体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的探讨用5-氮胞苷(5-aza)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的最佳条件.方法用Percoll密度梯度离心法分离培养、纯化大鼠MSCs,取第3代MSCs随机分为A、B、C 3组,分别加入5、10、20 μmol/L5-aza;每组分别孵育12、24、48 h,继续培养28 d.相差显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测细胞肌动蛋白(α-actin)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达,并通过Western印迹法对细胞cTnT进行定量分析.结果MSCs经5-aza诱导培养28 d后,电镜下见细胞胞浆有散在肌丝样结构,免疫组化检测α-actin和cTnT表达均呈阳性;5 μmol/L的5-aza孵育48 h、10 μmoL/L孵育24 h培养28 d的细胞cTnT表达量与10 μmol/L的5-aza孵育48 h、20 μmol/L 3种孵育时间各组比较无显著性差异,且细胞生物学特性未受到明显影响.结论MSCs在体外经5-aza诱导后可分化为心肌样细胞;5 μmol/L的5-aza孵育48 h和10 μmol/L的5-aza诱导24 h是MSCs体外诱导分化心肌样细胞的理想条件.     

体外骨髓间充质干细胞的诱导培养及其电生理特性的研究

目的研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外诱导培养后的电生理特性。方法以12只成年小型猪为研究对象,采用自身对照及组间对照研究。无菌条件下自双侧股骨抽取骨髓20 mL后,处死实验动物,提取正常心肌细胞。用密度梯度percoll法从骨髓中分离出单个核细胞,在培养液pH值为7．2、首次换液时间为48 h、种植密度为5×105／cm2条件下,原位培养并经传代2次后,体外用10μmol／L 5-氮胞苷(5-aza)诱导24 h,继续培养3周。采用免疫组化染色检测骨髓间充质干细胞心肌特异性间隙连接蛋白connexin 43(CX43)浓度的变化,应用电流钳观察MSCs体外诱导前及诱导后1、2、3周细胞内动作电位的产生情况,膜片钳全细胞记录模式观察MSCs体外诱导前及诱导后1、2、3周细胞膜瞬间外向钾电流(Ito)的变化并与正常心肌细胞比较。应用SPSS11．0软件包进行统计学处理,计量资料以均数±标准差表示,均数间比较应用t检验,P<0．05为差异有统计学意义。结果经10μmol／L5-aza诱导3周后,BMsCs细胞CX43蛋白阳性率为95％。膜片钳检测结果:未经5-aza诱导培养的BMSCs传代2次后,与正常心肌细胞Ⅱto电流密度在 80 mv时分别为(14．56±10．02)比(23．49±6．99)pA／pF,P=0．016。经5-aza诱导后培养1、2周,MSCs Ito电流密度分别为(16．43±8．84)和(18．76±9．06) pA／pF,与正常心肌细胞Ito电流密度相比差异有统计学意义(P<0．05)。诱导3周后的BMSCs Ito电流密度为(22．62±8．22)pA／pF,与正常心肌细胞Ito电流密度相比差异无统计学意义(P=0．225)。经5-aza诱导后培养1、2周的BMSCs未能检测到动作电位,诱导后3周的MSCs可检测到动作电位。结论经5-aza诱导后的BMSCs具有心肌细胞特有的结构蛋白CX43,可转化为具有动作电位和心肌Ito电流密度的类心肌样细胞。     

