肝富集转录因子对HBV基因转录和复制的调控作用

目的建立乙型肝炎病毒（HBV）在非肝源细胞的复制体系,探讨肝富集转录因子对HBV基因转录和复制的调控作用。方法用复制型HBV重组质粒pHBV4.1与肝富集转录因子HNF3、HNF4和RXRα/PPARα的表达质粒分别共转染非肝源细胞株NIH3T3。用Northern吸印杂交检测HBV 3.5 kb、2.4/2.1 kb、0.7 kb mRNA的转录情况,Southern吸印杂交检测HBV DNA复制中间体水平。结果复制型HBV重组质粒pHBV4.1在肝癌细胞中能检测到3.5 kb HBV RNA转录产物和HBV DNA复制中间体;用pHBV4.1转染NIH3T3细胞后,在没有肝富集转录因子表达质粒共转染时未能检出3.5 kb HBV RNA转录产物,也无HBV DNA复制中间体;当用肝富集转录因子共转染时,HNF4和RXRα/PPARα的表达能够激活3.5 kb HBV RNA转录和HBV DNA复制,而HNF3未能激活HBV复制,但在HNF4或RXRα/PPARα介导的病毒复制体系中,均见3.5 kb HBV mRNA的转录和HBV DNA复制水平下降。结论利用肝富集转录因子成功地建立HBV在非肝源细胞中的转录与复制。其中,HNF4和RXRα/PPARα可支持HBV在非肝源细胞中转录与复制;HNF3抑制HBV肝特异性基因转录与复制。     

乙型肝炎病毒基因组C区启动子肝富集转录因子结合位点突变对HBx增强乙型肝炎病毒复制的影响

目的:构建乙型肝炎病毒（HBV）C启动子近端肝富集转录因子结合位点突变的重组HBV复制型质粒,以期阐明其在HBx增强HBV复制中的作用。方法:利用定点突变技术在野生型HBV复制型质粒和HBx表达缺失的HBV复制型质粒基础上构建HBV C启动子近端肝富集转录因子结合位点突变的重组质粒。随后在HBV肝癌细胞复制模型和小鼠复...     

肝富集转录因子对乙型肝炎病毒转录与复制的调控

乙肝病毒具有明显的嗜肝性.在非肝源乙肝病毒复制体系中,发现肝富集转录因子在HBV肝特异性复制过程中起重要作用.其中.肝富集转录因子HNF4和RXRα-PPARα是调节前基因组RNA转录和病毒复制所必需,是病毒嗜肝性的重要决定因素之一,而肝富集转录因子HNF3对HNF4和RXRα-PPARα介导的HBV转录和复制具有抑制作用.从而揭示HBV的嗜肝机制涉及HBV感染进入细胞和HBV基因转录复制两个水平的调控.     

La蛋白结合位点缺失的HBeAg mRNA在细胞内的稳定性

目的观察乙型肝炎病毒e抗原mRNA（HBeAg mRNA）上La蛋白结合位点的缺失对其细胞内稳定性的影响,从而进一步研究这个位点在乙肝病毒生命周期中的作用。方法针对HBeAg mRNA上La蛋白结合位点,在HBV DNA水平上利用PCR定点突变技术,构建突变型HBV载体,使其转录出来的HBeAg mRNA缺失La蛋白结合位点,将其命名为pHBV-mLa;应用脂质体将突变型HBV载体瞬时转染HepG2细胞,同时将转染了野生型HBV载体的细胞作为对照组;在各组中,用半定量逆转录PCR（RT-PCR）检测HBeAg mRNA,同时酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清中HBeAg。结果酶切鉴定和碱基测序证明,成功构建了La蛋白结合相关位点部分碱基缺失的突变型HBV载体—pHBV-mLa。转染后半定量RT-PCR检测发现,突变后HBeAg mRNA水平明显低于未突变的对照组,ELISA检测发现突变组中HBeAg表达下调。结论HBV-DNA上引入的突变可以破坏HBeAg mR-NA上La蛋白结合位点,影响HBeAg mRNA在细胞内的稳定性。HBeAg mRNA上La蛋白结合位点对乙肝病毒生命周期至关重要。     

