α_1(Ⅰ)型前胶原基因反义重组质粒对成纤维细胞的影响

目的　研究反义RNA对成纤维细胞胶原蛋白的调控作用 ,探讨基因治疗增生性瘢痕的可能性。方法　将α1 (Ⅰ )型前胶原基因片段反向克隆至非整合型哺乳动物表达载体pREP9的多克隆位点中 ,以构建α1 (Ⅰ )型前胶原基因反义RNA表达载体pREP9 AScoll,并籍脂质体 lipofectamine将其导入人胚肺HLF细胞中 ,运用MTT试验、电镜、3H 脯氨酸掺入法检测反义RNA表达载体对HLF细胞的影响。结果　外源重组体pREP9 AScoll对胶原蛋白的合成有明显抑制作用 ,但对细胞增殖无任何影响。结论　α1 (Ⅰ )型前胶原基因反义重组质粒能有效调控胶原蛋白的合成 ,从而有在基因水平防治瘢痕的前景。     

人瘢痕组织TIMP—1核酶表达载体的构建及临床意义

目的：设计能特异性切割人类瘢痕组织中TIMP－1mRNA的核酶,构建其体外表达载体并大量制备核酶,以研究特异阻断TIMP－1基因表达对瘢痕胶原降解的影响。方法：根据Symons的“锤头结构”,以人TIMP－1的mRNA为靶RNA,设计核酶,以P1．5为载体,制备TIMP－1特异性核酶的克隆,并通过转录制备大量核酶,结果：针对第123,299和353位这三个位点设计了三个核酶,合成核酶基因后,构建了其表达载体并完成了克隆,通过体外转录证实克隆正确,结论：核酶体外表达载体的构建及克隆是研究核酶活性,抑制TIMP－1基因表达,调控胶原降解的关键步骤之一,人瘢痕组织TIMP－1核酶体外表达载体的成功构建及克隆,为进一步通过反义抑制,阻断人瘢痕组织TIMP－1过度表达,实现对病理性瘢痕胶过原代谢的调控,奠定了坚实的基础。     

过表达Smad7基因对瘢痕疙瘩成纤维细胞的影响

目的观察瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts,KFb)转染Smad7过表达载体后,对细胞内Smad7、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因、蛋白表达和细胞增殖的影响,探讨Smad7蛋白对瘢痕疙瘩生长有无抑制作用。方法收集10例20~25岁男性瘢痕疙瘩患者(排除其他疾病)手术切下的瘢痕疙瘩组织,体外无菌条件下培养KFb后分为3组,A组为未转染组;B组为空载体pc DNA3.1(-)转染细胞组;C组为Smad7基因过表达载体pc DNA3.1(-)-smad7转染细胞组。转染48 h后行实时荧光定量PCR和Western blot法检测各组细胞内Smad7、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因转录和蛋白表达水平,转染24 h后MTT法检测各组细胞增殖能力。结果 C组Smad7m RNA和蛋白相对表达量显著高于A、B组,Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原m RNA和蛋白相对表达量显著低于A、B组,差异均有统计学意义(P0.01);B组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原m RNA相对表达量高于A组(P0.01),Smad7、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白相对表达量低于A组(P0.01)。MTT检测示,培养各时间点C组细胞增殖能力均小于A、B组(P0.05),A、B组间差异均无统计学意义(P0.05)。结论转染Smad7基因过表达载体能抑制KFbⅠ型胶原、Ⅲ型胶原基因的表达和细胞增殖能力。     