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:比较5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)于不同浓度、不同孵育时间对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSC)向心肌样细胞分化的影响;观察诱导后不同时间点心肌标志物的表达情况.方法:体外分离培养Wistar大鼠MSC,传代纯化后进行诱导实验.浓度分组(C1-C4):分别以3、5、10、20μmol/L5-aza处理24h,之后更换新鲜培养基继续培养.时间分组(T1-T5):以10μmol/L分别孵育6h、12h、24h、48h、72h,之后更换新鲜培养基继续培养.各组均于首次加药4周后行免疫细胞化学染色检测.RT-PCR检测10μmol/L5-aza处理后2、4、8周细胞GATA4mRNA、cTnTmRNA的表达情况.结果:经5-aza诱导处理后4周,C1-C4组Desmin及α-Sarcomeric Actin染色阳性率各组比较均无统计学差异(P＞0.05);而T1-T5各组其阳性率比较存在统计学差异(P＜0.01).RT-PCR显示,诱导后2周,GATA4mRNA开始表达,持续至8周;cTnTmRNA在诱导后2周无表达、4周时弱表达,8周时更为显著.结论:成年人鼠MSC在适当浓度5-aza处理后可以向心肌样细胞分化,在3μmol/L～20μmol/L范围内,5-aza浓度的变化对MSC的分化率影响较小;在48h内,适当延长5-aza的孵育时间可能增加MSC向心肌样细胞的转化率.     

5-氮胞苷诱导骨髓问充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:比较5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)于不同浓度、不同孵育时间对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSC)向心肌样细胞分化的影响;观察诱导后不同时间点心肌标志物的表达情况.方法:体外分离培养Wistar大鼠MSC,传代纯化后进行诱导实验.浓度分组(C1-C4):分别以3、5、10、20μmol/L5-aza处理24h,之后更换新鲜培养基继续培养.时间分组(T1-T5):以10μmol/L分别孵育6h、12h、24h、48h、72h,之后更换新鲜培养基继续培养.各组均于首次加药4周后行免疫细胞化学染色检测.RT-PCR检测10μmol/L5-aza处理后2、4、8周细胞GATA4mRNA、cTnTmRNA的表达情况.结果:经5-aza诱导处理后4周,C1-C4组Desmin及α-Sarcomeric Actin染色阳性率各组比较均无统计学差异(P＞0.05);而T1-T5各组其阳性率比较存在统计学差异(P＜0.01).RT-PCR显示,诱导后2周,GATA4mRNA开始表达,持续至8周;cTnTmRNA在诱导后2周无表达、4周时弱表达,8周时更为显著.结论:成年人鼠MSC在适当浓度5-aza处理后可以向心肌样细胞分化,在3μmol/L～20μmol/L范围内,5-aza浓度的变化对MSC的分化率影响较小;在48h内,适当延长5-aza的孵育时间可能增加MSC向心肌样细胞的转化率.     

内皮素-1在兔骨髓间质干细胞体外诱导为心肌样细胞中的作用

目的　探讨外源性内皮素 - 1(ET - 1)在 5 -氮胞苷 (5 -aza)诱导兔骨髓间质干细胞 (BMSCs)向心肌样细胞转化过程中的生物学作用。方法　获取日本大耳白兔股骨干BMSCs进行培养及传代。实验分组 :①对照组 ;②ET - 1组 (ET - 1,30nmol/L) ;③ 5 -aza诱导组 (5 -aza ,10 μmol/L) ;④ 5 -aza +ET - 1联合诱导组 (5 -aza 10μmol/L +ET - 130nmol/L)。诱导期间 ,观察BMSCs生长状态 ,诱导 4周后 ,计算心肌样细胞转化率 ;心肌特异性肌钙蛋白 -Ⅰ免疫细胞化学染色 ,测定心肌样细胞直径 ;透射电镜观察心肌样细胞形态学特征。结果　 5 -aza +ET - 1联合诱导组分化细胞的体积明显增大 ,细胞直径显著大于 5 -aza诱导组 (P <0 .0 0 1) ,诱导 4周后 ,心肌样细胞出现自发收缩 ,肌钙蛋白 -Ⅰ免疫细胞化学染色阳性 ,对照组及ET - 1组极少见染色阳性细胞。 5 -aza诱导组与 5 -aza +ET - 1联合诱导组的心肌样细胞转化率无显著差别 (P >0 .0 5 )。超微结构观察显示 ,5 -aza +ET -1联合诱导组心肌样细胞原始肌节形成明显增多。结论　在诱导兔BMSCs向心肌样细胞分化的过程中 ,ET - 1发挥了促心肌样细胞肥大及成熟的生物学效应。     

