膀胱癌T24细胞中RUNX3基因对Smad4表达的影响

目的 观察RUNX3基因重组质粒转染人膀胱癌T24细胞后细胞增殖及凋亡的变化以及Smad4 mRNA表达的变化,探讨RUNX3基因与转化生长因子-β（TGF-β）/Smad信号通路在膀胱癌发生机制中的作用。方法 构建pIRES-EGFP-RUNX3质粒,将T24细胞分空白对照组（不转染）和空载体质粒组以及重组质粒组。空载体质粒组和重组质粒组细胞分别转染pIRES-EGFP和pIRES-EGFP-RUNX3,转染24 h后采用荧光显微镜观察细胞形态的变化;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;RT-PCR检测各组细胞RUNX3、Smad4基因mRNA表达水平。结果 成功构建pIRES-EGFP-RUNX3重组质粒,显微镜观察发现转染组均出现细胞死亡,重组质粒组出现凋亡细胞;转染24 h后空白对照组凋亡率为（3.23±0.45）%,空载体质粒组为（8.98±1.62）%,重组质粒组为（43.61±2.69）%;RUNX3 mRNA仅重组质粒组有表达（2.79±0.36）,重组质粒组Smad4 mRNA较另两组表达上调(P <0.05)。结论 转染RUNX3基因可上调膀胱癌T24细胞中Smad4 mRNA的表达,且能抑制细胞增殖并促进其凋亡,抑癌基因RUNX3可能通过TGF-β/Smad信号通路参与对膀胱肿瘤细胞增殖与凋亡的调控。     

GRP_(78)在弱精症精子和活力正常精子蛋白中的表达差异研究

目的:探讨GRP78在弱精症精子和活力正常精子蛋白中的表达差异。方法:取50μg正常精子和弱精样品蛋白质,加入上样缓冲液后,沸水浴5min,充分变性蛋白质,100V恒压电泳分离,直至溴酚蓝前沿达到凝胶底部;再用Western-Blot检测GRP78表达变化。结果:GRP78正常精子蛋白样品中高表达,而在弱精子蛋白样品中低表达,Western-Blot检测结果与双向电泳凝胶图中的差异高度吻合。结论:GRP78在弱精子蛋白中低表达,提示GRP78在弱精子症发生中可能扮演着重要角色。     

ABCB4基因的相关疾病研究进展

ABCB4基因编码多药耐药蛋白3（MDR3）主要表达于肝细胞的毛细胆管膜,为磷脂酰胆碱转出酶,将卵磷脂从磷脂双分子层内侧转至膜外的胆汁内。ABCB4基因突变可导致MDR3表达下降和/或功能缺陷从而导致ABCB4缺陷症。随着基因测序的普及和公众对精准医疗的需求,对该基因的深入研究可对以基因型为基础的新治疗方案进行指导。现对ABCB4基因功能和所致疾病新进展进行综述,旨在加强临床医师对ABCB4基因相关疾病的认识。     

生物钟基因Rev-erb和ROR在抗炎及免疫调节中的作用研究进展

生物钟广泛存在于生物体,调节生物的生长发育。随着生物钟分子机制的逐步明确,学者发现生物钟基因Rev-erb和ROR参与许多生理过程,并在抗炎及免疫调节过程中发挥重要作用。针对该类受体的靶向研究可用于调控机体免疫。该文重点介绍生物钟基因Rev-erb和ROR在抗炎及免疫调节中的作用,包括该受体的相关作用机制及针对该受体的配体研究。     

5H-苯并［b］咔唑类化合物的合成与肿瘤细胞增殖抑制活性

为了发现新型选择性拓扑异构酶Ⅱ抑制剂,以偏苯酸酐和吲哚为原料,合成了16个新的5H-苯并［b］咔唑类化合物。探讨了C-9位上了不同取代基对肿瘤细胞增殖抑制活性的影响。采用磺酰罗丹明B蛋白染色法检测了16个化合物对4种肿瘤细胞(SMMC-7721、S1、HCT116和HeLa)的增殖抑制活性。结果表明,其中4个化合物对4种不同的肿瘤细胞株具有明显的增殖抑制活性。其中化合物10e对4种肿瘤细胞株的抑制作用最为显著(IC₅₀分别为:5.06,4.50,5.29和6.32 μmol/L)。     

