粉防己碱对培养皮层神经元NMDA兴奋毒性损伤的保护作用

目的研究粉防己碱（Tet）对神经细胞兴奋性氨基酸N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）损伤的保护作用。方法采用原代培养的大鼠皮层神经细胞模型,给予NMDA直接损伤,加入不同浓度的粉防己碱,测定神经细胞损伤MTT变化。结果粉防己碱对兴奋性氨基酸损伤保护作用在10^-8～10^-6mmol／L范围内存在非剂量线性相关。结论Tet通过多靶点对神经元兴奋损伤产生拮抗作用,离体细胞模型中5×10^-7mol／L浓度具有最佳的保护效果。     

白血病病人红细胞膜蛋白组份分析

白血病是造血系统的一件恶性疾病，以体内大量白血病细胞广泛无控制增生为特征，部分病例有幼稚和形态异常的红细胞增生．用十二烷基磷酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电脉（SDS－PAGE）对白血病和正常人进行红细胞膜蛋白组份分析，发现非淋巴细胞性白血病有带1、带2、带5蛋白高于正常人[1]．     

乳腺癌细胞膜蛋白的SELDI-TOF-MS分析

目的比较乳腺癌细胞株和正常乳腺上皮细胞膜蛋白指纹图谱,为乳腺癌亚细胞蛋白组学的研究奠定基础。方法试剂盒提取两株乳腺癌细胞株MDA-MB-231,MCF-7及一株乳腺正常上皮细胞HBL-100的膜蛋白,SEL-DI-TOF-MS分析蛋白指纹图谱,寻找差异蛋白。结果在分子量2kD-100kD范围内3株细胞均可检测到近100个蛋白点,MDA-MB-231和MCF-7与HBL-100相比,膜蛋白差异点分别为32个和34个(P<0.05),其中7.8kD,8.3kD和8.8kD的蛋白在两株癌细胞中表达均降低,9.6kD的蛋白在两株癌细胞中表达均增高。结论 SELDI-TOF-MS可以快速灵敏地检测到乳腺癌亚细胞蛋白水平的差异,为乳腺癌早期诊断提供依据。     

胚胎大鼠原代神经干细胞培养方法的改进

背景:神经干细胞增殖分化受体内外微环境的影响,不同细胞培养液对细胞的增殖分化有不同的作用.目的:改进传统上应用无血清培养液培养原代神经干细胞的方法,寻找一种快速便捷的培养方式.设计、时间和地点:随机对照细胞实验,于2005-11/2006-09在青岛大学医学院脑科研究所完成.材料:选用孕后12～16 d 的Wistar大鼠10只,取胎鼠脑组织制成细胞悬液.方法:将配置的细胞密度约1×109个/mL滤液接种入4个50 mL细胞培养瓶,分为2组:对照组和实验组,每组2个培养瓶.对照组加入DMEM/F12、2?7型人类白细胞抗原、20 mg/L的碱性成纤维细胞生长因子,20 mg/L的表皮生长因子无血清培养液,实验组加入DMEM/F12、5%胎牛血清,两三天后换为与对照组相同的无血清培养液.主要观察指标:应用倒置显微镜和免疫细胞化学法观察两组神经干细胞的增殖生长状况.结果:神经干细胞生长状态:①两组大多数细胞表达神经干细胞的特征性标志抗原神经巢蛋白,免疫染色呈阳性反应.②实验组神经干细胞的聚球速度明显快于对照组,可提前三四天观察到神经干细胞球.③两组细胞数量基本无差异,实验组细胞球体较对照组大.经血清培养液诱导分化后部分呈神经元特异性烯醇酶阳性,部分呈神经胶质酸性蛋白阳性,表明神经干细胞已分化为神经元样细胞和神经胶质细胞.结论:含血清培养液预先培养可以加快神经干细胞增殖生长速度.     

