的真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS1,为进一步研究恶性肿瘤的转移机制及基因治疗提供物质基础.方法 常规方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,Trizol法提取细胞株总RNA;设计一对特异性引物,经过逆转录反应获得BRMS1 cDNA的CDS序列,连接到质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B上,构建BRMS 1的真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS1,行基因测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK-293,行Western blot验证其是否表达.结果 重组质粒pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1经双酶切及基因测序分析,验证了克隆的人BRMS 1基因cDNA序列与GenBank[AF159141]公布的人BRMS 1基因的cDNA序列吻合,重组体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1中插入的目的 基因BRMS 1是正向、单倍插入.结论 成功构建了BRMS 1真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1,为深入研究BRMS 1基因功能和BRMS 1基因治疗奠定了物质基础.