重组HDV核酶逆转录病毒的生产及对HBV抑制效率的测定

目的:构建含HDV核酶基因的重组逆转录病毒载体,包装出逆转录病毒实现其在HepG2215细胞中稳定表达,并研究其是否抑制HBV的复制。方法:应用PCR方法扩增HDV核酶基因,克隆入逆转录病毒载体pMSCV/U6中,用脂质体法转染逆转录病毒载体包装细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株,用PCR和药物抗性水平传播分析检测野生型辅助病毒。收获的病毒感染HepG2215细胞,用酶联免疫实验测定对HBV的抑制率。结果:重组逆转录病毒载体的酶切鉴定片段约为73bp,与预期值一致。脂质体转染包装细胞,嘌呤霉素加压筛选出高病毒滴度(4.0×10⁶ CFU/ml)的细胞克隆,且未检测到辅助病毒,对HBV的抑制率最高可达61.56 %。结论:成功构建重组逆转录病毒载体,在包装细胞系中能生产出高滴度的逆转录病毒,能有效的抑制HepG2215细胞内HBV的复制,为HBV的基因治疗提供了实验数据。     

HBV全基因真核表达载体的构建及表达

目的：为诱导HBV特异性CTL，构建HBV全基因真核表达载体，并对其在细胞中的表达进行了初步研究。方法：以EcoRⅠ酶切pBR322-2HBV和pcDNA3，回收完整的HBV基因片段及线性化的载体pcDNA3，T4 DNA连接酶连接HBV和pcDNA3，转化、筛选，酶切鉴定HBV的插入方向。以脂质体将构建的pcDNA3-HBV转染HepG2肝癌细胞，经G418筛选，ELISA检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的表达，RT-PCR检测转染细胞中PreSl mRNA的表达。结果：经酶切鉴定获得正向插入的pcDNA3-HBV，转染HepG2后，建立了新的肝癌细胞系HepG2．02G，细胞培养上清中可检测到高水平的HBsAg，PreSl mRNA在转染细胞中表达。结论：经体外重组，获得携带全长HBV基因片段的pcDNA3-HBV表达载体，并可在肝癌细胞中稳定表达。     

HBV全基因组克隆转染细胞系的建立

目的:建立HBV体外细胞培养体系. 方法:构建HBV全基因克隆质粒pcDNA3-3HBV,稳定转染HepG2细胞,G418筛选. ELISA检测细胞上清液HBsAg,HBeAg的表达,免疫组化检测细胞内HBcAg的表达,RT-PCR检测细胞S基因mRNA的表达,PCR检测细胞上清液DNA. 结果:成功构建了HBV全基因克隆质粒pcDNA3-3HBV,稳定转染HepG2后,培养上清HBsAg,HBeAg阳性,细胞内HBcAg呈核浆型分布,且以浆型分布为主. RT-PCR证实有HBV S基因 mRNA 的表达,上清中HBV S及前S基因阳性,荧光定量PCR检测显示培养上清中HBV 滴度达1×108拷贝/L. 结论:重组质粒pcDNA3-3HBV能在HepG2细胞中表达、转录、复制,该细胞培养体系能产生较高水平的HBV.     

siRNA抑制乙型肝炎病毒在HepG2.2.15细胞中的复制与表达

目的 探讨靶向HBV S基因的siRNA表达质粒在HepG2.2.15细胞中对HBV病毒的复制与表达的抑制效应及其抗病毒活性.方法 设计并构建了两个靶向HBV S基因的siRNA表达质粒S1和S2,随机设计的用于对照的非同源siRNA表达质粒S3.首先在HepG2.2.15细胞中通过实时荧光定量PCR评估该siRNA表达质粒对HBV mRNA表达的抑制效应,接着在HepG2.2.15细胞中通过ELISA方法进一步枪测它们的抗病毒活性细胞上清液中HBV标志性蛋白HBsAg、HBeAg的表达水平.结果 在siRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞后48 h,HBV S基因mRNA表达量下降64%～88%,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了60%～82%和56%～78%.S1+S2联合使用转染细胞中显著抑制HBV病毒的复制与表达的效率,而对照组S3无抑制效果.结论 发现靶向HBV S基因的siRNA表达质粒能够在HepG2.2.15细胞中有效的抑制HBV病毒的复制与表达,并能够降低细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平.S1+S2联合使用转染细胞中可以显著抑制HBV的复制与表达的效率.RNAi可能成为防治HBV感染有效的全新的抗病毒防御策略.     

