脂质体介导增殖细胞核抗原反义寡核苷酸抑制人肝癌细胞增殖的实验研究

目的 观察脂质体介导增殖细胞核抗原（PCNA）对肝癌细胞增殖的影响。方法：根据PCNA cDNA序列设计合成与PCNAmRNA AUG起始密码子后的18位碱基序列互补的PCN反义寡核苷酸，脂质体介导转染人肝癌细胞析，通过细胞生长曲线测定，MTT比色法检测PCNA反义寡核苷酸对人肝癌细胞的生长抑制率，比较阳离子脂质体介导转染法与直接转染法的区别。结果 PCNA反义寡核苷酸作用后的肝癌细胞、生长明显受到抑制。应用阳离子脂质体介导转染能显著提高PCNA反义寡核苷酸的抑增殖效应。结论 利用阳离子脂质体介导转染PCNA反义寡核苷酸能显著提高对人肝癌细胞增殖的抑制效应。     

脂质体介导的c-erbB-2反义寡核苷酸转染小鼠乳腺癌TM40D细胞的效率及作用

目的 探讨阳离子脂质体介导的c-erbB-2反义寡核苷酸(ODNs)转染小鼠乳腺癌TM40D细胞的效率及其对细胞增殖、凋亡的影响。方法 应用流式细胞仪及荧光显微镜观察反义ODNs在1、2、4、6h的转染效率以及在细胞内的分布。应用四甲基偶氮唑蓝比色分析法(MTT)检测反义ODNs对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测对细胞凋亡的影响。结果 脂质体可促进反义ODNs进入细胞内,无脂质体介导的反义ODNs转染细胞的效率随转染时间延长逐步增加,而脂质体介导的反义ODNs转染细胞4h效率达到高峰72．23％,6h维持在高水平。脂质体可使反义ODNs在细胞内有效分布,进入细胞核。MTT法检测结果表明c-erbB-2反义ODNs抑制细胞增殖,抑制率为50．24％。流式细胞仪检测结果表明c-erbB-2反义ODNs促进细胞凋亡,正常细胞组凋亡率为9．13％,脂质体组为9．29％,脂质体 反义ODNs组为38．50％。结论 脂质体可促进反义ODNs进入细胞及在细胞有效分布,c-erbB-2反义ODNs可抑制乳腺癌TM40D细胞的增殖及促进癌细胞凋亡。     

脂质体生存素反义寡核苷酸抑制胃癌裸鼠皮下移植瘤生长的作用

目的探讨脂质体生存素反义寡核苷酸(ASODN)对人胃癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用及机理。方法将24只裸鼠建立人胃癌细胞系HS-746T皮下移植瘤模型,用不同的转染液处理后随机分成6组：空白对照组,脂质体组,正义链组,100、200和400nmol／L反义链组(ASODN组)。于注射相应试剂后2,4,8,12,16,20d观测裸鼠移植瘤体积,计算抑瘤率和肿瘤缩小率,观察移植瘤细胞形态变化,免疫组化SP法检测生存素的表达,并用逆转录聚合酶链反应技术(RT—PCR)和Western blot蛋白免疫印迹法比较治疗后不同时间各组肿瘤组织中生存素mRNA和蛋白表达的变化。结果注射后20d空白组、脂质体组和正义链组裸鼠的抑瘤率无明显差异,而ASODN组移植瘤的体积随着时间和浓度的增加而减小,肿瘤缩小率则增大,抑瘤率均大于对照组,400nmol／LASODN组抑瘤率最大为93％。光镜下见ASODN组移植瘤凋亡细胞数增多,生存素表达减弱,6例(6／12)肿瘤组织有坏死液化灶。各ASODN组均能够下调移植瘤细胞生存素mRNA含量,抑制生存素蛋白表达,注射20d后400nmol／L ASODN组蛋白表达为空白对照组的36．8％。结论生存素基因反义寡核苷酸能够通过诱导人胃癌裸鼠皮下移植瘤细胞凋亡,下调生存素mRNA和蛋白的表达,抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。     