无瘢痕愈合过程中胶原代谢演变的实验研究

目的与成年鼠伤口愈合过程进行对照,观察胎鼠无瘢痕伤口愈合过程中胶原代谢情况。方法建立无瘢痕伤口愈合模型,于术后不同时间点对胎鼠和成年鼠伤口组织行胶原蛋白V.G.染色,Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化,Ⅰ、Ⅲ型胶原原位杂交。结果胎鼠伤口愈合快,组织结构再生完全,没有瘢痕形成,胶原呈网状正常排列,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及表达均增多,同时伴细胞数增多,Ⅲ型胶原首先形成网状排列;成年伤口胶原纤维沉积慢,平行排列的胶原逐渐呈束状填塞伤口以致瘢痕形成,伤口内Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达均增多,细胞数目增多不明显。结论在胎儿伤口愈合过程中,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达调控主要通过细胞数目增多来完成,胶原纤维始终呈网状正常排列;成年伤口愈合Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达调控则通过其mRNA水平增高来实现,胶原纤维呈束状排列,形成瘢痕组织。     

康宁克通对增生性瘢痕Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及前胶原基因原位表达的影响

目的　探讨康宁克通在活体中对增生性瘢痕Ⅰ、Ⅲ型胶原合成及降解影响的机理。方法　用免疫组织化学及分子生物学技术 ,对 6例增生性瘢痕局部注射康宁克通 3及 7d后 ,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及相应前胶原mRNA的原位表达进行了研究。结果　①注射 7d后 ,Ⅰ型胶原蛋白量降低 (P <0 0 5 ) ,Ⅲ型胶原蛋白量未见明显降低 (P >0 0 5 )。而Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA在注射后 3d已被明显抑制 (P <0 0 1) ,至注射后 7d ,表达强度进一步下降。②康宁克通局部注射后对Ⅰ型前胶原mRNA的表达抑制可能比对Ⅲ型前胶原强。③Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达在增生性瘢痕中比正常皮肤强。结论　康宁克通对Ⅰ型胶原的抑制比Ⅲ型胶原强。Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达在增生性瘢痕比正常皮肤强     

反义TGF-β1抑制Ⅲ度烫伤愈合中瘢痕形成的实验研究

目的 探讨反义TGF-β1对Ⅲ度烫伤愈合中瘢痕生成的抑制作用。方法 SD大鼠Ⅲ度烫伤后，分3组进行处理：①反义TGF-β1脱氧寡核苷酸；②反义TGF-β1重组质粒；③空白对照。分别于烫伤后1，3，5，14dRT-PCR、免疫组化检测TGF-β1mRNA和蛋白质的表达。烫伤后5，14，21，28，60d原位杂交检测I型胶原mRNA的表达变化，病理检测炎性细胞浸润反应和胶原分布状况。结果 反义作用组在烫伤后14d内TGF-β1mRNA和蛋白质和表达均减少。原位杂交显示对照组在14dⅠ型胶原mRNA开始表达，28d达到高峰，随后减少，反义作用组无此现象，一直保持低表达。病理染色显示反义作用组炎性细胞浸润少，炎性反应低，胶原合成减少。结论 反义TGF-β1可抑制Ⅱ度烫伤愈合中瘢痕的形成。     

RNA干扰技术阻抑热休克蛋白对瘢痕疙瘩生成的影响

目的 利用RNA干扰(RNAi)技术,通过热休克蛋白47重组质粒(HSP47 siRNA)和脂质体的混合液,对瘢痕疙瘩裸鼠动物模型的体内干预后,分析HSP47基因在瘢痕疙瘩生成中的作用.方法 构建裸鼠瘢痕疙瘩动物模型,于第16天腹腔麻醉后在实验组瘢痕疙瘩内注射质粒、脂质体混合液0.25 ml,对照组裸鼠腹腔注射磷酸缓冲液(PBS)0.25 ml,原笼饲养,7 d回收标本,分别做mRNA水平检测,胶原蛋白水平检测以及免疫组织化学检测.结果 实验组 HSP47 mRNA表达明显降低,且实验组总胶原含量,Ⅰ型胶原蛋白 mRNA表达与对照组比较也明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 利用RNAi技术,通过过HSP47 siRNA表达载体特异性沉默瘢痕疙瘩中HSP47基因表达后,瘢痕疙瘩中胶原蛋白的合成和分泌均能得到明显抑制,表明HSP47基因具有促进瘢痕疙瘩生成作用,为抑制瘢痕疙瘩提供新的靶点.     

