应用基因芯片研究E2F-1过表达对胃癌细胞免疫相关基因表达的影响

目的利用基因表达谱芯片技术筛选过表达E2F-1的胃癌MGC-803细胞与对照组间差异表达的免疫相关基因,初步探讨E2F-1对胃癌细胞免疫功能影响的机制。方法分别抽取转染E2F-1的胃癌MGC-803细胞和未转染E2F-1的胃癌MGC-803细胞的总RNA．纯化mRNA,逆转录合成cDNA标记后,与22K人类基因表达谱芯片进行杂交,扫描后筛选出与免疫相关的差异表达基因,半定量RT-PCR方法验证差异表达基因。结果在21522条基因中,两组细胞间差异表达的免疫相关基因有10条,其中上调基因2条,下调基因8条。上调基因中有1条功能信息不明。其中myc的RT-PCR结果与基因芯片扫描结果相似,具有相同的方向性。结论利用基因芯片技术筛选出E2F-1过表达影响胃癌细胞免疫功能的相关基因,为今后更深入的研究E2F-1对胃癌免疫功能的影响奠定了基础。     

Cdx2基因过表达对胃癌细胞免疫相关基因表达的影响

目的 利用基因表达谱芯片技术筛选过表达Cdx2的胃癌MGC-803细胞与对照组间差异表达的免疫相关基因. 探讨Cdx2对胃癌细胞免疫相关基因表达的影响。 方法 分别抽取Cdx2转染组和对照组的细胞总RNA,分离纯化mRNA并逆转录合成荧光分子(Cy3/ Cy5)标记cDNA 探针,与含有21522条人类22k基因表达谱芯片进行杂交。采用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪扫描芯片上两种信号,应用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行处理和分析。 结果 在21522条基因中,胃癌细胞间差异性表达基因为有551条,其中302条上调,249条下调。其中与免疫相关的基因共有7个,分别为HLA-E、RRAS、ULBP2、HLA-G、HLA-C、CTSB、CTSL,均表达上调。结论 Cdx2过表达上调了胃癌MGC803细胞免疫相关基因的表达,这可能与胃癌细胞生物学行为的改变有关。     

新型去甲万古霉素-纤维蛋白胶磷酸钙人工骨研究

目的 利用基因表达谱芯片技术筛选过表达Cdx2的胃癌MGC-803细胞与对照组间差异表达的免疫相关基因,探讨Cdx2对胃癌细胞免疫相关基因表达的影响。 方法 分别抽取Cdx2转染组和对照组的细胞总RNA,分离纯化mRNA并逆转录合成荧光分子(Cy3/ Cy5)标记cDNA 探针,与含有21522条人类22k基因表达谱芯片进行杂交。采用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪扫描芯片上两种信号,应用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行处理和分析。 结果 在21522条基因中,胃癌细胞间差异性表达基因为有551条,其中302条上调,249条下调。其中与免疫相关的基因共有7个,分别为HLA-E、RRAS、ULBP2、HLA-G、HLA-C、CTSB、CTSL,均表达上调。结论 Cdx2过表达上调了胃癌MGC803细胞免疫相关基因的表达,这可能与胃癌细胞生物学行为的改变有关。 【关键词】 胃癌;Cdx2;免疫相关基因;差异表达基因     

E2F-1过表达对胃癌细胞生物学行为影响的分子机理初步研究

目的 利用基因表达谱芯片技术筛选过表达E2F-1的胃癌MGC-803细胞与对照组间的差异表达基因,探讨E2F-1对胃癌细胞生物学行为影响的分子机理。方法 分别抽取转染E2F-1的胃癌MGC-803细胞和未转染E2F-1的胃癌MGC-803细胞的总RNA。纯化mRNA,逆转录合成cDNA标记后,与22K人类基因表达谱芯片进行杂交,扫描后筛选出表达差异的基因。随机选取3个差异表达基因,分别设计引物,用半定量RT-PCR检测验证。 结果 在21522条基因中,两组细胞间的差异表达基因有740条,其中上调基因405条,下调基因335条。差异基因中有73条功能信息不明。随机选取的3个差异表达基因的RT-PCR结果与基因芯片扫描结果相似,具有相同的方向性。结论 胃癌的发生发展是多基因相互作用、多种信号通路相互调节的结果。生物信息学分析显示, E2F-1基因可以通过TP53信号传导途径影响胃癌MGC-803细胞生物学行为的改变,还与众多基因的差异性表达密切相关。     