脂质体介导的聚集素反义寡核苷酸对膀胱癌EJ细胞的作用

目的探讨clusterin对膀胱癌EJ细胞生物学特征的影响. 方法应用脂质体包裹的clusterin反义寡核苷酸转染EJ细胞,阻断其表达,通过3′端末端标记、MTT试验、伊红排斥实验等方法观察clusterin反义基因对EJ细胞增殖、凋亡、坏死等生物学行为的影响. 结果转染clusterin反义寡核苷酸组(反义组)EJ细胞凋亡增加,第5天达峰,凋亡率80%,与转染clusterin正义寡核苷酸组(正义组)比较,差异有显著性意义(P<0.05).反义组细胞死亡率增加,以转染后1～4 d明显(13.8%～33.3%),显著高于相应正义组(P<0.05).反义组细胞增殖活性降低,以转染后第6、7天明显,显著高于相应正义组(P<0.05). 结论 clusterin是重要抗凋亡因子,其表达与膀胱癌细胞的生存、增殖、抗凋亡发展密切相关.     

IGF-1R硫代反义寡核苷酸抗人肝癌裸鼠原位移植瘤的研究

目的探讨IGF-1R硫代反义寡核苷酸（IGF-1R APSODN）对人肝癌裸鼠原位移植瘤的治疗效果及毒性作用。方法构建40只人肝癌裸鼠原位移植瘤模型，设溶剂对照组、IGF-1R APSODN（75，50，25mg／kg）三剂量组及氟尿嘧啶阳性对照组，各组裸鼠静脉给药25次，用药期间监测裸鼠体重变化，实验结束后行全血分析，肝肿瘤体积、重量测量，计算抑瘤率，病理组织学检查。重复实验一次。结果两次实验IGF-1R APSODN各剂量组肝肿瘤体积和重量均小于溶剂对照组，其中75mg／kg组抑瘤率分别为76．36％、71．81％，50mg／kg组抑瘤率分别为55．65％、61．74％，25mg／kg组抑瘤率分别为47．72％、50．34％。结论IGF-1R APSODN是一种高效、低毒的抗肝癌生物学药物。     

脂质体转染survivin反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞凋亡的影响

目的探讨survivin反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN)对人胰腺癌细胞PANC-1增殖的影响。方法设计并合成特异性靶向ASODN及正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotides,SODN)。ASODN经FAM标记,以阳离子脂质体为载体转染至体外培养的PANC-1细胞中(ASODN组),另设空白对照组(正常培养的细胞)、脂质体空转染组(脂质体转染的为正常的培养基)及SODN组作为对照组。采用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测转染率,依次筛选最佳细胞接种数量、ASODN浓度和脂质体的量;荧光显微镜观察转染后的细胞;MTT法测定转染后细胞的抑制率;透射电镜观察转染后细胞的超微结构变化;吖叮橙(AO)与溴化乙啶(EB)染色观察转染后细胞凋亡的形态学改变;DNA凝胶电泳观察转染后细胞凋亡情况;FCM测转染后细胞凋亡率及细胞周期;免疫组织化学技术检测转染后survivin蛋白的表达。结果①ASODN浓度为50、100、150、200、250、400、600及800 nmol/L时,转染率分别为31.9%、37.4%、41.4%、52.6%、24.2%、11.4%、16.1%和15.5%;接种细胞数量为2×104、2×105及2×106个/孔时,转染率分别为12.0%、50.8%和11.2%;转染所用的脂质体量为2、3及4μl时,转染率分别为58.8%、34.0%和23.6%。②转染ASODN后荧光显微镜发现转染后细胞之间空隙加大,形态变圆,贴壁细胞生长较少,部分漂浮于培养液中。③ASODN组24、36及48 h后细胞抑制率明显高于各对照组(P0.05),随着时间延长,细胞抑制率增高(P0.05)。④ASODN组电泳图上凋亡细胞呈明显的"梯状"条带。⑤AO与EB染色观察ASODN组细胞出现凋亡的形态学改变,其核染色质均高度聚集或核染色呈新月形聚集于核膜一边,核仁消失。⑥ASODN组细胞凋亡率为(38.10±3.4)%,明显高于SODN组的(4.16±1.7)%(P0.05)。⑦ASODN组细胞周期阻滞于G2/M期。⑧转染后ASODN组survivin蛋白表达明显低于各对照组(P0.05)。结论 survivin ASODN转染至胰腺癌细胞最佳转染条件为接种细胞数量为2×105个/孔,ASODN的浓度为200 nmol/L,脂质体的量为2μl;survivin ASODN能明显下调survivin蛋白的表达,抑制胰腺癌PANC-1细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。     