针对HBVS区的siRNA的抗病毒活性

目的: 体外观察siRNA对HepG2 2.2.15细胞中乙型肝炎病毒(HBV)S-mRNA及HBsAg,HBeAg产生的影响. 方法: 设计并合成针对HBV S区的三条siRNA,构建含上述siRNA的表达载体pSilencer ZY1,pSilencer ZY2和pSilencer ZY3,pSilencer HK2测序及酶切鉴定后用脂质体介导重组质粒转染HepG2 2.2.15细胞,用酶免分析法对HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg进行检测,用逆转录聚合酶链反应检测HBV S-mRNA.结果: 成功构建了针对HBV S区的siRNA的表达载体,三条siRNA均可程度不同地抑制HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg的分泌,72 h抑制率达高峰,对HBsAg的抑制率分别为81%,29%及78%,对HBeAg的抑制率分别为35%,3%及49%,并有抑制HBV S-mRNA的作用.结论: 针对HBV S区的siRNA能明显抑制HBV的复制.     

APOBEC3G真核表达载体的构建及其对HBV复制表达的影响

目的:构建APOBEC3G真核表达载体,在体外初步探讨APOBEC3G对HBV复制表达的影响。方法:应用RT-PCR法从人PBMC细胞中扩增APOBEC3G基因,分子克隆法构建表达APOBEC3G蛋白的真核表达载体pcDNA3.1-APOBEC3G,并脂质体法转染HepG22.2.15细胞。Western-blot鉴定细胞中APOBEC3G蛋白的表达。ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg水平,实时定量PCR检测HBVDNA和HBV mRNA水平。结果:经酶切鉴定及测序证实APOBEC3G真核表达载体被成功构建,APOBEC3G蛋白可在HepG22.2.15细胞中表达。转染APOBEC3G重组质粒的HepG22.2.15细胞的HBsAg、HBeAg、HBVDNA及HBV mRNA水平均明显低于未转染重组质粒的HepG22.2.15细胞。结论:APOBEC3G明显抑制了HepG22.2.15细胞中HBV的复制与表达,成功构建APOBEC3G真核表达载体,为深入研究APOBEC3G抗HBV的作用机制奠定实验基础。     

MXA蛋白抑制HBV复制的体外研究

目的 研究MXA蛋白抑制HBV复制的活性.方法 将pcDNA3.1-MXA重组质粒和PU19-1.24 HBV重组质粒分别按1:1、2:1共转染HepG2细胞(MXA组),对照组使用空pcDNA3.1、Salon DNA和PU19-1.24 HBV重组质粒共转染,3 d后Western blot检测MXA蛋白表达,Abbott法检测细胞上清HBeAg和HBsAg分泌量,定量PCR检测上清和胞内HBV DNA水平,统计学分析结果 .pcDNA3.1-MXA与PU19-1.24HBV重组质粒共转染HepG2细胞,对照组为pcDNA3.1-MXA重组质粒、PU19空质粒和Salon DNA共转染,3 d后裂解细胞Western blot检测MXA蛋白表达.结果 Western blot显示MXA组有MXA蛋白表达;与对照组相比,pcDNA3.1-MXA和PU19-1.24 HBV重组质粒按1:1转染时,MXA组HBeAg下降27%,上清HBV DNA和细胞内HBV DNA分别下降1个log值和0.6个log值;按2:1比例转染时MXA组HBeAg较对照组下降66%,上清HBV DNA和细胞内HBV DNA水平分别下降1.9个和1.7个log值,差异均具有统计学意义(P＜0.05).Western blot检测显示MXA蛋白抑制HBV组与对照组MXA蛋白表达没有明显差别.结论 MXA蛋白在HepG2细胞具有抑制HBV复制活性,抑制活性与蛋白的表达量相关;在抑制HBV复制过程中MXA蛋白自身可能不发生降解.     

瞬时转染和稳定转染对RNAi抑制乙型肝炎病毒S基因表达的影响

目的:构建针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因的siRNA表达载体Psuper-S1和Psuper-S2,观察瞬时转染及稳定转染对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.方法:设计并合成针对HBV S基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入Psuper载体,构建成功的siRNA表达载体分别瞬时转染和稳定转染表达HBV的2.2.15细胞,对所得细胞上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,RT-PCR检测siRNA对靶基因Mrna的抑制效果,并比较两种转染方式对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.结果:在稳定转染并经潮霉素筛选所得的单克隆细胞株中,Psuper-S1和Psuper-S2均能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌(P<0.01),抑制率分别为83%和78%,RT-PCR结果证实HBV的Mrna明显降低,而瞬时转染细胞在蛋白质水平上及Mrna水平上的结果则比稳定转染的结果逊色.结论:针对HBV S基因的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达,转染效率对于靶基因的RNA干涉作用有明显的影响.     