白鲜皮化学成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性

采用硅胶、凝胶柱色谱方法对白鲜皮(Dictamnus dasycarpus)的化学成分进行分离纯化。从其石油醚部位分离得到了5个化合物,利用IR、MS和NMR等技术对分离得到的化合物进行了结构鉴定。5个化合物的结构分别为:二十二烷醇(1)、2,2-二二苯甲基-3,3-二苯基丙酸乙酯(2)、柠檬苦素(3)、黄柏酮(4)和白鲜碱(5)。其中化合物2为新化合物,化合物1首次从该植物中分离得到。采用PNPG 法筛选化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性。结果表明化合物3~5表现出较好的α-葡萄糖苷酶的抑制活性。该结果为白鲜皮的深度开发利用提供了理论依据。     

西藏小型猪IGF-1基因在不同生长发育阶段和不同组织器官中的差异表达

目的 测定西藏小型猪的IGF-1基因在不同年龄阶段、不同组织中的表达分布情况,为未来的研究提供基础数据。方法 采用实时荧光定量PCR技术,以GAPDH基因为内参照,检测了IGF-1基因在西藏小型猪不同组织和不同生长阶段间的表达变化。结果 （1）IGF-1基因表达的时序性研究表明在0、0.25、0.5、1、2岁时肌肉组织的表达量最低,在0、0.25、0.5岁时皮肤组织中表达量最高,在0.1、2、3岁时肝组织的表达量最高。（2）IGF-1基因在在7个不同组织中均有表达,0.25岁时其在表达丰度由高到低依次为：皮肤、肺、肝、肾、脾、心脏和肌肉。且在皮肤中的表达量最高且极显著高于其他各组织（P<0.01）。同时在不同年龄阶段的表达中,IGF-1基因0.25岁时在各组织中的表达均达到峰值。结论 西藏小型猪的IGF-1基因的表达呈现出明显的时空特异性。     

GATA-2基因高表达在AML1/ETO阳性急性髓系白血病中的临床意义

目的 探讨GATA-2基因在AML1/ETO融合基因阳性急性髓系白血病M2（acute myeloid leukemia with maturation,AML/M2）患者中的表达状况。方法 利用实时荧光定量PCR（RQ-PCR）法对23例AML1/ETO阳性AML-M2患者初诊骨髓标本中GATA-2基因的表达情况进行定量检测,并分析不同表达水平患者实验室检查及临床预后的差异。结果 患者GATA-2基因表达水平（GATA-2基因拷贝数/内参基因拷贝数）初诊时为2.17%~1 260.65%。将GATA-2基因表达水平≥82％者归为高表达组（10例）,表达水平＜82％者归为低表达组（13例）。高表达组与低表达组患者年龄、性别、初始白细胞计数、骨髓原始细胞比例以及化疗完全缓解（CR）率的差异均无统计学意义（P>0.05）,但复发率（71.43％ vs. 15.38％）及死亡率（70.00％ vs. 7.69％）的差异有统计学意义（P均＜0.05）,高表达组的无病生存（DFS）率及总生存（OS）率亦低于低表达组（P<0.01）。在高表达组中,选择移植（2/10）者均无复发存活,选择单纯化疗（8/10）的患者7例死亡。结论 AML1/ETO阳性AML-M2患者合并GATA-2基因高表达提示患者易复发且预后不良,此类患者应尽早采取常规化疗以外的其他有效治疗措施。     

基于CRISPR/Cas9系统定点编辑小鼠MAD2L1基因及其脱靶效应分析

目的 建立利用CRISPR/Cas9系统对小鼠MAD2L1基因第二外显子基因编辑的方法体系,并分析CRISPR/Cas9对MAD2L1基因编辑的脱靶效应。方法 通过CHOPCHOP网站设计位于小鼠MAD2L1基因第二外显子的靶点序列,并构建Cas9-MAD2L1载体,将该载体转染到NIH/3T3细胞中,通过嘌呤霉素筛选并结合荧光显微镜观察GFP后,提取细胞转染后的基因组DNA,利用PCR方法,结合T7E1分析和桑格尔测序,鉴定对小鼠MAD2L1基因编辑情况,并对转染后的NIH/3T3细胞进行CRISPR/Cas9脱靶效应分析。结果 将Cas9-MAD2L1载体转染到NIH/3T3细胞并进行嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜下观察到大量表达GFP的细胞,PCR结合T7E1结果显示,以转染后的细胞DNA为模板扩增出的228 bp MAD2L1 PCR产物,可被酶切成166 bp和62 bp片段,测序结果显示,成功对MAD2L1基因第二外显子靶点处进行基因编辑,脱靶效应分析未检测到CRISPR/Cas9有对脱靶位点进行基因编辑。结论 成功建立对小鼠MAD2L1基因第二外显子进行基因编辑的方法体系,设计的对MAD2L1基因编辑靶点未检测到脱靶效应的发生。     