转染Sp1基因对人增生性瘢痕成纤维细胞胶原表达的影响

目的 探讨重组Sp1基因转染人增生性瘢痕成纤维细胞的可行性,以及转染Sp1基因对细胞增殖速率和Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响. 方法 体外重组Sp1基因,借助真核表达载体系统.转人体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞,通过激光共聚焦显微镜观察报告基因表达,并确定细胞转染效率.应用Real-time PCR法比较转染前后Sp1 mRNA及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达;采用CCK8比色法,比较转染细胞与未转染细胞增殖状况. 结果 基因转染后,约30%的被转染细胞表达绿色荧光;Sp1 mRNA在转染组、转染空载体组、未转染组细胞中的表达分别为:5.26±0.76、1.08±0.18、1.09±0.15,转染组Sp1 mRNA相对表达量较未转染组和转染空载体组明显增高(P<0.01,n=5);Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA在转染组、转染空载体组、未转染组细胞中的表达分别为:2.49±0.40、1.88±0.30,0.96±0.18、0.95±0.18,0.97±0.15、0.93±0.13,转染组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA相对表达量较未转染组和转染空载体组均明显增高(P<0.01,n=5). 结论 瘢痕成纤维细胞可作为Sp1转染的靶细胞,Sp1基因可能是导致瘢痕异常增生的重要基因.     

阻断转化生长因子-β受体信号转导降低瘢痕疙瘩细胞转化生长因子-β1自分泌的研究

目的 研究瘢痕疙瘩成纤维细胞转化生长因子－β1（TGF－β1）的自分泌现象和阻断TGF－β受体信号转导对TGF－β1自分泌的调控。方法 组织块法体外培养瘢痕疾疙瘩成纤维细胞，加入重组人源（rh）TGF－β1（5mg/L）或含缩短型TGF－βⅡ型体的重组腺病毒（50pfu/cell），并用Northern印迹观察它们对TGF－β1极其Ⅰ、Ⅱ型受体的基因调控。结果 rhTGF－β1能上调TGF－β1（30％－50％）和Ⅰ型受体（30％－90％）的基因表达，但不影响Ⅱ型受体的基因表达。短型TGF－βⅡ型受体在瘢痕疙瘩细胞的过度表达减少细胞TGF－β1（50％－65％）和Ⅰ型受体（21％－55％）的基因表达，但不影响Ⅱ型受体的基因表达。结论 瘢痕疙瘩细胞存在TGF－β1的自分泌现象，而缩短型TGF－βⅡ型受体的过度表达可以通过阻断TGF－β的信号转导来降低TGF－β1的自分泌。     

人瘢痕组织TIMP-1核酶表达载体的构建及临床意义

目的设计能特异性切割人类瘢痕组织中TIMP-1mRNA的核酶,构建其体外表达载体并大量制备核酶,以研究特异性阻断TIMP-1基因表达对瘢痕胶原降解的影响.方法根据Symons的“锤头结构”,以人TIMP-1的mRNA为靶RNA,设计核酶,以P1.5为载体,制备TIMP-1特异性核酶的克隆,并通过转录制备大量核酶.结果针对第123,299和353位这三个位点设计了三个核酶,合成核酶基因后,构建了其表达载体并完成了克隆,通过体外转录证实克隆正确.结论核酶体外表达载体的构建及克隆是研究核酶活性,抑制TIMP-1基因表达,调控胶原降解的关键步骤之一.人瘢痕组织TIMP-1核酶体外表达载体的成功构建及克隆,为进一步通过反义抑制,阻断人瘢痕组织TIMP-1过度表达,实现对病理性瘢痕胶原代谢的调控,奠定了坚实的基础.     