不同浓度5-氮胞苷对骨髓间质干细胞体外诱导分化的作用

目的 :比较不同浓度药物对骨髓间质干细胞(BMMSC)体外向心肌细胞诱导分化的影响 .方法 :分离大鼠BMMSC体外培养 ,分别使用终浓度为 1 ,5 ,1 0和 2 0 μmol·L-1 的 5 氮胞苷 (5 aza)对其定向诱导 ,观察细胞形态学变化 ,荧光免疫组织化学方法进行鉴定 .结果 :BMMSC体外经 5 aza诱导 4wk ,肌钙蛋白、肌动蛋白及Connexin4 3表达阳性 ,1 0μmol·L -1 5 aza组及 2 0 μmol·L -1 5 aza组表达较高 ,但 2 0μmol·L -1 5 aza组 5 0 %细胞死亡 .结论 :BMMSC可以在体外经 5 氮胞苷诱导分化为心肌细胞 ,以 1 0 μmol·L -1 5 aza诱导作用较好     

大鼠骨髓间质干细胞定向诱导分化为心肌细胞

目的体外定向诱导成年大鼠骨髓间质干细胞(BMMSCs)分化为心肌细胞。方法贴壁筛选法分离大鼠骨髓间质干细胞,进行体外扩增。10μmol/L5-氮杂胞苷(5-aza)体外诱导24小时,继续培养3周,免疫细胞化学染色鉴定心肌细胞。结果 5-aza诱导后3周部分细胞横纹肌肌动蛋白染色阳性,细胞密度大的视野可见连结蛋白43染色阳性的闰盘样结构。部分肌管样结构上可见明显的横纹。结论骨髓间质干细胞是骨髓中具有自我更新和多向分化潜能的干细胞,在5-aza诱导下可分化形成心肌样细胞,有望成为细胞心肌成形术(CCM)合适的种子细胞。     

骨髓间质干细胞分离培养及向心肌细胞的转化

目的:探讨骨髓间质干细胞(MsCs)诱导分化为心肌细胞的可能性,为干细胞移植治疗心肌梗死寻求理想的细胞材料.方法:体外分离培养大鼠骨髓MSCs,5-氮胞苷(5-aza)诱导24 h后继续培养,免疫细胞化学染色和RT-PCR检测心肌细胞特异性蛋白的表达.结果:MSCs经5-aza诱导后3周心肌肌钙蛋白T和连接蛋白43免疫细胞化学染色阳性表达;RT-PCR显示诱导3周细胞有心肌肌钙蛋白I、α心肌肌动蛋白表达.结论:MsCs可在体外经5-aza诱导定向分化为心肌细胞.     

黄芪对培养心肌细胞过氧化氢损伤的保护作用

目的 :探讨中药黄芪 (Astragalus,AS)对培养的心肌细胞氧化性损伤的保护作用及其机制 .方法 :体外培养的新生大鼠心肌细胞 ,分为 3组 :①对照组 (Normal组 ) ;②H2 O2组 :H2 O2 (0 .2mmol/L)与心肌细胞共育 1h ;③黄芪 +H2 O2组 :黄芪处理心肌细胞 30min后 ,加入H2 O2 与心肌细胞共育1h .心肌细胞损伤以细胞线粒体活性和乳酸脱氢酶 (LDH)活性来表示 ,同时检测心肌细胞超氧化物歧化酶 (SOD)活性和丙二醛 (MDA)含量 ,均以比色法检测 .结果 :H2 O2 处理细胞后可使细胞LDH活性显著增高 (2 7± 3) μkat/L ,细胞线粒体活性明显下降 0 .36± 0 .0 4 ,SOD活性较正常细胞显著下降(2 31± 2 2 ) μkat/L ,MDA含量显著增高 (1 6± 3) μmol/L .黄芪处理细胞后可显著提高心肌细胞线粒体活性 0 .5 0± 0 .0 5 ,降低LDH活性 (1 6 .4± 1 .8) μkat/L ;并提高细胞抗氧化能力 ,表现为较H2 O2 处理组 ,SOD活性增高 (331± 4 0 ) μkat/L ,MDA含量下降 (1 0 .7± 2 .4 ) μmol/L .结论 :黄芪可对抗H2 O2 对心肌细胞的损伤 ,其机制与提高心肌细胞抗氧化损伤能力有关     