β1整合素反义寡核苷酸对人胰腺癌BXPC-3细胞体外侵袭力的影响

目的观察β1整合素反义寡核苷酸（ASODN）对人胰腺癌BXPC-3细胞体外侵袭力的影响。方法采用脂质体将不同浓度β1整合素ASODN转染到人胰腺癌BXPC-3细胞中，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）、Western印迹法和Transwell侵袭室方法分别检测细胞β1整合素mRNA、蛋白表达水平及体外侵袭能力。结果与对照组相比，32～128mg／LASODN转染后可抑制β1整合素mRNA和蛋白的表达（P〈0．05），64mg／LASODN转染使BXPC-3细胞体外侵袭力明显下降（P〈0．05）。结论靶向β1整合素的ASODN可有效抑制其在人胰腺癌BXPC-3细胞中的表达。并降低癌细胞体外侵袭力。     

电离辐射促脂质体介导的基因在胰腺癌细胞中转移和表达的实验性研究

我们采用联合辐射的方法 ,将脂质体介导的外源基因导入胰腺癌细胞 ,以观察外源基因在胰腺癌细胞中的转移和表达的情况。为胰腺癌的基因治疗提供新的思路和探索。材料和方法1.细胞系和细胞培养 :人胰腺癌细胞系PC 3(源自于胰头中分化腺癌 ,协和医科大学病理教研室惠赠 )培养于含10 %灭活新生牛血清 (杭州四季青生物工程材料研究所 )的RPMI 16 4 0 (GIB CO)培养液中 ,37℃ ,饱和湿度 ,5 %CO2 的条件下培养传代。2 .PC 3细胞活存剂量效应曲线 :采用辐射后细胞集落形成实验 :将指数生长期的PC 3细胞用 0 2 5 %的胰酶消化 ,制成单细胞悬…     

hTR反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞Panc-1生物特性及端粒酶活性的影响

端粒酶持续激活导致恶性肿瘤细胞获得无限增殖能力 ,人端粒酶RNA组分(hTR )对端粒酶活性维持具有重要作用 ,破坏端粒酶RNA组分的模板功能 ,即可抑制端粒酶活性[1] 。我们针对hTR模板区设计合成反义寡核苷酸 (A SODN) ,观察其对Panc 1端粒酶活性及细胞生长的影响 ,为胰腺癌基因治疗提供新的实验依据。一、材料与方法1.核苷酸设计与合成 :根据hTR模板区序列设计一条互补于起始密码区的反义片段 ,并随机设计合成一段正义寡核苷酸 (SODN)序列作为对照 ,均由上海生工公司进行合成。2 .细胞培养与转染 :Panc 1细胞株购自中国协和医科大…     

端粒酶反义RNA基因转染抑制裸鼠人膀胱癌移植瘤生长的研究

目的　观察端粒酶反义RNA基因转染对裸鼠膀胱癌移植瘤细胞生长的影响。方法将脂质体介导的端粒酶反义RNA真核表达载体 (pBBS hTR)、空载体 ( pBBS 2 12 )及生理盐水注入移植瘤体内 (每天 3 0 0 μl,共 7d) ,应用端粒酶活性聚合酶链反应 酶联免疫吸附试验 (PCR ELISA)、苏木素 伊红 (HE)染色、透射电镜等连续观察 6周移植瘤组织细胞端粒酶活性和生长变化。结果　注射转染pBBS hTR组和空载体组瘤体积抑制率分别为 48.7%和 2 .8% (P <0 .0 5 )。转染pBBS hTR组端粒酶活性降低 ,细胞生长受抑制。电镜观察见典型凋亡特征。 结论　端粒酶反义RNA基因瘤体内注射转染有效地抑制裸鼠人膀胱癌细胞生长 ,具有潜在临床应用价值。     