金属蛋白酶组织抑制剂1基因转染对系膜细胞表达纤连蛋白和Ⅳ型胶原的影响

目的 探讨金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）－1对大鼠肾小球系膜细胞表达纤连蛋白（FN）和Ⅳ型胶原的影响。方法 应用亚克隆技术构建正义pLXIN-TIMP-1(PLT)和反义pLXIN-ATIMP-1(PLA)两个逆转录病毒载体，经PA317细胞包装后，得到高滴度的病毒上清，分别感染大鼠系膜细胞，用PCR及Northern杂交鉴定外源基因的整合和表达。Northern杂交及ELISA方法检测大鼠系膜细胞内源性TIMP－1、FN和Ⅳ型胶原的表达。结果 外源TIMP－1基因稳定整合到大鼠肾小球系膜细胞中，并获得高效表达。感染正交TIMP－1基因后，大鼠系膜细胞内源性TIMP－1表达没有变化，细胞外基质成分FN和Ⅳ型胶原的蛋白质水平的表达明显增高；与之相反，感染反义的TIMP－1基因后，大鼠内源性TIMP－1下调，细胞外基质成分FN和Ⅳ型胶原的蛋白质水平的表达明显降低。然而，上述系膜细胞FN和Ⅳ型胶原的mRNA水平均没有变化。结论 TIMP－1过表达引起FN和Ⅳ型胶原增多，反义TIMP－1则使FN和Ⅳ型胶原的表达下调。提示反义TIMP－1可通过促进肾脏细胞外基质降解而减轻其积聚，为进一步在某些纤维化肾脏疾病中应用反义TIMP－1进行基因治疗奠定一定的实验基础。     

microRNA-21调控TGF-β通路促进增生性瘢痕形成的机制研究

目的探讨micro RNA-21在增生性瘢痕(Hypertrophic scars,HS)形成中的作用及机制,为生物学防治提供新靶点。方法收集临床患者正常皮肤及HS标本,组织学检测、组织胶原定量检测;免疫组化、Real-time PCR检测正常细胞外基质Col 1 A1、Col 3 A1、Fibronectin(FN)及α-SMA的表达;Real-time PCR检测micro RNA-21 m RNA表达水平;培养HS成纤维细胞,构建micro RNA-21反义表达载体,并加入TGF-β诱导,Real-time PCR检测Col 1 A1、Col 3A1及micro RNA-21的表达。结果 HS中胶原的含量及细胞外基质表达明显高于正常皮肤;HS组织中micro RNA-21表达高于正常皮肤组织;TGF-β可增强HS成纤维细胞中micro RNA-21的表达,而瘢痕成纤维细胞转染micro RNA-21反义表达载体后可明显降低瘢痕相关基因的表达。结论皮肤创伤愈合后局部micro RNA-21表达升高,促进了细胞外基质的合成,而TGF-β进一步加强了micro RNA-21对瘢痕形成的促进作用,可能是导致HS形成的重要原因。     

转染ANGPTL-1基因对人皮肤成纤维细胞胶原表达的影响

目的探讨重组ANGPTL-1基因转染人皮肤成纤维细胞的可行性,以及转染转染后对细胞增殖速率和Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响。方法体外重组ANGPTL-1基因,借助真核表达载体系统,转入体外培养的人皮肤成纤维细胞,流式细胞仪检测基因表达及细胞转染效率;RT-PCR比较转染前后ANGPTL-1 mRNA及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达。结果基因转染后,(63±7.1)%的被转染细胞表达目的基因;转染组ANGPTL-1 mRNA相对表达量较未转染组和转染空载体组明显增高(P<0.01,n=5);转染组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA相对表达量较未转染组和转染空载体组均明显增高(P<0.01,n=5)。结论人皮肤成纤维细胞可作为ANGPTL-1转染的靶细胞,ANGPTL-1基因可能是促进Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的重要基因之一。     