NMDA受体拮抗剂剂量与脑缺血再灌注大鼠海马内源性神经干细胞的增殖

背景: 脑缺血再灌注后,过度释放的兴奋性氨基酸可通过NMDA受体激活内源性神经干细胞,促使其增殖、分化,修复神经细胞,但同时也导致细胞内钙离子超载,引起神经细胞的损伤.通过控制NMDA受体活化的程度,刺激内源性神经干细胞激活的同时把损伤减到最小.目的: 观察NMDA受体拮抗剂MK-801质量浓度对脑缺血再灌注大鼠海马内源性神经干细胞增殖的影响.方法: 健康雄性SD大鼠54只随机数字表法分为对照组(不进行任何处理)、手术组(缺血模型制作)及不同剂量MK-801组.采用大鼠四条血管阻断方法(Pulsinelli-4VO法)制备大鼠全脑缺血再灌注模型.不同浓度MK-801组在模型制作前30 min按照0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2mg/kg侧脑室注射MK-801.Western-blot、RT-PCR技术检测各组nestin蛋白及mRNA水平及表达.结果与结论: MK-801剂量在0.8 mg/kg以下时,nestin mRNA及蛋白的表达差异无显著性意义(P>0 05),呈现高表达;当剂量为0.8 mg/kg时,可明显抑制内源性神经干细胞增殖;在0.8mg/kg以上,对神经干细胞的抑制作用随着剂量的升高呈递增趋势;在1.2 mg/kg时,大鼠有躁动、共济失调等严重不良反应.nestin mRNA表达结果与蛋白表达趋势相吻合.说明MK-801的剂量与脑梗死后神经功能的修复有一定的关系,实验中0.6 mg/kg是一个比较合适的实验应用剂量,在此剂量下既可使MK-801减少兴奋性氨基酸对神经元的毒性作用,保护神经细胞,又使内源性神经干细胞的增殖不受较大影响.     

鞘内注射米诺环素对神经病理性疼痛大鼠脊髓NMDAR1表达的影响

目的:观察鞘内注射特异性小胶质细胞抑制剂米诺环素对神经病理性疼痛大鼠机械痛阈和脊髓NMDAR1受体表达的影响。方法:结扎腰5神经根(SNL)建立大鼠神经病理性疼痛模型。雄性SD大鼠,体重220~260 g。48只大鼠随机分4组(12只/组),sham组:假手术 生理盐水;SNL组:SNL 生理盐水;M sham组:假手术 米诺环素50μg;M SNL组:SNL 米诺环素50μg;分别于术前及术后不同时点用von Frey纤维丝测定四组大鼠的机械撤爪阈值,并在机械痛阈最低点取脊髓腰膨大部进行W estern blot实验半定量检测四组中NMDAR1的表达。结果:SNL组与sham组比较大鼠术后各时点机械缩爪阈值明显下降,并在术后第8天降至最低点(P<0.01)。M SNL组与SNL组比较,术后各时点大鼠机械撤爪阈值增高,脊髓NMDAR1的表达下降(P<0.01)。结论:鞘内给予米诺环素可减轻SNL大鼠的机械痛敏,并抑制脊髓NMDAR1的表达。活化的小胶质细胞可能通过上调脊髓NMDAR1表达而参与了神经病理性疼痛的发生。     

强啡肽致大鼠脊髓损伤与谷氨酸能神经功能关系的研究

为研究脊髓损伤及继发损伤的机理，本实验建立了蛛网膜下腔注射强啡肽A（DynA）致大鼠脊髓损伤的模型。发现兴奋性氨基酸谷氨酸（Glu）受体的亚型-N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂DL－2-氨基-5磷酰戊酸（APV）具有对抗DynA致瘫的显著疗效。又进一步观察了不同浓度DynA（1－17）对离体大鼠脊髓片H－Glu释放的影响。发现高钾去极化引起脊髓片释放3H-Glu是一个Ca2 依赖的过程。低浓度DynA（1－17）10-8mol／L，抑制3H－Glu释放．而10-6mol／L。显著增加释放，无致瘫作用的K阿片受体激动剂U50，488H于上述浓度均明显抑制3H－Glu的释放。结果提示，小剂量DynA（1－17）可能通过降低交触前Ca2 内流抑制Glu释放而镇痛，大剂量DynA（1-17）则通过促进Glu释放并作用于NMDA受体而引起神经损伤。     