survivin反义寡核苷酸对人胆管癌裸鼠移植瘤及c-myc和cyclin D1表达的影响

survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）家族的新成员，除了在胸腺和胚胎组织中有微量表达外，在终末分化的组织中不表达或极少表达，但可过度地表达于多种人类恶性肿瘤组织中。本研究采用特异性的靶向survivin反义寡核苷酸（survivin ASDON），用人胆管癌细胞株QBC939，建立胆管癌裸鼠移植瘤模型，观察局部注射survivin ASDON对移植瘤生长及survivin蛋白表达的影响，同时观察survivin ASDON对cmyc和cyclin D1蛋白表达的影响。     

β1整合素反义寡核苷酸对人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用

目的探讨β1整合素反义寡核苷酸（ASODN）对裸鼠人胰腺癌移植瘤生长和基因表达的影响.方法建立裸鼠人胰腺癌皮下移植瘤模型,随机分为3组：对照组（皮下注射脂质体和转染液）、非特异序列（RODN）组（皮下注射RODN、脂质体和转染液）和ASODN组（皮下注射ASODN、脂质体和转染液）.治疗后计算抑瘤率和肿瘤缩小率,检测肿瘤中β1整合素mRNA和蛋白表达.结果RODN组、ASODN组抑瘤率分别为4.75%和72.70%,ASODN组肿瘤缩小10.91%.与其他两组比较,ASODN组裸鼠肿瘤中β1整合素mRNA和蛋白表达水平明显降低.结论靶向β1整合素的反义寡核苷酸对人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长具有一定的抑制作用,可能为胰腺癌治疗提供新的方法.     

脂质体介导的端粒酶反义寡核苷酸体外转染率及对人膀胱癌EJ细胞的影响

目的通过以脂质体为载体介导端粒酶反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,asODN)转染人膀胱癌EJ细胞,促进反义寡核苷酸对膀胱癌EJ细胞的生长抑制。方法利用脂质体为载体将针对端粒酶RNA模板区的asODN转染膀胱癌EJ细胞;荧光显微镜观察细胞转染率;PCR-ELISA法测定端粒酶活性;MTT法检测反义寡核苷酸对膀胱癌细胞的抑制。结果脂质体介导的asODN在膀胱癌EJ细胞中的转染率1/2h、4h、8h分别为15%、56%、80%,并且细胞的端粒酶活性和细胞生长明显被抑制,与对照组比较,具有显著性差异(p(0.05)。结论脂质体介导的端粒酶asODN能够有效抑制膀胱癌EJ细胞端粒酶活性和生长,可应用于实验性肿瘤基因治疗研究和端粒酶与膀胱癌关系的进一步研究。     

转染血小板源生长因子和增殖细胞核抗原反义寡核苷酸抑制移植血管狭窄的实验研究

目的　探讨联合应用血小板源生长因子(PDGF)和增殖细胞核抗原(PCNA)反义寡核苷酸(AODN)防止移植血管狭窄的作用。方法　将同一只兔的左、右髂外动脉(各1 0cm)对换移植,移植血管用PDGF- AODN和PCNA -AODN转染;移植血管病理切片后测量其内膜厚度、内膜面积和移植血管狭窄率,并分别用原位杂交组织化学和免疫组织化学染色计数PDGF和PCNA阳性细胞数。结果　PDGF- AODN加PCNA- AODN组的移植血管内膜厚度、内膜面积、管腔狭窄程度和PDGF阳性细胞及PCNA阳性细胞数均显著低于对照组(P<0 .01),而且亦明显低于单独转染PDGF- AODN组或PCNA -AODN组(P<0. 05 ),PDGF AODN组和PCNA AODN组间差异无显著意义(P>0. 05 )。结论　联合应用PDGF AODN和PCNA- AODN能有效抑制血管平滑肌细胞增殖,阻止内膜增生,防止移植血管狭窄。     