5-氮胞苷与内皮素-1联合诱导大鼠骨髓间质干细胞移植治疗心肌梗死的实验研究

目的　将单纯 5 -氮胞苷 (5 -aza)诱导、5 -aza与内皮素 - 1(ET - 1)联合诱导的骨髓间质干细胞 (BM SCs)所分化的心肌样细胞移植于大鼠心肌梗死区 ,探讨其对缺血心肌的病理学及功能的影响。方法　SD大鼠 2 4只 ,随机分为 3组 :组Ⅰ为对照组 ,组Ⅱ为单纯 5 -aza诱导组 (5 μmol/L) ,组Ⅲ为 5 -aza及ET - 1联合诱导组 (5 -aza 5 μmol/L +ET - 110 -10 mol/L)。组Ⅱ、组Ⅲ动物取胫骨BMSCs进行培养 ,体外诱导后行自体细胞移植。采用冷冻法建立心肌梗死模型 ,采用直接注射法将标记BrdU的待移植BMSCs移植入心肌梗死区 ,对照组注射等量无血清培养基。移植 4周后 ,测定左室血流动力学改变 ,大鼠梗死区免疫组化染色观察移植细胞存活、分化和新生血管形成特征。结果　BMSCs移植 4周后 ,梗死区内可见部分心肌样移植细胞 ,其中 ,组Ⅱ移植细胞胞质内TroponinⅠ染色较浅 ,而组Ⅲ移植细胞胞质内TroponinⅠ染色较深。血流动力学测定结果显示 ,组Ⅱ、组Ⅲ左心室舒张末压 (LVEDP)均显著低于对照组 (P <0 .0 5 ) ;左心室压力变化速率 (+dp/dtmax、-dp/dtmax)则明显高于对照组 (P <0 .0 5或P <0 .0 1)。与组Ⅱ相比 ,组Ⅲ +dp/dtmax显著增高 (P <0 .0 5 )。形态学观察显示 ,移植实验组梗死区内新生血管增多。组Ⅱ、组Ⅲ微血     

体外用条件培养液诱导脐带血间充质干细胞分化成心肌细胞的实验研究

目的 :探讨体外用条件培养液诱导脐带血间充质干细胞分化成心肌细胞的可行性。方法 :用水囊法引产的胎儿心肌制备条件培养液 ,以Ficoll作为离心介质分离脐带血中单个核细胞 (MNC) ,用贴壁法分离出间充质干细胞 (MSCs) ,移入条件培养液中培养 ,已培养的细胞在第 2 0天用心肌特有的抗肌球蛋白重链 (MHC)抗体作免疫组化。结果 :经条件培养液培养的细胞约 2 5 %免疫组化呈阳性 ,对照组均为阴性。结论 :体外用条件培养液可诱导脐带血间充质干细胞分化成心肌细胞     

体外诱导骨髓基质细胞向心肌细胞分化的实验研究

目的：探讨体外诱导骨髓基质细胞向心肌细胞转化的条件。方法：分离大鼠骨髓，体外培养、传代得到骨髓基质细胞，观察不同浓度的诱导剂5-氮胞苷对骨髓基质细胞的生长和诱导作用，进行形态学和免疫组织化学鉴定。结果：5-氮胞苷诱导骨髓基质细胞转化为心肌样细胞，在诱导后2周转化率为29％。心肌特异性肌钙蛋白T(TnT)免疫组织化学染色阳性。结论：MSCs在体外条件下经5-氮胞苷诱导可分化成心肌样细胞。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