氯胺酮对培养胎鼠皮层神经元NMDA兴奋毒性损伤的保护作用

目的研究氯胺酮对培养神经细胞兴奋性氨基酸N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)损伤的保护作用。方法采用原代培养的胎鼠皮层神经细胞模型,给予NMDA直接损伤,加入不同浓度的氯胺酮,测定神经细胞损伤后噻唑蓝(MTT)变化。结果氯胺酮在50～1000μmol/L范围内存在对兴奋性氨基酸损伤的保护作用,非剂量线性相关。结论氯胺酮对神经元NMDA兴奋毒性损伤产生拮抗作用,离体细胞模型中1×102-3μmol/L浓度左右具有保护效果。     

行为训练对大鼠海马梗死灶周围及颞叶皮层NR2B表达的影响

目的研究行为训练对双侧海马梗死大鼠梗死灶周围及颞叶皮层N-甲基-D天门冬氨酸（NMDA）受体2B亚单位（NR2B）表达的影响。方法将54只大鼠随机分为行为训练前、训练7d、14d、21d组；制动前、制动7d、14d、21d组及正常对照组。于造模3d后开始分别给予行为训练或制动，观察不同时间点各组大鼠海马梗死灶周围及颞叶皮层NR2B的表达。结果正常大鼠海马及颞叶皮层内均有NR2B的丰富表达，造模后明显下降，给予行为训练后逐渐增高，较制动组有非常显著性差异（P〈0．01）。结论行为训练能促进海马梗死大鼠梗死灶周围及颞叶皮层内NR2B的表达。     

红细胞膜蛋白异常与膜骨架相关溶血性贫血的发生

红细胞膜为双层磷脂结构,其间镶嵌着多种膜蛋白。这些膜蛋白包括包埋在脂质双分子层中的整合蛋白及存在于膜内侧的细胞膜骨架蛋白,而后者与红细胞膜缺陷所致的     

灯盏花素干预体外培养大鼠脑皮质神经元的存活与生长

背景：神经生长因子在维持中枢神经系统神经细胞的存活、分化,促进其生长、发育,维持其功能方面具有不可替代的作用。 目的：观察灯盏花素对SD大鼠大脑皮质体外培养神经元生长的影响,并初步探讨其机制。 方法：取新生SD大鼠胚胎,取其大脑皮质后,对神经元进行原代培养,随机分为3组,其中灯盏花素组加入10 g/L灯盏花素,对照组加入等量生理盐水,正常组不作任何处理,各组又分为24 h、48 h亚组。对24孔板中各组细胞各时间点采集图像,之后采用RT-PCR技术检测神经生长因子、酪氨酸激酶A mRNA的表达变化。对96孔板中各组细胞不同时间点采用MTT检测神经元生长活力。 结果与结论：正常组和对照组在各时间点细胞数、胞体面积、突起长度及细胞活力无明显差异（P〉0.05）,但正常组及对照组均有随时间点延长,3个指标均上调（P0.05）,灯盏花素组各时间点较正常组和对照组上调（P〈0.05）。提示灯盏花素促进SD大鼠脑源性神经元的存活、生长,其机制可能是通过上调神经生长因子及其受体TrkA的表达发挥作用。     

康复训练对脑梗死大鼠学习记忆与健侧海马神经元NMDA受体通道的影响

目的：探讨康复训练对脑梗死大鼠学习记忆与健侧海马神经元NMDA受体通道动力学特性的影响。方法：将大鼠随机分为模型组、康复组及正常组，分别经过康复训练后，采用细胞贴附式记录海马神经元NMDA受体的单通道电流。结果：康复训练组大鼠海马神经元NMDA受体以35pS通道短开放为主，20pS短开放和长开放通道以及35pS短开放时间和概率与正常组比较无显著意义，无正常组出现的35pS长通道；模型组以20pS通道开放为主，20pS短开放和长开放两个时间常数明显短于康复组同类通道，35pS通道短开放时间常数和开放概率也低于康复组，无35pS长开放通道。结论：康复训练促进脑梗死大鼠学习记忆能力的恢复是通过健侧海马神经元NMDA受体通道特性的改变而实现的。     