辐射促进胰岛素样生长因子-1受体反义寡核苷酸对裸鼠移植性实体瘤的杀伤作用

目的 探讨辐射促转染的胰岛素样生长因子-1受体(IGF—1R)反义寡核苷酸(ASON)对肿瘤组织的杀伤效果。方法 采用裸鼠移植瘤局部2Gy^60Co-γ辐射后lh，瘤内注射脂质体介导的IGF-1R ASON，对实验组和对照组裸鼠抑瘤率和抑瘤曲线进行检测。结果 对照组与联合辐射组、未联合辐射组肿瘤生长曲线差异有显著性(P＜0．01)，联合辐射组与未联合辐射组肿瘤生长曲线差异有显著性(P＜0．05)。对照组与联合辐射组、未联合辐射组肿瘤体积和肿瘤重量差异有显著性(P＜0．01)，联合辐射组与未联合辐射组肿瘤体积和肿瘤重量差异有显著性(P＜0．05)。联合辐射组肿瘤重量抑制率为90．68％，肿瘤体积抑制率为95．25％。结论 辐射促转染的IGF—1R ASON对肿瘤细胞具有较强的杀伤作用，并能有效抑制肿瘤生长。     

survivin基因反义寡核苷酸对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡与细胞周期的调控作用

目的研究survivin基因反义寡核苷酸转染对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞周期、细胞凋亡的作用及其可能的作用机制。方法采用脂质体介导survivin基因反义寡核苷酸转染人肝癌SMMC-7721细胞,透射电镜观察细胞超微结构,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡,RT-PCR方法检测cyclin B1 mRNA的表达。结果survivin反义寡核苷酸转染后细胞内cyclin B1表达由0.36±0.03增加至0.91±0.03,同时G2-M期细胞及凋亡细胞比例分别由5.81%及0.7%明显增加至42.11%及31.35%,同时细胞超微结构呈典型凋亡样改变。结论survivin基因反义寡核苷酸转染细胞后可以通过诱导cyclinB1的表达,导致G2-M期阻滞,从而诱导细胞凋亡的发生。survivin基因反义寡核苷酸转染可以作为治疗肝癌的重要新方法。     

反基因及反义寡核苷酸体外抗前列腺癌作用的研究

目的探讨三螺旋形成寡核苷酸(TFO)和反义寡核苷酸(ASO)对前列腺癌细胞雄激素受体(AR)表达和细胞增殖的影响。方法设计并合成针对AR基因的TFO和ASO,经脂质体介导转染前列腺癌细胞株LNCaP。MTT法检测细胞增殖活性,RTPCR检测AR基因表达,免疫组化法检测AR蛋白表达,放射免疫分析检测PSA表达。结果转染后24、48、72h,TFO组LNCaP细胞ARmRNA平均表达水平分别为0.25、0.33、0.46,显著低于ASO组的0.44、0.54、0.60,P<0.05;TFO对LNCaP细胞的生长抑制率(51.8%、65.8%、36.2%)显著高于ASO(28.8%、42.6%、17.5%),P<0.05。TFO对AR蛋白表达的抑制作用强于ASO。转染后24hPSA表达水平[(0.5±0.1)ng/ml]显著低于ASO组[(0.8±0.2)ng/ml],P<0.05。结论在LNCaP细胞TFO对AR表达和癌细胞增殖的抑制作用明显强于ASO,反基因策略对于前列腺癌的治疗具有重要研究价值。     