GPx-1 P198L转基因小鼠模型的建立及鉴定

目的 建立系统性高表达含198位点多态性的胞质型谷胱甘肽过氧化物酶(cellular glutathione peroxidase-1,GPx-1)转基因小鼠(GPx-1P198L),为研究GPx-1P198L在氧化应激相关疾病中的作用提供动物模型.方法 利用显微注射法将限制性内切酶BamH Ⅰ和AccⅠ线性化的GPx-1(198Leu)转基因载体注射到C57BL/6J小鼠受精卵中,建立GPx-1P198L转基因小鼠.PCR鉴定实验后小鼠的基因型,Western blot检测GPx-1蛋白表达.结果 建立了GPx-1p198L首建鼠13只,筛选后9只原代转基因小鼠能产生子代,其中4只原代转基因小鼠产生的子代(F1代)心脏组织高表达GPx-1蛋白,4只小鼠成功建系.结论 建立了系统性表达突变型人GPx-1 (198Leu)的转基因小鼠,为研究GPx-1(198Leu)在氧化应激相关疾病中的作用提供了动物模型.     

FLT3基因表达在急性髓系白血病中的临床意义

目的 研究急性髓系白血病（AML）患者骨髓中FMS样酪氨酸激酶3基因（FLT3）表达水平与FLT3基因内部串联重突变（FLT3-ITD突变）、临床表现和疾病预后的相关性及意义。方法 采用荧光定量PCR法检测128例AML患者初诊时骨髓标本中FLT3基因表达水平,以FLT3基因表达量＜35%作为低表达组,≥35%作为高表达组,并探讨不同FLT3基因表达水平的FLT3-ITD突变、临床症状、实验室检查结果及疾病预后,采用多因素logistic回归分析FLT3基因高表达的影响因素,采用单因素Cox回归和生存曲线进行生存分析。 结果 剔除1例不合格的M2患者RNA样本,最终纳入127例进行分析。AML患者初诊时FLT3表达量为0.01～180.68（均值14.65）。FLT3基因表达水平在WHO的AML分型中M1最高,M6最低,但各亚型间差异不具有统计学意义。FLT3基因高表达组AML患者外周血白细胞计数（WBC）较低表达组高（P<0.01）,且高表达组患者更容易发生贫血及发热临床症状（P<0.05）,多因素logistic回归发现,FLT3基因高表达的可能相关因素为WBC〔回归系数（B）=1.508,比值比（OR）=4.518,95%可信区间（95%CI）：1.465~13.390,P=0.009〕及贫血（B=2.142,OR=8.513,95%CI：3.201~22.644,P<0.001）。 FLT3基因低表达组AML患者完全缓解率（CR）为81.82%（36/44）,高于FLT3基因高表达组38.55%（32/83）,（P<0.05）。生存曲线显示,FLT3基因高表达组患者生存时间较低表达组短（P<0.05）。Cox回归显示, FLT3基因表达高水平患者死亡风险是FLT3基因表达低水平者的3.810倍（B=1.338,相对危险度3.810,95%CI：1.820~7.947,P<0.001）。高表达组总生存率为56.63%,低表达组为70.45%,两组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论 FLT3基因高表达可能与AML患者WBC及贫血症状有关。FLT3基因高表达是AML患者预后不良的指标。     

侵袭性乳腺癌ASPH基因表达与启动子甲基化的临床意义

目的 探讨侵袭性癌（IBC）癌组织中天冬氨酰-β-羟化酶基因(ASPH) mRNA的表达和基因启动子区域甲基化与临床病理参数的关系。方法 收集91例IBC患者癌组织与配对的癌旁正常组织（MNT）,使用逆转录实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测ASPH基因mRNA在组织中的表达,使用甲基化特异性PCR（ＭＳＰ）法检测ASPH基因启动子区CpG 岛甲基化状态,进一步分别分析其表达与乳腺癌临床病理特征的关系。结果 在IBC中ASPH mRNA的表达量高于MNT（P<0.001）,ASPH mRNA的表达与乳腺癌中的标志物E-cadherin阳性表达有关（r=0.195,P=0.041）。ASPH基因在癌组织与MNT中的启动子甲基化阳性率分别为47.3%（43/91）和89.0%（81/91）,差异有统计学意义（P<0.05)。基因启动子甲基化率与E-cadherin和肿瘤大小相关（P<0.05）。结论 ASPH基因的表达及启动子甲基化率可能参与了乳腺癌的发生发展。     