人参皂甙Rb1抗新生大鼠大脑皮层神经细胞缺氧性凋亡研究

目的探讨人参皂甙Rb1对体外培养的新生大鼠大脑皮层神经细胞缺氧性凋亡的保护机理。方法应用“Neurobasal加B2 7Supplement”体外培养大鼠大脑皮层神经细胞 ,并在缺氧条件下使用台盼蓝拒染法、Hoechst 3 3 3 42荧光染色法、免疫细胞化学染色法观察人参皂甙Rb1对原代神经细胞的抗凋亡保护作用。结果在 10— 10 0 μg/ml的浓度范围内 ,人参皂甙Rb1能降低缺氧诱导的神经细胞凋亡率 (10 0 μg/ml组 ,P <0 .0 5 ) ,增加缺氧神经细胞Bcl 2蛋白的表达 (5 0— 10 0 μg/ml组 ,P <0 .0 5 ) ,同时减少Bax蛋白的表达 (5 0— 10 0 μg/ml组 ,P <0 .0 5—P <0 .0 0 1) ,提高Bcl 2 /Bax比值 (5 0— 10 0 μg/ml组 ,P <0 .0 5 )。 结论在 5 0— 10 0μg/ml的浓度范围内 ,人参皂甙Rb1通过上调缺氧神经细胞Bcl 2表达和下调Bax表达 ,避免缺氧神经细胞凋亡。     

Calphostin C对培养神经元缺氧后Bcl-2表达及神经元凋亡的研究

目的探讨蛋白激酶C(PKC)对神经元缺氧凋亡的影响及作用机制.方法建立体外培养孕Wister大鼠皮层神经元模型及培养神经元缺氧模型,在此基础上观察神经元存活率、Bcl-2和凋亡DNA表达的规律;然后用3种不同浓度的PKC催化亚基特异性抑制剂CalphostinC预孵育培养神经元后进行缺血处理,观察神经元上述指标的改变.结果随着缺氧时间的延长和CalphostinC浓度的增加,培养神经元的存活数显著下降、Bcl-2免疫组化阳性细胞数明显减少、TUNEL荧光染色平均荧光强度显著升高.结论(1)PKC和Bcl-2均参与了缺氧神经元凋亡;(2)PKC抑制剂CalphostinC可加重缺氧神经元凋亡;(3)PKC的激活在缺氧神经元的凋亡中起保护作用,且该作用可能是通过促进Bcl-2表达实现的.     

Antinociceptive effects of RB101(S), a complete inhibitor of enkephalin-catabolizing enzymes, are enhanced by (+)-HA966, a functional NMDA receptor antagonist: a c-Fos study in the rat spinal cord.

The effects of the S enantiomer of RB101, a complete inhibitor of enkephalin-catabolizing enzymes, alone or in combination with a functional NMDA receptor antagonist, (+)-HA966 were studied on the spinal c-Fos protein expression in the carrageenan model of inflammatory nociception. One hour 30min after intraplantar carrageenan in awake rats, c-Fos immunoreactive (c-Fos-IR) nuclei were preferentially located in the laminae I-II and V-VI of the spinal dorsal horn, i.e., spinal areas containing numerous neurons responding exclusively, or not, to peripheral nociceptive stimuli. RB101(S) (5, 10, 20 and 40mg/kg i.v.) dose-dependently reduced the total number of carrageenan-evoked c-Fos-IR nuclei (r=0.63, P<0.01), with 49+/-3% reduction (P<0.001) for the highest dose. Two highest doses of RB101(S) (20 and 40mg/kg) significantly reduced the number of carrageenan-evoked c-Fos-IR nuclei in both superficial I-II (32+/-7% and 36+/-5% reduction, respectively, P<0.05 for both) and deep V-VI (42+/-6% and 61+/-2% reduction, respectively, P<0.001 for both) laminae. The effects of RB101(S) were naloxone-reversible. Combination of low doses of RB101(S) (2.5 or 10mg/kg i.v.) and an inactive dose of (+)-HA966 (2.5mg/kg s.c.) produced supra-additive effects (39+/-4% and 51+/-5% reduction of the total number of c-Fos-IR nuclei, respectively, P<0.001 for both). These effects were partially reversed by naloxone. These results provide evidence for the potent effects of combination of RB101(S) and (+)-HA966. Considering the absence of major opioid side effects of RB101(S) and the marked increase of its antinociceptive effects by NMDA receptor antagonist, this type of drug combination could have beneficial therapeutical application.     

