超声介导微泡破裂增强体外基因转染的方法学研究

目的 对超声促进基因转染的方法进行系统的优化研究,初步确定超声介导微泡破裂(UMMD)增强体外基因转染的最优参数.方法 选用 Ishikawa、Hela 和 MCF-7 3种细胞系为研究对象,用1 MHz超声仪.超声强度为1.0W/cm2,系统研究不同参数下的细胞活力及两种DNA质粒[红色荧光蛋白质粒(DsRed)和荧光索酶质粒(pCMV-LUC)的基因转染情况,优化UMMD的转染条件(质粒浓度、占空比及辐照时间),分析SonoVue微泡对基因转染的增强作用.结果 基因转染率随着质粒浓度的增加而增高,当质粒浓度达到30 μg/孔时转染率最高,两种DNA质粒的最佳转染浓度相同.与10%占空比的超声辐照相比,20%占空比的转染率显著提高(P＜0.01).辐照3 min时基因表达率最高,但存活率无明显下降(89.03±2.01)%,为最佳辐照时间.无超声辐照时,单独应用质粒或微泡十质粒的样本几乎不表达红色荧光蛋白.与单纯超声辐照相比,超声辐照联合SonoVue微泡可显著提高基因转染效率(P＜0.01).结论 UMMD的转染参数影响转染效率和细胞活力,优化的参数有利于促进基因转染.     

脂质体微泡对超声介导基因转染的增效作用研究

目的 探讨超声介导基因转染时,脂质体微泡(LM)对体内、外红色荧光蛋白基因(RFP)转染的增效作用及其安全性.方法将RFP和LM加入培养的Hela细胞后行超声辐照(US),对微泡浓度、超声强度、辐照时间进行优化研究,运用荧光显微镜、流式细胞术评估基因转染率,并对细胞损伤进行分析.在裸鼠移植瘤的体内实验中,将LM和RFP质粒(P)经尾静脉注入后予以超声辐照(P+LM+US),以单纯质粒注射(P)、P+US、P+LM作为对照,行冰冻切片,组织学检查,RFP表达检测.结果培养的Hela细胞经LM和超声辐照联合处理后,RFP基因转染率显著增加,差异有统计学意义(P＜0.01),在超声强度为1.0 W/cm2、微泡浓度为6%、辐照3 min的条件下最显著,且未发现显著的细胞损伤.P+LM+US组的裸鼠移植瘤内RFP表达显著高于P组、P+US组或P+LM组,差异均有统计学意义(P＜0.01),且未观察到明显的组织损伤.结论 LM对超声介导基因转染的体内、外转染效率有显著的增效作用,而无明显的细胞或组织损伤,为临床基因治疗提供一种新颖、高效、安全的非病毒基因转染方法.     

超声靶向微泡破裂联合聚乙烯亚胺介导大鼠心肌母细胞Bax基因沉默

目的 探讨超声靶向微泡破裂(ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)联合聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)的方法转染大鼠心肌母细胞(H9c2细胞)以达到沉默Bax基因的效果.方法 构建靶向Bax基因的shRNA表达质粒,将其与微泡及PEI共同处理后加入H9e2细胞并予以超声辐照,实验分组为:①单纯质粒组;②Lipofectamine2000+质粒组;③UTMD+质粒组;④PEI+ UTMD+质粒组;⑤PEI+ SonoVue+质粒组(无超声辐照).采用荧光显微镜和FCM法评估基因转染效率,应用RT-PCR检测Bax mRNA水平的变化,Western Blot检测蛋白表达情况.结果 超声辐照对所构建的BaxshRNA表达质粒无破坏.H9c2细胞采用UTMD+ PEI处理后,转染率显著高于其他各组(P＜0.05).PT-PCR及Western Blot检测结果显示,PEI+UTMD+质粒组Bax mRNA及Bax蛋白表达抑制率分别为(71.41±4.91)％及(64.09±2.38)％,显著高于其余各组(P＜0.05).结论 超声靶向微泡破裂联合聚乙烯亚胺的方法能有效地沉默H9c2细胞Bax基因的表达.     

