Taqman探针定量检测ICOS/ICOSL基因表达的方法

背景：近年来可诱导共刺激分子(inducible costimulator, ICOS)/可诱导共刺激分子配体(ICOS Ligand,ICOSL)在抗感染、抗移植反应、抗肿瘤、治疗自身免疫性疾病等多方面领域受到了越来越多的关注。目前对ICOS/ICOSL表达量的研究大多基于分子水平,国内外尚鲜见ICOS/ICOSL mRNA定量检测的报道。 目的：构建ICOS/ICOSL cDNA质粒标准品,建立Taqman探针检测ICOSL/ICOSL基因表达量的方法。 方法：以胃腺癌组织总RNA为模板、Random 9 mers为引物反转录合成cDNA,用该cDNA为模板聚合酶链反应扩增人ICOS/ICOSL基因相应的cDNA目的片段,构建PMD-18-ICOS/ICOSL重组质粒,鉴定测序后,用Taqman探针实时荧光定量聚合酶链反应制作标准曲线。 结果与结论：组织提取的总RNA完整性良好,构建的ICOS/ICOSL质粒测序结果与目的片段一致,质粒的原始浓度为6.10×1013,4.31×1013 copies/mL,倍比稀释后用Taqman探针荧光定量聚合酶链反应检测,在1012~1013 copies/mL线性关系良好(R2=1),提示成功建立了Taqman探针定量检测ICOS/ICOSL基因表达的方法。 关键词：共信号分子;可诱导共刺激分子;配体;mRNA;实时定量聚合酶链反应     

叉头转录因子1质粒标准品的构建

背景：研究表明叉头转录因子1是一种新的2型糖尿病易感基因,但2型糖尿病患者与健康人的叉头转录因子1基因在转录水平上差异性的研究不多。由于还没有商品化叉头转录因子1的质粒标准品,因此有必要构建其标准品。 目的：构建应用实时荧光定量-聚合酶链反应检测叉头转录因子1 mRNA的质粒标准品。 设计、时间及地点：单一样本重复实验,于2007-11/2008-03在苏州大学附属第一医院检验科实验室完成。 材料：SYBR ExScript TM反转录-聚合酶链反应Kit试剂盒,SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒,凝胶回收纯化DNA试剂盒,质粒DNA小量纯化试剂盒,PMD18-T Vector试剂盒等。 方法：从健康志愿者血标本中提取总RNA,反转录合成cDNA,以cDNA为模板应用聚合酶链反应扩增出目的片段,对其回收纯化连接到PMD18-T载体及转化JM109,阳性克隆经测序分析,确认重组质粒正确。抽提重组质粒,用紫外分光光度仪测定其浓度,再根据公式换算成拷贝浓度,最后稀释成梯度标准品。 主要观察指标：重组质粒聚合酶链反应和基因测序结果,标准品标准曲线的相关系数及标准品的重复性。 结果：成功构建了叉头转录因子1质粒标准品,通过聚合酶链反应及基因测序鉴定其目的片段已成功插入载体。各稀释度的标准品经荧光定量-聚合酶链反应扩增后,其循环阈值与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系,线性范围是2.39×(105~1012) copies/mL。各稀释度标准品的批内重复性好,其变异系数范围为0.29%~1.16%。 结论：实验成功构建了具有较好灵敏度和重复性的叉头转录因子1质粒标准品。     

克隆高鸟嘌呤与胞嘧啶含量大鼠bcl-2基因的编码序列*☆

背景：卵巢颗粒细胞的过度凋亡是诱发卵巢早衰的根本途径，bcl-2基因具有抗细胞凋亡的特性。但实验表明，大鼠bcl-2基因序列中鸟嘌呤与胞嘧啶含量高达60.6%，应用常规聚合酶链反应方法，无法扩增出此基因。 目的：拟克隆大鼠基因组中高鸟嘌呤与胞嘧啶含量的bcl-2基因编码序列。 设计、时间及地点：开放性实验，于2007-05/12在中山大学生命科学院医药分子生物学实验室完成。 材料：Wistar大鼠购自中山大学实验动物中心生产供应部，大肠杆菌DH5α由中山大学分子医药生物学实验室保种，载体pMD18-T 购自TakaRa大连宝生物技术公司。 方法：采用改进的反转录-聚合酶链反应方法从大鼠脾脏组织中扩增出鸟嘌呤与胞嘧啶含量为60.6%的bcl-2 cDNA编码序列，将扩增产物克隆至pMD18-T载体中，用单菌活聚合酶链反应扩增快速鉴定DNA片段后进行序列分析。 主要观察指标：①大鼠bcl-2基因cDNA克隆与纯化。②bcl-2基因cDNA与pMD18-T载体的连接、转化、鉴定阳性克隆及测序结果。 结果：在筛选的阳性克隆中扩增到大鼠bcl-2基因，DNA序列分析结果与Genebank中序列相比，同源性为99%。 结论：高鸟嘌呤与胞嘧啶含量基因的扩增属于困难聚合酶链反应，实验采用改进技术成功克隆了大鼠bcl-2基因，此技术也适用于其他富含鸟嘌呤与胞嘧啶的基因快速扩增。     