[目的] 探讨体外培养定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞 ( MSCs )向心肌样细胞分化的潜能.[方法] 取大鼠下肢骨骨髓,分离培养 MSCs,用 5-氮胞苷 ( 5-aza )定向诱导 24 h,相差显微镜下观察其形态变化,免疫组化法检测肌钙蛋白 ( cTnT )和心肌细胞结蛋白 ( desmin )表达,并通过 RT-PCR对肌球蛋白重链 ( MHC )在细胞中的表达进行鉴定.[结果] MSCs经 5-aza诱导后,部分细胞呈梭形,并可见肌管样结构.免疫组化检测示诱导后 MSCs的 cTnT阳性细胞数为 15%, Desmin表达强阳性, RT-PCR示诱导后 MSCs有 MHC表达.[结论] MSCs在体外能在一定条件下被诱导分化为心肌样细胞,是心肌缺血干细胞移植的较理想的细胞来源.     

3种体外培养方法诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化效果比较

目的：采用3种体外培养方法对骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行诱导分化,探讨体外诱导BMSCs向心肌细胞分化的最佳方法。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法体外分离培养大鼠BMSCs,分为5-氮胞苷（5-aza）组、扩张型心肌病（DCM）模型大鼠心肌细胞裂解液组和DCM模型大鼠血清+5-aza组,同时设对照组（同等条件下在含10%胎牛血清的L-DMEM培养基中培养）,观察细胞形态表现,采用RT-PCR法、Western blotting法和免疫组织化学染色法检测细胞中肌钙蛋白T（cTnT）的表达。结果：密度梯度离心法结合贴壁培养法获得大鼠BMSCs,BMSCs高表达间充质干细胞（MSCs）的特征性表面标记CD44、CD29和CD105,不表达造血干细胞的特征性表面标志CD34;特定诱导条件下,BMSCs可以向成骨细胞及脂肪样细胞分化。体外3种培养方法均可诱导BMSCs表达cTnT,分化为心肌样细胞;5-aza组细胞生长状态差,其余2组细胞生长状态较好,DCM模型大鼠血清+5-aza组细胞中cTnT阳性表达率最高。结论：采用DCM模型大鼠血清联合5-aza诱导BMSCs向心肌细胞分化的效果最佳。     

Induced Differentiation of Human Cord Blood Mesenchymal Stem/Pro genitor Cells into Cardiomyocyte-like Cells In Vitro

Summary:The feasibility of usiug cord blood mesenchymal stem/progenitor cells(CB-MSPCs)to re-generate cardiomyocytes and the optimal inducing conditions were investigated.The CB mononuclearcells were cultured in low serum DMEM medium to produce an adherent layer.After expansion,theadherent cells were added into cardiomyocyte inducing medium supplemented with 5-azacytidine.Cardiogenic specific contractile protein troponin T staining was performed to identify the cardiomy-ocyte-like cells.The results showed that the frequency of CB-MSPCs clones in CB mononuclear cellswas 0.5×10~(-6) and about 1.3×10~7-fold expansion was achieved within 20 sub-cultivation.After car-diogenic induction,70％CB-MSPCs was differentiated into cardiomyocyte-like cells.It was indicat-ed that low serum culture could expand CB-MSPCs extensively and the expanded CB-MSPCs couldbe induced to differentiate into cardiomyocyte-like cells in high efficiency.     

人脐带间充质干细胞向心肌细胞诱导分化并体内移植的研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(MSCs)经5-氮杂胞苷(5aza)诱导后能否向心肌样细胞分化及诱导后细胞移植到心肌梗死大鼠心脏后能否存活,为心肌细胞的移植探索新的细胞来源。方法从人脐带华尔通氏胶培养出MSCs,检测人脐带来源的MSCs的细胞表面标记。经5aza诱导,采用免疫组化方法及RT-PCR方法检测诱导后细胞能否表达心肌细胞标记物,诱导后细胞经5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记后移植到梗死心肌,观察移植后细胞能否存活。结果人脐带间充质干细胞经5aza诱导后能表达心肌细胞标记物,诱导后细胞移植到心肌梗死模型大鼠心肌后细胞能存活。结论人脐带间充质干细胞经5aza诱导能向心肌样细胞分化,诱导后细胞移植至体内能存活,人脐带间充质干细胞可以作为心肌细胞移植的来源。     