乙型肝炎病毒X基因对c-met基因启动子区的调控作用

目的 明确乙型肝炎X基因(HBx)对c-met基因启动子区的调控及其在肝细胞癌侵袭和转移中的机制.方法 将HBx表达质粒转染HepG2细胞,采用Western blot方法比较转染前后HBx对原癌蛋白质c-met(c-met)表达的影响,进一步将c-met基因启动子区分成5个(包括全部序列)不同长度的片段,然后与PGL3-Basic荧光素酶报告基因系统连接构建成重组质粒,将上述质粒与HBx表达质粒共转染于HepG2细胞中,通过荧光素酶测定、启动子区突变分析及侵袭试验比较转染前后HBx对c-met表达调控的影响.荧光素酶活性值采用ANOVA单因素方差分析,侵袭细胞数统计采用t检验.结果 HBx能够增强c-met的表达;通过对c-met基因启动子区缺失分析,确定了c-met基因启动子区(-183 bp～-100 bp)是HBx作用的调控区域,进一步对该区域可能的转录因子结合位点(SP1-1、SP1-2、AP-2)进行突变分析,发现这3个结合位点均参与了HBx对c-met基因启动子区的调控.测定全部缺失构建体荧光素酶活性结果显示,-184上游部分序列缺失后对HBx的反应有轻微的降低,当-183 bp/-122 bp、-121 bp/-100 bp两个片段缺失后,启动子对HBx的反应均有明显降低,F=40.37,P<0.01;c-met启动子突变分析显示,HBx诱导的荧光素酶活性在SP-1-1、SP-1-2,AP-2突变体组中明显下降,F=235.3,P<0.01.Matrigel侵袭试验检测结果显示,转染pCEP4-X-FLAG表达质粒的HepG2细胞侵袭性增加,穿膜细胞数为(74.33±6.24)个,而未转染组穿膜细胞数为(28.24±3.05)个,t=9.68,P<0.01.结论 HBx引起肝细胞癌的侵袭转移可能是通过对c-met基因启动子区(-183 bp～-100 bp)转录因子SP-1、AP-2结合位点的调控来实现的,但是该过程中所涉及的信号通路仍有待进一步研究.     

PAX6对肝癌细胞HNF1α基因表达的调控作用

背景：前期研究显示肝细胞核因子1α（HNF1α）在人肝细胞癌（HCC）中表达下调,上调HNF1α表达可显著抑制HCC细胞增殖和小鼠肝脏原位移植瘤生长。然而HNF1α在HCC中表达下调的机制仍有待明确。目的：探讨HCC细胞中HNF1α基因表达调控的分子机制。方法：应用JASPAR软件预测HNF1α启动子上潜在的转录因子结合位点。联合应用含HNF1α启动子的报告基因系统荧光素酶活性检测和点突变技术,研究JASPAR软件预测的配对盒基因6（PAX6）对HNF1α启动子转录活性的影响;以染色质免疫共沉淀实验检测PAX6与HNF1α启动子的相互作用,实时荧光定量RT—PCR（qRT—PCR）和蛋白质印迹法验证PAX6对HepG2细胞内源性HNF1α表达的影响;qRT—PCR检测PAX6、HNF1α在人HCC组织样本中的表达,并以Spearman等级相关系数分析两者间的相关性。结果：PAX6可直接结合至HNF1α的启动子区域,在转录水平促进HNF1α表达。人HCC组织中PAX6表达明显降低,并与HNF1α表达呈显著正相关（rs=0．7530,P〈0．0001）。结论：PAX6可调控HCC细胞中的HNF1α基因表达,其表达下凋可能与HCC的发生、发展有关。     

纤维蛋白原α链剪切位点IVS2＋1G〉C突变导致的遗传性低纤维蛋白原血症

目的：探讨遗传性低纤维蛋白原（Fg）血症的分子发病机制。方法：检测凝血指标以明确诊断；用DNA直接测序法对患者Fg基因FGA、FGB和FGG的所有外显子及其侧翼序列进行测序以寻找基因突变，对有突变的序列反向测序证实；通过逆转录结合巢式PCR扩增的方法，检测患者外周血中的Fg异位转录产物；构建含有突变点的突变型FGA小基因（minigene）质粒和野生型FGA小基因质粒，将2种质粒分别转染人胚肾（HEK）293T细胞，抽提RNA．逆转录PCR（RT—PCR）后TA克隆测序。结果：先证者呈FGA基因剪切位点IVS2＋1G〉C杂合突变；对于该突变，逆转录结合巢式PCR的产物经克隆后测序只检测到正常转录本，而没有发现异常转录本：突变型FGA小基因质粒转染HEK293T细胞后．抽提RNA再经RT-PCR、TA克隆、测序，揭示剪接过程中发生了FGA基因2号内含子滞留，导致终止密码的提前出现．从而使异常转录的mRNA在体内很快被降解。结论：异位转录结合体外表达证明先证者FGA基因剪切位点IVS2＋1G〉C突变导致异常转录mRNA在体内很快被降解，是先证者低Fg血症的原因之一。     