内参基因β-actin质粒标准品的构建

为构建检测内参基因β-actin mRNA表达水平差异的标准品，以成人外周血细胞的总RNA为模板、Random 6 mers为引物反转录合成cDNA，用该cDNA为模板PCR扩增人β-actin基因相应的cDNA片段，构建PMD-18-β-actin重组质粒，鉴定测序后，用荧光定量PCR制作标准曲线。结果外周血提取的总RNA完整性良好，构建的β-actin质粒经PCR扩增后得到一186 bp的清晰条带，测序结果与目的片段完全一致，且质粒的原始浓度为2.39×1013 copies/mL，倍比稀释至2.0×104 copies/mL均能得到良好的标准曲线（R2=1），提示构建β-actin基因荧光定量PCR标准质粒成功。     

构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组反转录病毒表达载体pLXSN-Kozak-EGFP及鉴定

背景：增强型绿色荧光蛋白作为报告基因可在活细胞中表达发光蛋白。研究表明通过促进表达增强的Kozak序列可促进基因编码的蛋白质在真核细胞中的表达。 目的：构建含增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,并对此重组载体进行鉴定。 方法：用聚合酶链反应方法从含增强型绿色荧光蛋白基因的表达载体pEGFP-N1上高保真克隆出EGFP基因,通过分子克隆技术将目的基因重组至反转录病毒表达载体pLXSN。用菌斑快速聚合酶链法筛选阳性重组子,针对目的基因插入载体的方向设计鉴别插入方向的引物,用聚合酶链反应法、限制性酶法鉴定目的基因及连接的正向性,并对pLXSN-Kozak-EGFP重组载体进行DNA测序分析。 结果与结论：从pEGFP-N1载体中克隆出上游含Kozak序列的EGFP基因,目的条带大小约750 bp。构建的pLXSN-Kozak-EGFP重组子经菌落PCR鉴定,750 bp处有特异性条带。插入方向经PCR鉴定,350 bp处有特异性条带。限制性内切酶法鉴定,750与6 000 bp处有特异性条带。DNA测序比对结果表明克隆的目的基因与Kozak-EGFP一致性为100%。结果提示实验成功构建了含EGFP报告基因与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,且插入方向为正向。     

人骨形态发生蛋白4成熟肽cDNA的克隆及测序

背景：研究表明骨形态发生蛋白4的骨诱导能力最强，但在组织中含量甚微。 目的：克隆人骨形态发生蛋白4成熟肽基因。 方法：从人胎盘组织中提取信使核糖核酸，根据基因库人骨形态发生蛋白4基因序列合成两条引物，利用一步法反转录聚合酶链式反应技术扩增出人骨形态发生蛋白4成熟肽的基因序列，将聚合酶链反应扩增产物基因片段连接克隆载体质粒中转化大肠杆菌DH5α进行克隆筛选鉴定及测序。 结果与结论：琼脂糖凝胶电泳检测反转录聚合酶链式反应产物及阳性克隆质粒经双酶切产物显示一长约370 bp的条带，脱氧核糖核酸测序结果与基因库中的序列相符。结果证实，利用反转录聚合酶链式反应技术可成功的从人胎盘组织中克隆出人骨形态发生蛋白4成熟肽基因。     

转化生长因子β1基因克隆及重组真核表达质粒的构建*★

背景：通过基因转移方法研究某一外源性基因在细胞中的作用是目前分子生物学常用的技术手段，与病毒载体相比，应用pcDNA4.0-TGF-β1真核表达质粒的转染方法无遗传毒性和细胞毒性，有更高的安全性。 目的：通过克隆转化生长因子β1基因，观察构建重组转化生长因子β1基因真核表达质粒的可行性。 设计、时间及地点：以细胞为观察对象的体外实验，于2007-03/2008-02在河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室完成。 材料：2月龄清洁级健康SD大鼠，雌雄不拘，用于分离细胞中RNA。 方法：从大鼠骨髓细胞中分离提取转化生长因子β1的mRNA，反转录-聚合酶链反应扩增后，克隆入pGEM-T载体，PCR鉴定重组子；酶切下目的基因转化生长因子β1，再亚克隆入载体pcDNA4.0质粒，酶切鉴定亚克隆重组子并进行DNA序列分析。 主要观察指标：TGF-β1cDNA、pGEM-T-TGF-β1和重组子pcDNA4.0-TGF-β1的表达。 结果：经过反转录-聚合酶链反应扩增得到TGF-β1 cDNA条带；PCR扩增鉴定得到pGEM-T-TGF-β1。酶切鉴定得到亚克隆重组子pcDNA4.0-TGF-β1，经测序鉴定证实插入DNA序列与设计完全一致。 结论：成功克隆大鼠转化生长因子β1基因，并构建出重组转化生长因子β1真核表达载体。     