共聚物P85联合超声微泡介导基因转染的体外实验研究

目的 探讨共聚物P85与黏附增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluoresent protein,EGFP)质粒的微泡造影剂(microbubble,MB)结合后联合一定强度的超声(ultrasound,US)辐照,是否增强人肝癌细胞(HepG2)的质粒转染及表达.方法 以人肝癌细胞(HepG2)为研究对象,质粒DNA是可表达绿色荧光蛋白的pEGFP,添加微泡造影剂或共聚物P85后进行脉冲多普勒超声辐照(频率1 MHz,声强1 W/cm2,工作周期20%,时间20 s).24 h后台盼蓝染色评价细胞存活率,荧光显微镜和流式细胞仪评价细胞的基因转染率.结果 有超声辐照组的pEGFP转染率明显高于无超声辐照组(P＜0.01),有超声辐照组中pEGFP+30%MB+P85+US组转染效率(22.14±3.06)%优于单独使用微泡组(11.34±2.2)%或P85组(9.72±1.21)%(P＜0.01).结论 微泡造影剂与共聚物P85结合同时给予超声辐照可增强基因转染效率,在基因治疗上有待于进一步关注和研究.     

不同转染方法对荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞影响的实验研究

目的:探讨荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的最佳转染方法.方法:以脂质体转染法、超声辐照法、微泡造影剂SonoVue联合超声辐照及脂质体中加入微泡造影剂SonoVue并予以超声辐照4种转染方法,将含有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N1转染人胚肾293T细胞,48 h后以荧光显微镜观察293T细胞中的绿色荧光蛋白表达情况并用流式细胞仪测算转染率.结果:脂质体 SonoVue 超声辐照法的转染效果最好(23.10±2.11%).脂质体 SonoVue 超声辐照法的转染率分别与脂质体转染法、超声辐照法、微泡造影剂SonoVue联合超声辐照法的转染率比较均有显著差异(P<0.01).结论:脂质体中加入微泡造影剂SonoVue并予以超声辐照能显著提高荧光蛋白质粒在人胚肾293T细胞中的转染效果.     

超声微泡靶向破坏转染shRNA沉默Survivin表达诱导裸鼠宫颈癌移植瘤凋亡的研究

目的 通过超声微泡靶向破坏(UTMD)对靶向存活素的短发夹状重组质粒(Survivin-shRNA)进行转染,探讨其凋亡诱导效应、增殖抑制作用及其安全性.方法 将荷人宫颈癌(Hela)裸鼠随机分为三组:质粒+超声辐照(P+US)组,注入质粒溶液后予以超声辐照;质粒+微泡+超声辐照(P+UTMD)组,注入质粒/微泡复合物后辐照;对照组,不予任何处理.对组织样本行组织学检查,采用免疫组化SABC法检测移植瘤增殖细胞核抗原(PCNA)、Survivin、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Ki-67、核干细胞因子(NS)、p53蛋白在各组肿瘤标本中的表达.结果 P+UTMD组的PCNA、Ki-67、Bcl-2、Survivin及NS蛋白表达下降,而Bax、Caspase-3、p53蛋白表达明显增加,与对照组及P+US组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 UTMD联合Survivin-shRNA能有效沉默Survivin基因表达,具有抑制增殖和促分化的作用,并诱发细胞凋亡,无明显副作用,为癌症基因疗法提供一种高效、无创、有前景的新方法.     

超声辐照和SonoVue微泡在介导hAng-1基因体外转染时的作用和量效关系探讨

目的 探讨超声辐照和SonoVue微泡分别使用和联用在介导hAng-1基因体外转染过程中的作用以及辐照强度和微泡浓度对转染效率和细胞活性的影响.方法 实验分四组A组:单纯超声辐照+质粒组;B组:微泡+质粒组;C组:超声辐照+微泡+质粒组和空白对照组D组. C组内转染参数分别设置为超声照射强度0.5、1.0 、1.5和2.0 W/cm~2,微泡浓度5%、10%、20%、30%和40%.将连接有eGFP-C_3-hAng-1质粒的SonoVue微泡对293T细胞进行转染,48 h后检测各组基因转染效率和细胞存活率. 结果转染48 h后C组转染效率最高,荧光阳性细胞数最多,强度最大;A组转染效率很低,见少量荧光表达;B、D组无明显基因转染发生.随着超声照射强度和微泡浓度的增加,基因转染效率会逐步升高,具有统计学意义.微泡浓度大于20%、超声照射强度超过1.5 W/cm~2后基因转染效率不再升高甚至降低,细胞死亡率显著增高(P<0.01).结论 SonoVue微泡介导外源基因转染必须联合超声辐照才能获得较好的转染效率.对于hAng-1基因和SonoVue微泡,选择声强1.5 W/cm~2,微泡浓度20%是相对最佳转染条件.     