转录因子E2F-1过表达抑制胃癌细胞MGC-803的增殖

目的 了解E2F-1过表达对胃癌细胞MGC-803增殖、生长和细胞周期的影响。方法 PCR扩增E2F-1基因片段;然后经限制性内切酶 EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后将E2F-1定向克隆到真核表达载体pCMV-HA2中转化筛选。用脂质体Lipofectamine2000将该载体转染MGC-803胃癌细胞,然后用含G418的培养基筛选获得具Genectin抗性的过表达E2F-1的胃癌细胞株。RT-PCR和Western blotting技术检测MGC-803/E2F-1细胞内E2F-1表达情况。对稳定转染E2F-1的胃癌MGC-803/E2F-1细胞(实验组)、转染空载体的MGC-803/EV(阴性对照组)及未转染的MGC-803细胞进行MTT法检测,绘制生长曲线和计算细胞增殖率;流式细胞仪检测各组细胞周期分布。结果 RT-PCR和Western blotting 实验证实重组载体pCMV-E2F-1-HA2成功转入胃癌细胞内,并稳定过表达E2F-1。MTT法检测发现,与MGC-803/EV细胞组和MGC-803细胞组相比,胃癌MGC-803/E2F-1细胞的生长受到明显抑制,增殖率下降(26.61±5.19)% vs （93.4±10.29）%、（100±0.00）%,均P <0.01);细胞周期分析显示MGC-803/E2F-1组的细胞在G0/G1期所占比例为70.63%,高于MGC-803/EV组（60.03%,P<0.01）和MGC-803细胞组（60.43%,P<0.01）;MGC-803/E2F-1组的细胞在S期所占比例为(11.27%),明显低于MGC-803/EV组（28.70%,P<0.01）和MGC-803细胞组（29.70,P<0.01）。结论 E2F-1基因过表达抑制胃癌细胞的增殖和生长,细胞周期停滞在G0/G1期。     

CDX2基因过表达促进胃癌细胞凋亡的分子机理研究

目的:利用基因表达谱芯片技术筛选CDX2高表达的胃癌MGC803/CDX2细胞和对照组MGC803/EV细胞中差异表达的基因,探讨CDX2高表达促进胃癌细胞凋亡的分子机理.方法:Trizol一步法提取高表达CDX2的MGC803/CDX2细胞和对照组MGC803/EV细胞的总RNA,并纯化mRNA,反转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)标记的cDNA探针,与22 k基因表达谱芯片进行杂交;采用LuxScan 3.0图像分析软件对芯片图像进行分析,把图像信号转化为数字信号,最后以差异为>2倍或<0.5倍的标准来确定差异表达基因.结果:在23 238个基因中筛选出与细胞凋亡有关的差异性表达基因15条,其中8条基因表达上调和7条基因表达下调.结论:CDX2基因过表达促进胃癌细胞凋亡可能与这15条差异表达基因关系密切.     

E2F-1过表达对胃癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨E2F-1对胃癌细胞生物学行为影响的分子机制.方法 分别抽取转染E2F-1的胃癌MGC-803细胞和未转染E2F-1的胃癌MGC-803细胞的总RNA.纯化mRNA,逆转录合成cDNA标记后,与22K人类基因表达谱芯片进行杂交,扫描后筛选出表达差异的基因.随机选取3个差异表达基因,分别设计引物,用半定量RT-PCR检测验证.结果 在21 522条基因中,两组细胞间的差异表达基因有740条,其中上调基因405条,下调基因335条.差异基因中有73条功能信息不明.随机选取的3个差异表达基因的RT-PCR结果与基因芯片扫描结果相似,具有相同的方向性.结论 胃癌的发生发展是多基因相互作用、多种信号通路相互调节的结果.生物信息学分析显示,E2F-1基因可以通过TP53信号传导途径影响胃癌MGC-803细胞生物学行为的改变,还与众多基因的差异性表达密切相关.     

长链非编码RNA PRNCR1对胃癌细胞增殖、侵袭及转移的研究

探索胃癌MGC-803细胞和人正常胃黏膜上皮GES-1细胞中,长链非编码RNA PRNCR1的表达,以及沉默PRNCR1 对胃癌MGC-803细胞增殖、侵袭及迁移的影响。方法利用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测细胞中PRNCR1 表达水平;设计并合成PRNCR1-siRNA及对照序列（PRNCR1-NC）转染胃癌细胞,通过qRT-PCR 检测细胞中PRNCR1 的沉默效果;利用四甲基偶氮唑盐比色法检测胃癌细胞 的增殖;Transwell实验检测胃癌细胞迁移和侵袭能力的变化。结果PRNCR1 在胃癌MGC-803 细胞中的表达高于人正常胃黏膜上皮GES-1 细胞,PRNCR1-siRNA 可以下调胃癌MGC-803 细胞中PRNCR1 的表达,并可以抑制MGC-803 细胞的增殖和侵袭转移能力。结论PRNCR1-siRNA 能够下调PRNCR1 的表达,并有效抑制胃癌细胞的增殖和侵袭迁移力,为以PRNCR1 为靶点的胃癌基因治疗奠定理论基础。     