结核分枝杆菌 Rv0757基因的原核表达及其编码蛋白对巨噬细胞功能的影响

目的构建结核杆菌Rv0757基因原核表达重组质粒pET28a-Rv0757,并研究表达的目标蛋白对小鼠骨髓巨噬细胞株ANA-1细胞的作用。方法将扩增出的Rv0757基因重组到原核表达质粒pET28a(+),并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定诱导表达的目的蛋白。纯化目标蛋白后将目标蛋白PhoP作用于小鼠ANA-1细胞,检测活细胞数、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、一氧化氮(NO)和细胞凋亡指标。结果成功构建出pET28a-Rv0757原核表达质粒,诱导表达的目标蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定分析,其相对分子质量约为32×103。目的蛋白作用于小鼠ANA-1细胞后对活细胞数和细胞上清LDH活力无明显影响,但可以明显抑制细胞释放NO和细胞凋亡。结论本研究成功构建了原核表达载体pET28a-Rv0757,并成功表达出目标蛋白,该蛋白对小鼠ANA-1细胞没有毒性损伤,但可以抑制细胞释放NO和细胞的凋亡。     

人VIGILIN基因分段克隆及表达大鼠肾组织干细胞的分离培养与鉴定

目的 探讨人高密度脂蛋白结合蛋白(HDLBP)-VIGILIN蛋白与其他蛋白质相互作用的机制。 方法 根据 VIGILIN基因全长编码区的结构域,将 VIGILIN基因全长编码区分为N端、KH1-7、KH8-12、KH13-14、C端5段,以pDsred2-N1/ VIGILIN为模板分别扩增5个片段及全长cDNA后克隆至pGEX 5X 3原核表达载体, 测序,然后将鉴定后的重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21中进行诱导表达GST-VIGILIN融合蛋白,并用SDS-PAGE电泳及Western blot检测蛋白表达结果。结果 成功扩增了人 VIGILIN基因编码区分段片段,并且构建到原核表达载体中,经酶切、测序鉴定证实序列完全正确,重组载体构建成功,并且在pGEX原核表达系统中诱导表达GST-VIGILIN融合蛋白,经SDS-PAGE电泳及Western blot检测初步证实表达成功。 结论 本实验首次根据VIGILIN蛋白不同的结构域成功构建了GST-VIGILIN分段克隆原核表达载体,并且对融合蛋白表达条件进行了优化,成功表达了GST 融合蛋白。     

N-(4-咪唑甲基)-羟乙基壳聚糖自组装胶束载槲皮素的研究

为了提高天然黄酮类化合物槲皮素的水溶性,将天然高分子材料壳聚糖进行两亲性衍生化制成N-(4-咪唑甲基)-羟乙基壳聚糖(MHC),作为槲皮素自组装聚合物胶束载体,并采用¹H NMR、元素分析法、芘荧光光谱法等进行了表征;同时采用单因素考察法进行了MHC-槲皮素胶束的工艺优化。结果表明,载体浓度为0.67%、槲皮素与MHC质量比为1∶10时可以获得粒径为(99.21±1.71)nm,Zeta电位为+(20.01±0.72)mV,载药量为(5.42±0.32)%的聚合物胶束;其体外释药曲线符合Higuchi方程Q=0.110 1t^1/2-0.064。槲皮素胶束和槲皮素溶液剂静脉注射给药后,在大鼠体内平均滞留时间分别是21.42和0.30 h,AUC_0-t分别为57.49和2.50 μg·h/mL,表明采用MHC为载体材料的槲皮素自组装胶束具有较好的增溶、缓释以及提高生物利用度的作用,可作为槲皮素等抗肿瘤药物的载体。     

土茯苓内生芒果球座菌的次级代谢产物及其抗肿瘤活性研究

目的 研究土茯苓内生芒果球座菌Guignardia mangiferae的次级代谢产物及其抗肿瘤活性。方法 采用硅胶柱、反相硅胶柱、凝胶柱和制备薄层色谱等色谱技术进行分离纯化,通过现代波谱技术进行结构鉴定;以神经胶质瘤细胞SF-268、乳腺癌细胞MCF-7、大细胞肺癌细胞NCI-H460为供试细胞株,采用SRB法对化合物进行体外抗肿瘤活性研究。结果 从土茯苓内生芒果球座菌的100 L液体发酵提取物中分离得到12个化合物,经波谱数据分析鉴定其中10个化合物,分别为15-hydroxyl tricycloalternarene 5b（1）、guignardiaene D（2）、guignardiaene C（3）、guignardone A（4）、guignardone B（5）、3-(4-甲苯氧基)-丙酸（6）、2, 4-壬二醇（7）、麦角甾酮（8）、酪醇（9）、对羟基苯甲醛（10）。杂合萜类化合物1～5对SF-268细胞具有选择性的抑制作用,化合物6、7对MCF-7细胞具有选择性的抑制作用。结论 化合物6～10均为首次从该属真菌中得到,其中化合物6、7为新的天然产物。     