P物质对体外培养大鼠心肌细胞β1-肾上腺素能受体表达下调作用的研究

目的 观察P物质(SP)对体外培养新生大鼠心肌细胞β1-肾上腺素能受体(β1-AR)表达的影响.方法 选择出生1～3 d的SD大鼠.分离、培养心肌细胞,将细胞培养至72 h待用.用6孔培养板将细胞随机分为对照组与10-7mol/L SP组,每组3孔;采用免疫细胞化学技术测定心肌细胞中β1-AR的表达.另取15孔培养板将细胞随机分为对照组(不加药物干预)与SP组(分别给予10-9、10-8、10-7、10-6mol/L SP干预),每组3孔;采用流式细胞术测定心肌细胞膜表面β1-AR的表达.结果 免疫细胞化学结果显示,SP组心肌细胞β1-AR阳性单位和平均吸光度(A)值均低于对照组(阳性单位:179.61±48.18比205.79±117.42,A值:128.26±22.72比157.35±33.11,P均<0.05).流式细胞术结果显示,不同浓度SP组β1-AR表达均低于对照组.除10-9mol/L SP组(158.87±3.12)外,10-8、10-7、10-6mol/L SP组与对照组比较差异有统计学意义(151.85士4.63,135.00±6.84,121.41±5.22比161.35±3.09,P均<0.05),且呈剂量依赖性.结论 SP可以抑制体外培养大鼠心肌细胞β1-R的表达.     

亚低温对心肺复苏大鼠大脑海马神经元内N-甲基-D-天门冬氨酸受体1表达的影响

目的探讨亚低温对心肺复苏模型大鼠大脑海马神经元内N甲基D天门冬氨酸受体1(NMDAR1)表达的影响。方法24只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、常温组和亚低温组,每组8只。常温组和亚低温组大鼠用水封瓶密闭法制备心肺复苏后脑水肿动物模型,常温组制模后置于室温环境,亚低温组制模后立即给予亚低温治疗。应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT PCR)方法检测各组大鼠大脑海马神经元内NMDAR1表达。结果亚低温组大鼠脑组织水肿明显减轻,大脑海马神经元内NMDAR1mRNA和蛋白表达明显降低,与常温组比较差异有显著性(NMDAR1mRNA:80.48±0.03比80.64±0.18,P<0.05)。结论亚低温能够减轻心肺复苏后脑水肿,其机制可能为:亚低温通过减少NMDAR1在mRNA和蛋白水平的表达,降低阳离子通道通透性的作用,而减轻脑水肿的形成,起到治疗心肺复苏后脑水肿的作用。     

反义蛋白激酶Cγ寡核苷酸对原代培养大鼠脑神经元蛋白激酶Cγ mRNA表达与皮质和海马神经元增殖及神经突起生长的影响

目的:观察阳离子脂质体Lipofectamine介导的蛋白激酶CγAsODN对原代培养大鼠脑神经元蛋白激酶CγmRNA表达及生长的影响。方法:实验于2004-03/08在华中科技大学同济医学院附属同济医院完成。①实验分组:取新生50只SD乳鼠大脑皮质及海马神经元进行原代培养,分为正常对照组,空脂质体转染组,300nmol/L Lipofectamine-SODN转染组,100nmol/L Lipofectamine-AsODN转染组,300nmol/L Lipofectamine-AsODN转染组,每组10瓶。②实验方法:培养第4￣5天采用脂质体或脂质体包裹的不同浓度的AsODN或SODN蛋白激酶Cγ转染培养神经元。③实验评估:采用倒置显微镜对神经元的生长进行动态观察;免疫组化ABC法进行蛋白激酶Cγ阳性神经元的鉴定;MTT法检测神经元的增殖率;RT-PCR方法检测转染后神经元的蛋白激酶CγmRNA的表达变化。结果:①蛋白激酶Cγ阳性神经元呈胞浆内棕褐色染色,胞核不显色。②蛋白激酶CγAsODN转染早期呈现促进神经元突起生长,胞体分化的作用。随着反义浓度增加,相对生长指数值升高。而在转染晚期,ASODN蛋白激酶Cγ转染组凋亡率均明显增加。③AsODN蛋白激酶Cγ可降低神经元蛋白激酶CγmRNA的表达。结论:蛋白激酶CγAsODN可减少神经元蛋白激酶CγmRNA的表达,并刺激皮质及海马神经元的增殖及神经突起的生长,这可能与蛋白激酶Cγ对神经元的生长起负性调控作用有关。