转染NF-1基因对人增生性瘢痕成纤维细胞胶原表达的影响

目的探讨重组NF1基因转染人增生性瘢痕成纤维细胞的可行性,以及转染NF1基因对细胞增殖速率和Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响。方法体外重组NF1基因,借助真核表达载体系统,转入体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞,通过激光共聚焦显微镜观察报告基因表达,并确定细胞转染效率。应用Real time PCR法比较转染前后NF1 mRNA及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达;采用CCK-8比色法,比较转染细胞与未转染细胞增殖状况。结果基因转染后,约50%的被转染细胞表达绿色荧光;NF1 mRNA在转染组、转染空载体组、未转染组细胞中的表达分别为:7.27±1.16、2.01±0.38、1.87±0.29,转染组NF1 mRNA相对表达量较未转染组和转染空载体组明显增高(P<0.01,n=5);Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA在转染组、转染空载体组、未转染组细胞中的表达分别为:3.01±0.48和2.05±0.25、0.89±0.18和0.94±0.16、0.99±0.11和0.92±0.19;转染组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA相对表达量较未转染组和转染空载体组均明显增高(P<0.01,n=5)。结论瘢痕成纤维细胞可作为NF1转染的靶细胞,NF1基因可能是导致...     

人瘢痕组织TIMP-1核酶表达载体的构建及临床意义

目的　设计能特异性切割人类瘢痕组织中TIMP - 1mRNA的核酶 ,构建其体外表达载体并大量制备核酶 ,以研究特异性阻断TIMP - 1基因表达对瘢痕胶原降解的影响。方法　根据Symons的“锤头结构” ,以人TIMP - 1的mRNA为靶RNA ,设计核酶 ,以P 1.5为载体 ,制备TIMP - 1特异性核酶的克隆 ,并通过转录制备大量核酶。结果　针对第 12 3 ,2 99和 3 5 3位这三个位点设计了三个核酶 ,合成核酶基因后 ,构建了其表达载体并完成了克隆 ,通过体外转录证实克隆正确。结论　核酶体外表达载体的构建及克隆是研究核酶活性 ,抑制TIMP - 1基因表达 ,调控胶原降解的关键步骤之一。人瘢痕组织TIMP - 1核酶体外表达载体的成功构建及克隆 ,为进一步通过反义抑制 ,阻断人瘢痕组织TIMP - 1过度表达 ,实现对病理性瘢痕胶原代谢的调控 ,奠定了坚实的基础。     

大鼠自体静脉移植后内膜增生中Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA及其蛋白的早期表达

目的　探讨静脉移植后内膜增生早期的发生机制。　方法　采用免疫组织化学、核酸原位杂交等方法 ,对大鼠静脉移植后 7天、14天、2 8天和 42天内膜增生中的 型、 型 [α1( )、α1( ) ]前胶原 m RNA及 型、 型胶原蛋白的表达进行定位、半定量观察。　结果　与组织修复相关的胶原合成于术后 7天出现 ,术后 14天消失。术后 14天起 ,α1( )、α1( )前胶原 m RNA开始大量在增生内膜的平滑肌细胞中表达 ,并于术后 2 8天达高峰 (P<0 .0 5 ) ,与相应胶原的表达呈同步增长。　结论　静脉移植后 7天 型、 型胶原即开始在内膜增生中的平滑肌细胞内转录及合成 ,且与平滑肌细胞的增殖无关。提示防治静脉移植后内膜增生至少应从术后 14天开始 ,并应包括抑制细胞增殖及胶原合成两个方面。     