中国南方汉族人群HLA-A，B，DRB1基因测序分型模棱两可结果的分布及其解决方案

背景：聚合酶链式反应-直接测序分型技术被誉为HLA分型的金标准，在临床移植配型和骨髓库供者的大规模HLA分型中逐渐被广泛采用，但该方法的最大缺点是存在较高比例的模棱两可分型结果，故亟待寻找并建立适合中华骨髓库大规模供者HLA-测序模棱两可分型结果的解决方案。 目的：调查中国南方汉族人群HLA-A，B，DRB1基因测序分型中模棱两可结果的分布状况，评估其可能的解决方案。 设计、时间及地点：观察测量实验，2007-08/2008-08在深圳市血液中心输血医学研究所免疫遗传重点实验室完成。 对象：选择深圳骨髓库的汉族骨髓供者416名，供者民族和籍贯按照自述原则确定。 方法：采用聚合酶链反应-直接测序分型方法对416名汉族供者的HLA-A，B，DRB1基因进行测序分型，分析3个基因座模棱两可分型结果的分布情况，并分别采用高分辨聚合酶链反应-序列特异性引物法和杂合性模棱两可引物分离法进行解决；采用直接计数法统计基因频率，计算真实等位基因的相对概率。 主要观察指标：416名供者HLA-A，B，DRB1基因直接测序分型结果的分布。HLA-A，B，DRB1基因测序模棱两可分型结果的分类及分布。序列特异性引物法及杂合性模棱两可引物分离法对模棱两可分型结果的解决能力。 结果：80.29%的标本其HLA-A，B，DRB1基因出现模棱两可结果。80%左右的HLA-A，B基因和不足40%的HLA-DRB1基因模棱两可分型结果可以采用杂合性模棱两可引物分离法解决，其他则需要高分辨聚合酶链反应-序列特异性引物法解决。根据等位基因频率计算553个模棱两可等位基因组合中，75%的真实等位基因组合的相对概率大于98%。 结论：杂合性模棱两可引物分离法和高分辨聚合酶链反应-序列特异性引物法分别对位于HLA-A，B和HLA-DRB1基因检测区内、外的模棱两可分型结果具有较高的解决能力，二者互为补充；在大规模供者HLA分型中应用频率数据解决模棱两可结果有一定的应用价值。     

精神发育迟滞相关基因CDKL3对神经元树突棘形态发育的影响

目的 探讨精神发育迟滞相关基因CDKL3在神经元树突棘生长形成中的作用,以及CDKL3失活与精神发育迟滞间的内在联系.方法 采用反转录实时定量聚合酶链反应(RT-realtime Quantitive PCR)方法检测内源性CDKL3基因在小鼠中枢神经系统发育中 mRNA水平的时空表达,采用RNA干扰技术和免疫荧光组化...     

瞬时感受电位基因家族成员TRPV4在大鼠睾丸组织中的表达

背景：瞬时感受电位(transient receptor potential，TRP)通道在人体遍布多种组织和细胞，并参与人体几乎所有的生理功能和许多病理变化。 目的：观察瞬时感受电位基因亚家族成员TRPV4 在大鼠睾丸组织中的表达。 设计、时间及地点：单一样本观察。实验于2007-03/2008-04在广东省人民医院医学研究中心完成。 材料：SD 大鼠5只；TRPV4 引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。 方法：选用SD 大鼠，取20 mg睾丸组织，用RNAprep_动物组织/细菌总RNA提取试剂盒提取总RNA，取1 μg总RNA，用于合成cDNA。 主要观察指标：用常规反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学染色检测TRPV4 在大鼠睾丸组织中的表达。 结果：常规反转录-聚合酶链反应方法检测到在TRPV4 的泳道中可见一条带，大小与期望长度符合；免疫组织化学染色可见TRPV4 阳性片中较成熟的生精细胞和支持细胞为黄褐色。 结论：TRPV4 在睾丸组织上有表达，主要表达在较成熟的生精细胞和支持细胞上。