心肌细胞体外微环境中骨髓间质干细胞向心肌样细胞的分化

目的：分析心肌组织内何种细胞对骨髓间质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的定向分化起决定作用。方法：利用BMSCs与心肌细胞（cardiomyocytes,CM)、内皮细胞（endothelial cells,EC)共培养和单独培养，分析形态和结构蛋白表达等方面的变化。结果：与CM共培养后，相邻的BMSCs之间融合成肌管样结构，并与相邻胎鼠CM初步形成闫盘样结构。心肌肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC)抗体染色呈阳性。在与EC共培养以及BMSCs单独培养时，BMSCs均未出现肌管样结构，MHC染色呈阴性。结论：CM对BMSCs的定向分化具有一定作用。     

小鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化的形态学观察

目的探讨5-氮胞苷（5-aza）对小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的体外诱导作用。方法分离2同龄小鼠胫骨、股骨，冲洗出骨髓，利用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养的方法获得MSCs。取传2代MSCs培养48h后加10μmol／L5-aza进行诱导，3周后刮取贴壁细胞，离心收集，免疫细胞化学检测心肌特异性蛋白α-actin的表达对所诱导细胞进行鉴定，电镜观察细胞超微结构。结果电镜下见胞质内出现大量肌丝，线粒体数量增多，分布在肌丝周围，可见细胞膜电子密度增高的缝隙连接；免疫细胞化学显示α-actin呈强阳性表达。结论MSCs经5-aza体外诱导分化，可获得形态上类似、表达心肌特异性蛋白的心肌样细胞。     

Induced differentiation of human cord blood mesenchymal stem/progenitor cells into cardiomyocyte-like cells<Emphasis Type="Italic">in vitro</Emphasis>

Summary The feasibility of using cord blood mesenchymal stem/progenitor cells (CB-MSPCs) to regenerate cardiomyocytes and the optimal inducing conditions were investigated. The CB mononuclear cells were cultured in low serum DMEM medium to produce an adherent layer. After expansion, the adherent cells were added into cardiomyocyte inducing medium supplemented with 5-azacytidine. Cardiogenic specific contractile protein troponin T staining was performed to identify the cardiomyocyte-like cells. The results showed that the frequency of CB-MSPCs clones in CB mononuclear cells was 0.5×10⁻⁶ and about 1.3×10⁷-fold expansion was achieved within 20 sub-cultivation. After cardiogenic induction, 70% CB-MSPCs was differentiated into cardiomyocyte-like cells. It was indicated that low serum culture could expand CB-MSPCs extensively and the expanded CB-MSPCs could be induced to differentiate into cardiomyocyte-like cells in high efficiency. CHENG Fanjun, male, born in 1963, Professor     

人脐血间充质干细胞鉴定及用5-氮胞苷诱导后的生物学特性研究

目的探讨脐血间充质干细胞经体外扩增纯化表面CD标志的鉴定及在体外定向分化成心肌样细胞的诱导剂5一氮胞苷（5-aza）作用后的生物学特性。方珐健康妊娠产妇分娩的胎儿脐带血,分离单个核细胞进行培养、传代,取第3代以后细胞用流式细胞仪直接标记分析CD34、CD44、CD90细胞表面标志。10μmmol／L5-aza诱导4周后,进行透视电镜观察,并检测细胞肌球蛋白重链基因的表达。结果体外纯化扩增后的脐血间充质干细胞含有与骨髓来源的间充质干细胞相同的细胞表面标志,第3代以后细胞纯度较高,经5-aza体外诱导培养可形成心肌样细胞。结论脐血间充质干细胞经体外纯化扩增,第3代以后的细胞纯度较高,在体外经5-aza诱导定向分化为心肌样细胞后,其基本的生物学特性未发生改变。