过氧化物酶体增殖物辅助激活因子1 α基因多态性对糖异生基因转录的影响

目的 研究过氧化物酶体增殖物辅助激活因子1α（PGC-1α）基因482号密码子甘氨酸-丝氨酸突变（Gly482Ser）多态性对糖异生关键基因磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（PEPCK）转录的影响.方法 （1）应用寡核苷酸诱导的定点突变和PCR技术构建PGC-1α 1444位点基因多态性表达质粒,并用普通PCR和酶切方法构建连接荧光素酶报告基因的人PEPCK启动子报告质粒PGL3-hPCK-luc.分别将PGC-1α基因482号密码子为甘氨酸的野生型表达质粒pcDNA3.1-PGC-1α（G）或482号密码子为丝氨酸的突变型表达质粒pcDNA3.1-PGC-1α（S）,与转录因子肝细胞核因子4α（HNF4α）表达质粒pcDNA3.0-HNF4α共转染进培养的人肝癌细胞及人正常肝细胞株.（2）转染48 h后检测细胞株内PGC-1α及PEPCK的mRNA水平及蛋白水平.进一步按不同组合联合转染PGL3-hPCK-luc及内参质粒PRL-SV40,培养48 h后用双荧光素酶检测试剂盒检测细胞荧光素酶的相对活性.多组间比较用单因素方差分析,2组组间比较用独立样本t检验.结果 成功构建PGC-1α 1444位点突变质粒及PGL3-hPCK-luc荧光素酶报告质粒.瞬时转染进HepG2细胞中,PGC-1α（G）与PGC-1α（S）质粒转染组PGC-1α mRNA及蛋白表达水平均明显增加,但2组间无明显差异（P＞0.05）;联合转染PGC-1α和HNF4α组的PEPCK的mRNA及蛋白表达水平较单转染PGC-1α明显增高（分别为10.40±0.70、4.50±0.50和0.86±0.18、0.99±0.09,均P＜0.05）;转染PGC-1α（G）＋HNF4α组较PGC-1α（S）＋HNF4α组PEPCK的mRNA及蛋白表达水平分别增高1.83倍和1.4倍（分别为10.40±0.70、5.35±0.23和4.50±0.50、3.00±0.40,均P＜0.05）.转染PGC-1α＋HNF4α组可显著促进PEPCK启动子活性（与单转染PGL3-hPCK-luc组比较）（分别为28.0±5.0和2.4±0.4,F=23.41,P＜0.05）;在HepG2中联合转染HNF4α时,PGC-1α（G）组较PGC-1α（S）可使PEPCK启动子相对活性增高2倍（分别为83±10和41±5,F=23.41,P＜0.001）;在L02细胞中联合转染HNF4α时,PGC-1α（G）组较PGC-1α（S）可使PEPCK启动子相对活性增高2.25倍（分别为28.0±5.0和12.6±1.5,F=60.75,P＜0.001）.结论PGC-1α可辅助激活HNF4α对PEPCK转录的促进作用,而PGC-1α基因Gly482 较Ser482对HNF4α的蛋白辅助激活作用更强,这可能为基因多态性引起蛋白表达后不同构型影响蛋白-蛋白相互作用有关.     

HNF4α与肝细胞分化调节

肝脏基因表达受肝富集转录因子(LETFs)的调控,这类肝脏内优势表达的转录因子在调控肝细胞分化和维护肝细胞生物学功能发挥重要作用[1].肝细胞核因子(HNF)是LETFS的重要组成,HNF家族包括HNF1、HNF3、HNF4、HNF6、CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)、D结合蛋白(DBP),对肝脏基因特异性表达起着关键的调控作用.HNF4是一种细胞核激素受体超家族的转录因子[2],包括3个亚型:HNF4α,-4β,-4γ,其组织表达谱差异较大.HNF4α和HNF4γ具有70％同源性,DNA结合区的氨基酸序列非常类似.     

State of knowledge of helminth fauna of freshwater fishes of Poland

A total 89 fish and lamprey species has been recorded from Polish freshwater habitats. Twenty-seven of them (30.3%) have not been surveyed for parasitic helminthes. Some of the latter fishes are either rare or not easily accessible. Other live only in specific habitats in scattered localities. An important obstacle for studying parasite faunas of some fishes may be their status on an endangered species. Among the non-surveyed fishes, are those which have been relatively recently introduced to Poland or migrated there on their own. The present paper attempts to review all hitherto not studied helminthologically fish species, their habitats, localities and current protection status.     

高血压降压治疗目标的再认识

根据传统的高血压水平的定义,1993年WHO高血压治疗指南提出血压控制目标为<140/90mm Hg(1mm Hg=0.133kPa),但是并非所有患者都必须将血压降至同一水平,而应根据患者情况进行个体化治疗。Framingham进行的一项长达10～12年的心血管事件研究发现,第5年后,正常上限血压[收缩压(SBP     

Lack of correlation of degree of villous atrophy with severity of clinical presentation of coeliac disease

BACKGROUND AND AIM: Both the clinical presentation and the degree of mucosal damage in coeliac disease vary greatly. In view of conflicting information as to whether the mode of presentation correlates with the degree of villous atrophy, we reviewed a large cohort of patients with coeliac disease. PATIENTS AND METHODS: We correlated mode of presentation (classical, diarrhoea predominant or atypical/silent) with histology of duodenal biopsies and examined their trends over time. RESULTS: The cohort consisted of 499 adults, mean age 44.1 years, 68% females. The majority had silent coeliac disease (56%) and total villous atrophy (65%). There was no correlation of mode of presentation with the degree of villous atrophy (p=0.25). Sixty-eight percent of females and 58% of males had a severe villous atrophy (p=0.052). There was a significant trend over time for a greater proportion of patients presenting as atypical/silent coeliac disease and having partial villous atrophy, though the majority still had total villous atrophy. CONCLUSIONS: Among our patients the degree of villous atrophy in duodenal biopsies did not correlate with the mode of presentation, indicating that factors other than the degree of villous atrophy must account for diarrhoea in coeliac disease.