反义TGF-β1抑制兔耳增生性瘢痕的实验研究

目的：探讨反义TGF-β1脱氧寡核苷酸对增生性瘢痕动物模型伤口愈合中瘢痕生成的抑制作用，研究局部使用反义。TGF-β1的有效给药途径。方法：成年日本大耳白兔20只，建立兔耳腹侧面增生性瘢痕模型。采用组织形态学的方法对比研究反义TGF-β1在兔耳增生性瘢痕形成中的影响，并用原位杂交法技术检测兔耳增生块内TGF-β1 mRNA、Ⅰ型胶原蛋白(colla-genⅠ)mRNA、Ⅲ型胶原蛋白(collagenⅢ)mRNA的表达水平。结果：兔左耳增生性瘢痕局部注射反义TGF-β1后，按时间段取材，HE和Masgon染色显示真皮层变薄，成纤维细胞数量明显减少，胶原排列趋于一致。增生块的相对增生高度低于对照组。原位杂交显示TGF-β1 mRNA、collagenⅠmRNA、collagenⅢ mRNA阳性细胞表达率明显降低。结论：反义TGF-β1能抑制兔耳增生性瘢痕的增殖过程，使瘢痕组织纤维化程度明显减轻。局部注射裸DNA治疗瘢痕的给药途径是可行的。     

腺病毒介导反义c-myc增强骨肉瘤细胞对顺铂化疗敏感性的实验研究

目的构建表达反义cmyc的重组腺病毒,探讨重组腺病毒介导反义cmyc转染的人骨肉瘤MG63细胞对顺铂化疗敏感性的影响。方法应用基因重组技术,将约720bp的人cmyccDNA反向克隆到腺病毒载体,经重组、扩增、病毒包装后构建表达反义cmyc的重组腺病毒(AdAscmyc),并在体外转染骨肉瘤MG63细胞,采用瑞士染色、吖啶橙染色、蛋白免疫印迹(WesternBlot)、细胞体外增殖抑制试验(MTT)、流式细胞仪(FCM)等观察细胞形态、检测cmyc蛋白表达、瘤细胞体外增殖抑制、凋亡及细胞周期,分析AdAscmyc体外转染的骨肉瘤MG63细胞对顺铂化疗敏感性。结果成功构建AdAscmyc,滴度可达2×109pfu/ml,体外转染MG63细胞48h后,可降低cmyc蛋白表达,并与浓度为2.0、5.0μg/ml的顺铂作用2h后,可抑制MG63细胞的体外增殖,抑制率分为33.4%、54.2%,与对照腺病毒(AdLacZ)转染组相比差异有统计学意义(P<0.05),FCM检测证实AdAscmyc的转染可诱导骨肉瘤细胞凋亡,且顺铂治疗后凋亡比例增加,细胞周期分析显示AdAscmyc转染的骨肉瘤细胞出现G2/M期阻滞。结论腺病毒介导反义cmyc能诱导骨肉瘤MG63细胞凋亡并增加MG63细胞对顺铂化疗敏感性。     

缺氧诱导因子-1α反义寡核苷酸对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响

目的研究缺氧诱导因子(HIF)1α反义寡核苷酸(ASODN)对人胶质瘤细胞化疗药物敏感性的影响。方法人工合成HIF1αASODN经阳离子脂质体包裹后瞬时转染人胶质瘤细胞株U251。采用RTPCR和免疫细胞化学检测转染后HIF1α基因表达,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖抑制率(PI),亚啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色及末端标记法(TUNEL)检测U251细胞转染后顺铂诱导的细胞凋亡指数(AI)。结果HIF1αASODN转染使U251细胞HIF1α基因表达明显下调,其AI和PI分别为(42.0±3.5)%和(72.5±4.8)%,,与各对照组比较均差异有统计学意义(P<0.01),而空白对照组,脂质体组和SODN组的AI和PI分别为(7.1±0.3)%,(8.2±0.2)%,(12.3±0.4)%和(30.7±2.9)%,(34.2±3.5)%,(38.6±3.1)%,AI和PI在各对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论阳离子脂质体转染HIF1αASODN具有促进化疗药物诱导胶质瘤U251细胞凋亡及增强化疗药物敏感性作用。