SRPX2 在胃癌中的表达及对细胞侵袭的影响

目的 探讨含sushi 重复蛋白X 连锁2（SRPX2）在人胃癌（GC）中的表达及对胃癌MGC-803细胞侵袭能力的影响。方法 收集2014 年3 月1 日-2015 年3 月1 日于该院消化内科行手术切除的45 例胃癌及对应癌旁组织。检测SRPX2 mRNA 及蛋白在胃癌及癌旁组织中的表达情况,分析胃癌组织中SRPX2 蛋白表达对肿瘤临床表型的影响。通过siRNA 下调胃癌MGC-803 细胞中SRPX2 的表达,通过Transwell 侵袭小室检测沉默SRPX2 之后MGC-803 细胞侵袭能力的变化;同时检测沉默SRPX2 后MGC-803 细胞内基质金属蛋白酶2（MMP-2）表达水平的改变。结果 SRPX2 在胃癌组织中表达升高,胃癌组织高表达SRPX2与肿瘤淋巴结转移及高TNM 分期（Ⅲ + Ⅳ期）相关（P <0.05）;沉默SRPX2 表达可抑制胃癌MGC-803细胞的侵袭能力并同时下调了MGC-803 细胞中MMP-2 的表达。结论 胃癌组织中高表达的SRPX2 与肿瘤转移表型关系密切,沉默SRPX2 可能通过下调MMP-2 的表达而抑制胃癌细胞侵袭。     

MicroRNA-152在胃癌细胞中表达及对细胞增殖的影响

目的探讨microRNA-152(miR-152)在胃癌细胞中的表达情况以及对胃癌细胞增殖的影响及其可能的机制。方法采用实时荧光定量PCR(real-timePCR)方法检测胃癌细胞系MGC-803、SGC-7901、BGC-823和胃上皮细胞GES-1(作为对照)中miR-152的表达情况。采用脂质体法,转染miR-152模拟物(miR-152mimics)构建miR-152过表达体系,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测miR-152对MGC-803胃癌细胞系增殖能力的影响,Westernblot检测转染miR-152mimics后E2F3蛋白的表达情况。结果 MGC-803、SGC-7901、BGC-823胃癌细胞系中miR-152的相对表达量分别为(0.05±0.01)、(0.19±0.03)、(0.48±0.09),表明在胃癌细胞中miR-152的表达明显下调(P<0.05)。MTT法检测结果显示,转染miR-152mimics后可明显抑制MGC-803胃癌细胞的增殖(P<0.05)。Westernblot结果表明,转染miR-152后,E2F3蛋白水平显著下降。结论 miR-152在胃癌细胞中明显低表达,并可能通过下调癌基因E2F3的表达,抑制肿瘤细胞的增殖,从而发挥抑癌基因的功能。     

血管生成素-1在体外对人胃癌细胞生物学作用的研究

目的：探讨人血管生成素-1（Ang1）及其与血管内皮生长因子165（VEGF165）共同作用对人胃癌细胞的生物学作用,研究其在肿瘤发生中的作用机制。方法：应用复制缺陷型腺病毒（Ad）．绿色荧光蛋白（GFP）、Ad-Ang1、Ad-VEGF165和Ad-Ang1＋Ad-VEGF165／2转染人胃癌细胞株MGC-803,使用MTT比色法分析它们对胃癌细胞增殖的影响;通过流式细胞仪分析血浆饥饿时其对凋亡的影响;使用免疫细胞化学法检测Ki-67的表达;应用RT-PCR方法半定量检测bcl-2mRNA、bax mRNA的表达情况。结果：MTT结果显示24、48和72h Ad-Ang1转染组、Ad-VEGF165转染组和Ad-Ang1＋Ad-VEGF165／2转染组吸光度均明显高于Ad-GFP组及对照组（P〈0．05）：Ad-GFP组与对照组相比无显著差异（P〉0．05）;Ad-Ang1＋Ad-VEGF165／2转染组吸光度明显高于Ad-Ang1转染组和Ad-VEGF165转染组（P〈0．05）。流式细胞仪检测结果显示Ad-Ang1、Ad-VEGF165及Ad-Ang1＋Ad-VEGF165／2处理组与对照组及空转染组相比均能够显著抑制细胞凋亡（P〈0．01）。免疫细胞化学法显示各转染组Ki-67表达强度均显著高于对照组和Ad-GFP组（P〈0．01）。RT-PCR结果显示bcl-2 mRNA在各转染组中的表达要明显高于对照组（P〈0．05）;bax mRNA在各转染组中的表达要明显低于对照组（P〈0．05）。结论：Ang1、VEGF165和Ang1＋VEGF165／2能够明显促进人胃癌细胞MGC-803增殖,抑制血浆饥饿时的凋亡,Ang1＋VEGF165／2组的作用要显著强于Ang1组和VEGF165组。     