超声辐照SonoVue增强脂质体介导pEGFP-N1转染乳腺癌细胞

目的 探讨超声辐照SonoVue介导增强型绿色荧光蛋白报告基因质粒(pEGFP-N1)转染乳腺癌MCF-7细胞的最优条件以及超声联合微泡造影剂增强脂质体转染的效果.方法 体外培养人乳腺癌MCF-7细胞,按照不同的辐照条件分组:不处理组,超声辐照十质粒组,微泡浓效组,超声声张组,辐照时间组及工作周期组.分别进行超声辐照,辐照后以MTT法测细胞存活度,流式细胞仪测pEGFP-N1瞬时转染率,取得最佳的辐照条件.重新准备细胞后先以脂质体转染细胞,2 h后加入超声微泡并以最佳条件辐照,用同样的方法测细胞存活率及转染率.结果 20%的造影剂浓度、1.5 W/cm2的声强、90 s的辐照时间、20%的工作周期(占空比)为超声辐照SonoVue介导pEGFP-N1转染MCF-7细胞的最优条件,转染率为(14.21±2.55)%,细胞存活率为(84.60±2.85)%.在增强脂质体转染的实验中,超声微泡脂质体组的转染率最高(22.15±2.69)%,与其他各组相比差异有统计学意义(P<0.05),此时细胞存活率为(80.13±3.61)%.结论 20%的造影剂浓度、1.5 W/cm2的声强、90 s的辐照时间、20%的工作周期是MCF-7细胞的最佳转染条件,超声联合微泡能够增强脂质体转染的效果.     

短发夹RNA诱导survivin基因缄默对Jurkat细胞凋亡和增殖的影响

目的研究应用载体表达短发夹 RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术抑制人 T 淋巴细胞白血病细胞株 Jurkat 细胞 survivin 基因的表达,探讨 survivin 基因表达缄默对 Jurkat 细胞凋亡和增殖的影响。方法构建针对 survivin 基因的 shRNA 重组质粒并转染至 Jurkat 细胞,分别用多重 PCR和 Western blot 法检测瞬时转染和稳定转染细胞 survivin 基因 mRNA 和蛋白表达水平的变化;流式细胞术检测瞬时转染和稳定转染细胞凋亡指数的变化,绘制细胞生长曲线,探讨 survivin shRNA 转染对细胞生长和增殖的影响。结果多重 PCR 结果示与无功能(对照组)shRNA 处理组和磷酸盐缓冲液处理组比较,survivin shRNA 瞬时转染和稳定转染细胞 surivivin 基因 mRNA 表达均显著下降,抑制率分别为66.675% 和60.69%(P<0.05);Western blot 结果显示 survivin shRNA 瞬时转染和稳定转染细胞survivin 蛋白表达水平亦显著降低,抑制率分别为63.41% 和60.18%(P<0.05)。流式细胞术检测瞬时转染和稳定转染细胞的凋亡率显著增加,分别为(22.41±2.83)% 和(20.73±2.56)%(与对照组比较,P均<0.05),细胞倍增时间显著延长。生长曲线显示稳定转染细胞的生长显著减慢。结论shRNA 重组质粒介导的 RNA 干扰能明显抑制 Jurkat 细胞 survivin 基因 mRNA 和蛋白产物的表达,诱导细胞凋亡和生长抑制。     

不同声学微泡对超声介导体外基因转染的作用

目的探讨超声介导基因转染时,不同声学微泡[脂质体微泡(LM)和SonoVue微泡]对体外基因转染的作用及其安全性。方法将红色荧光蛋白基因(DsRed)和LM加入培养的Hela细胞,后行超声辐照(US),对其他4种不同类型的细胞系(HepG_2、Ishikawa、MCF-7和B16-F10)行超声处理,并与PEI介导的基因转染进行比较分析,运用荧光显微镜、流式细胞术评估基因转染率和细胞损伤。结果培养的细胞经LM和超声辐照联合处理后(P+UTMI)),HepG_2、MCF-7的基因转染率略优于Sono Vue微泡转染时(P0.01),且未发现显著的细胞损伤;不同细胞类型对超声的反应性不同。与非辐照组相比,转染率和死亡率均有不同程度的增加。结论声学微泡对超声介导的体外基月转染有显著的增效作用,为基因治疗提供一种新颖、高效、安全的非病毒基因转染方法。