反义TGF-β1抑制兔耳增生性瘢痕的实验研究

目的：探讨反义TGF-β1脱氧寡核苷酸对增生性瘢痕动物模型伤口愈合中瘢痕生成的抑制作用，研究局部使用反义。TGF-β1的有效给药途径。方法：成年日本大耳白兔20只，建立兔耳腹侧面增生性瘢痕模型。采用组织形态学的方法对比研究反义TGF-β1在兔耳增生性瘢痕形成中的影响，并用原位杂交法技术检测兔耳增生块内TGF-β1 mRNA、Ⅰ型胶原蛋白(colla-genⅠ)mRNA、Ⅲ型胶原蛋白(collagenⅢ)mRNA的表达水平。结果：兔左耳增生性瘢痕局部注射反义TGF-β1后，按时间段取材，HE和Masgon染色显示真皮层变薄，成纤维细胞数量明显减少，胶原排列趋于一致。增生块的相对增生高度低于对照组。原位杂交显示TGF-β1 mRNA、collagenⅠmRNA、collagenⅢ mRNA阳性细胞表达率明显降低。结论：反义TGF-β1能抑制兔耳增生性瘢痕的增殖过程，使瘢痕组织纤维化程度明显减轻。局部注射裸DNA治疗瘢痕的给药途径是可行的。     

构建细菌内同源重组型hTERT调控区反义RNA腺病毒载体

目的 :构建细菌内同源重组型端粒酶催化亚单位调控区c myc结合位点的反义RNA腺病毒重组体。方法 :PCR扩增hTERT启动子调控区c myc结合位点 370bp的DNA片段 ,与腺病毒穿梭载体pShuttle CMV连接 ,以抗生素平板筛选连接阳性的克隆 ,PCR鉴定方向 ,构建反向插入的hTERT c myc反义RNA腺病毒穿梭载体pShuttle ashmyc ,将PmeⅠ线性化的 pShuttle ashmyc与包装质粒 pAdEasy 1共转染受体菌BJ5 183进行同源重组。用含有卡那霉素的LB平板筛选同源重组阳性的克隆 ,酶切鉴定后 ,以PacⅠ酶切线性化 ,转染包装细胞 2 93,以软琼脂平板上的空斑数量计算重组腺病毒的滴度。结果 :成功构建了端粒酶催化亚单位调控区c myc结合位点的反义RNA重组腺病毒 pAd ashmyc,滴度为1 2× 10 9efu/ml。结论 :hTERT调控区c myc结合位点的反义腺病毒载体的成功构建 ,为肿瘤的基因治疗奠定了良好的基础     

DcR3反义RNA表达载体的构建及表达

目的：构建DcR3反义RNA表达载体PVAXI-as-DeR3，并研究其对肝癌细胞中DcR3蛋白表达的影响。方法：从肝癌组织中提取总RNA，RT-PCR法克隆出DcR3基因片段，将其与PMD18-T载体连接，经BamHⅠ、XholⅠ双酶切TA—DeR3及PVAXⅠ（-）真核表达载体后，使用T4DNA连接酶连接，构建反义DcR3表达载体。转染肝癌细胞株SMMC7721。Western blot法检测DeR3蛋白表达。结果：用RT-PCR方法从肝癌组织中扩增出DcR3片段，并经测序证实。重组质粒经酶切鉴定正确，转染肝癌细胞株SMMC7721后，经Western blot证实DcR3蛋白表达较对照组下降。结论：成功构建反义RNA表达载体PVAXⅠ-as-DcR3，构建的反义表达载体PVAXⅠ—as—DcR3具有阻断DcR3基因表达的效应。     

康宁克通对增生性瘢痕Ⅰ,Ⅲ型胶原蛋白及前胶原基因原？…

目的 探讨康宁克通在活体中对增生性瘢痕Ⅰ、Ⅲ型胶原合成及降解影响的机理。方法 用免疫组织化学及分子生物学技术,对６例增生性瘢痕局部注射康宁克通３及７ｄ后,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及相应前胶原ｍＲＮＡ的原位表达进行了研究。结果 （１）注射７ｄ后,１型胶原蛋白量降低（Ｐ〈０．０５）,Ⅲ型胶原蛋白量未见明显降低（Ｐ〉０．０５）,而Ⅰ、Ⅲ型前胶原ｍＲＮＡ在注射后３ｄ已被明显抑制（Ｐ〈０．０１）,至注射后７ｄ,表达