木脂素对MGC-803胃癌细胞的抗增殖作用及其与细胞周期相关蛋白的相关性

[目的]研究木脂素对MGC-803胃癌细胞的抗增殖作用及其与细胞周期相关蛋白之间的相关性．[方法]采用MTT方法检测对照组和实验组各时间段的细胞生存率,利用流式细胞技术检测木脂素对细胞周期的影响,采用免疫细胞化学染色方法检测p53,CDK2,cyclinE及cyclinD1蛋白的表达．[结果]MTT方法检测结果见,药物浓度为25μmol／L时实验组在24,48,72h的生存率分别为82．6％±2．7％,69．1％±4．5％,50．5％±1．7％,与对照组相比较差异均具有统计学意义（P〈0．01）,并具有浓度依赖性．利用流式细胞仪检测细胞周期结果见,G1期细胞增多,S期及G2期细胞减少．免疫细胞化学染色结果见,在24,48,72h时实验组胃癌细胞突变型p53,cyclinD1,cyclinE和CDK2蛋白的阳性表达率与对照组相比较明显降低,各组间差异均具有统计学意义（P〈0．01）．[结论]木脂素对MGC-803胃癌细胞具有明显的抗增殖作用,其机制之一与下调突变型p53,cyclinD1,cyclinE和CDK2蛋白的表达,阻止胃癌细胞从细胞周期G1期进入S期,从而抑制胃癌细胞DNA合成有关．     

赖氨酰氧化酶对胃癌细胞血管生成拟态的影响

目的 研究赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase,LOX）对胃癌细胞MGC-803和BGC-823体外血管生成拟态（vasculogenic mimicry,VM）的影响.方法 培养胃癌细胞,分别加入含有不同浓度LOX或LOX的抑制剂β-氨基丙腈（beta-aminopropionitrile,BAPN）作用72h,用过碘酸雪夫（periodic acid-schiff stain,PAS）染色方法检测VM形成的数量.结果 在两种胃癌细胞株中,随着LOX浓度的增加,VM形成的数量也增加,LOX浓度与VM的形成呈正相关（r=0.847和r=0.851）;此效应可被BAPN抑制,随着BAPN的浓度增加,VM形成的数量相应减少,BPAN与VM的形成呈现负相关（r=-0.791和r=-0.834）.结论 外源性添加LOX可以促进胃癌MGC-803和BGC-823细胞株VM的形成.     

石见穿多糖抑制人胃癌细胞系MGC-803细胞迁移及其机制的初步研究

目的观察石见穿多糖对人胃癌细胞系MGC-803细胞迁移能力的影响,并探讨其作用机制。方法利用水萃取法制备石见穿多糖,通过划痕实验、Transwell实验观察不同浓度对石见穿多糖同样条件培养下胃癌MGC-803细胞迁移能力的影响,并采用Western blot方法检测不同浓度石见穿多糖对MGC-803细胞内白介素8(IL-8)蛋白表达水平的影响。结果同未加药物对照组相比,经高浓度石见穿多糖(50、100 g/L)处理后,MG-63细胞的划痕愈合能力明显减弱,穿膜细胞的数量显著减少;同时,细胞内IL-8蛋白的表达水平明显降低,并与石见穿多糖的浓度有关。结论石见穿多糖抑制了胃癌MGC-803细胞的迁移能力,其作用与抑制MGC-803细胞内的IL-8蛋白表达水平有关。     

稳定过表达Cdx2基因的胃癌细胞株的建立

目的 建立稳定过表达Cdx2基因的胃癌细胞株。方法 使用阳离子脂质体分别将真核表达载体pCMV-Cdx2-HA或空载体pCMV-HA转染至人胃癌细胞MGC-803中,G418筛选出阳性克隆后扩大培养。RT-PCR和Western Blot技术检测各组胃癌细胞中Cdx2基因mRNA和蛋白的表达情况,将挑选出的稳定株命名为MGC-803/Cdx2细胞（转染组）和MGC-803/EV细胞（空载体组）;流式细胞仪检测MGC-803细胞（未转染组）、MGC-803/EV细胞和MGC-803/Cdx2细胞的细胞周期和凋亡情况。结果 成功筛选出稳定过表达Cdx2基因的MGC-803胃癌细胞,即MGC-803/Cdx2细胞;与MGC-803细胞和MGC-803/EV细胞比较,MGC-803/Cdx2细胞中Cdx2基因mRNA和蛋白的表达明显增加（P<0.05）,而且细胞周期G0/G1期比例和凋亡率也明显增加（P<0.05）。结论 成功构建了稳定过表达Cdx2基因的胃癌细胞株,而且Cdx2过表达使细胞周期停滞、凋亡增加。