子痫前期患者胎盘组织PHLDA2基因印迹初步研究

目的 观察子痫前期患者胎盘组织母源性印迹基因PHLDA2印迹状态.方法 收集21例正常妊娠和19例子痫前期患者胎盘组织,抽提样本DNA,PCR扩增,选择PHLDA2基因组变异比例较高的单核苷酸多态性(SNP)位点:rs13390为外显子1中C/T多态性(PHLDA2-1),rs1056819为外显子2中G/A多态性(PHLDA2-2),直接测序筛选杂合子.将杂合子样本的RNA逆转录合成cDNA,PCR扩增直接测序判断PHLDA2基因印迹状态.结果 正常妊娠与子痫前期胎盘PHLDA2-1(外显子1)SNP位点(C/T)均未发现杂合子,全为T/T纯合子;胎盘PHLDA2-2(外显子2)SNP位点(G/A)在子痫前期有4例(4/19)、正常妊娠有5例(5/21)杂合子表达,两组杂合子表达差异无统计学意义(P＞0.05).PHLDA2-2杂合子胎盘组织PHLDA2 cDNA均只表达G单等位基因.结论 子痫前期胎盘PHLDA2(PHLDA2-1及PHLDA2-2)基因多态性与正常妊娠相似,未发现PHLDA2基因印迹丢失现象.     

剑叶金鸡菊化学成分及生物活性研究

目的 首次对剑叶金鸡菊Coreopsis lanceolata全草的化学成分和抗菌活性进行研究。方法 采用各种柱色谱进行分离纯化,通过波谱数据分析（MS、NMR等）进行结构鉴定。对化合物1～8的抗菌活性进行了初步筛选。结果 从剑叶金鸡菊全草氯仿部位中共分离得到了15个化合物,其中包含8个倍半萜类化合物,分别鉴定为1β, 5α-diangeloyloxy-eudesm-(15)-ene（1）、1β, 6α-dihydroxyeudesm-4(15)-ene（2）、10α-hydroxyoplopan-4-one（3）、(7R^*)-opposit-4(15)-ene-1β, 7-diol（4）、(7R^*)-opposit-4(15)-ene-1β, 8-diol（5）、(7R^*)-opposit-4(15)-ene-1β, 11-diol（6）、(7R^*)-opposit-4(15)-ene-1β, 7α-diol（7）、4(15)-eudesmene-1β, 7α-diol（8）、对羟基桂皮酸（9）、3-甲氧基-4-羟基苯甲酸（10）、对羟基苯甲酸甲酯（11）、3, 4-二羟基苯甲醛（12）、β-谷甾醇（13）、木栓酮（14）、木栓醇（15）。结论 所有化合物均为首次从该植物中分离得到,化合物3、4对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用。     

KPC-2基因在克雷伯菌属中传播机制研究

目的 研究克雷伯菌属对亚胺培南耐药机制以及KPC-2基因在克雷伯菌属中传播机制。方法 收集四川大学华西医院两个阶段（2009～2010年和2012～2013年）分离的对亚胺培南耐药的克雷伯菌属细菌。琼脂稀释法测定亚胺培南最低抑菌浓度(MIC),CARB ChromID平板和改良Hodges试验检测碳青霉烯耐药表型,PCR检测细菌的KPC-2基因表达。质粒接合试验检测质粒传播性。随机引物扩增多态性DNA（RAPD）方法和肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应（ERIC-PCR）技术分别用于分析质粒和菌株的同源性。结果 第一阶段筛选并确证耐亚胺培南的3株产酸克雷伯菌首先获得碳青酶烯类抗生素耐药性,第二阶段筛选并确证耐亚胺培南的7株肺炎克雷伯菌出现相同的获得性耐药。PCR显示10株细菌均携带KPC-2型基因。质粒接合试验显示产酸克雷伯菌中携带KPC-2基因的质粒可以传递到受体菌,且与KPC-2基因阳性的肺炎克雷伯菌中携带的质粒具有同源性。ERIC-PCR结果显示7株KPC-2基因阳性的肺炎克雷伯菌具有同源性。结论 四川大学华西医院分离的对亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌主要耐药机制是产生KPC-2型碳青霉烯酶。产酸克雷伯菌中携带KPC-2基因质粒,该质粒具有传递性且与肺炎克雷伯菌携带质粒相同。肺炎克雷伯菌中耐药株的传播形式为同一克隆传播,而在克雷伯菌属中不同菌种间耐药传播途径为同一质粒的水平传播。