人γ-干扰素真核表达载体的构建及其体外抑制HBV的作用

目的 观察携带人γ干扰素(IFN-γ)基因的真核表达载体(pcDNA3.1-IFN-γ)体外转染hepG2.2.15细胞后抑制乙型肝炎病毒(HBV)的作用.方法 利用PCR技术和基因重组方法构建表达人IFN-γ的真核表达载体,体外转染hepG2.2.15细胞后收集细胞培养上清液,用ELISA法检测人IFN-γ蛋白的分泌量.并分别用荧光定量PCR和ELISA试剂盒检测细胞培养上清中病毒释放的HBV-DNA和HBeAg、HBsAg抗原含量.结果 转染pcDNA3.1-IFN-γ组细胞HBeAg含量比空载体阴性对照组和空白2.2.15细胞对照组下降了49%,而两个对照组间HBeAg含鼍无显著差异;HBsAg含量比宅载体阴性对照组下降了35%、比空白2.2.15细胞对照组下降了33%,两个对照组问HBsAg含量无显著差异.同时,转染pcDNA3.1-IFN-γ组细胞上清中HBVDNA含量比两个对照组均显著降低,而对照组间HBVDNA含量无显著差异.结论 成功构建了人IFN-γ真核表达载体并可以在体外有效抑制HBV复制,为将人IFN-γ应用于抗HBV的基因治疗奠定基础.     

RNA干涉对乙型肝炎病毒复制和表达的影响

目的：观察HBV S区和C区特异性的小发夹RNA（shRNA）表达载体对HepG2.2.15细胞中HBV复制和表达的影响。方法：采用含有pol Ⅲ启动子的真核表达载体pSilenceCircle-U6构建针对HBV S区和C区的特异性shRNA表达质粒SC-S和SC-C。实验设立SC-S组、SC-C组、无关对照SC-N组和空白对照组,采用不同浓度的重组载体转染HepG2.2.15细胞,并作用不同时间。应用ELISA方法检测细胞上清液中的HBeAg和HBsAg,用斑点杂交方法检测细胞上清中的HBV DNA。结果：成功构建了含目的序列的重组质粒SC-S和SC-C。SC-S对HBeAg和HBsAg表达的抑制率明显高于SC-C;随着给药浓度的增加,SC-S对HBeAg和HBsAg表达的抑制率逐渐增强;SC-S转染HepG2.2.15细胞后第3天产生明显抑制效应,对HBeAg及HBsAg表达的抑制率在第6天达高峰,第9天抑制率仍较高。斑点杂交结果显示,SC-S对HBV复制的抑制效应强于SC-C。结论：构建的HBV S区和C区特异性shRNA表达质粒有明显、高效抑制HBV复制和表达的作用。     

脱氧胆酸对HBV复制及肝癌细胞自噬影响的研究

目的 观察脱氧胆酸(deoxycholic acid, DCA)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)复制的影响，及其对肝癌细胞自噬的影响程度，探讨其可能的作用机制。方法 观察不同浓度DCA对HepG2及HepG2.215细胞活性的影响，进而测定不同浓度DCA对HepG2.215细胞HBV DNA的载量及HBsAg、HBeAg和HBcAg表达水平的影响，蛋白免疫印迹检测自噬水平；将HepG2.215细胞转染乙型肝炎病毒X(HBX)蛋白突变表达质粒后，观察HBX对DCA处理的HepG2及HepG2.215细胞的HBV DNA载量以及HBsAg、HBeAg和HBcAg表达水平的影响，蛋白免疫印迹检测细胞自噬水平。结果 (1)CCK-8实验结果显示随着DCA浓度的升高，细胞活力均呈现梯度下降趋势(P<0.01);(2)HepG2.215细胞的HBV DNA载量以及HBsAg、HBeAg、HBcAg水平均随着DCA浓度的提高而上升(P<0.01);(3)HepG2与HepG2.215细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高(P<0.01),HepG2细胞的...     

人MxA基因重组真核载体抗乙型肝炎病毒作用的实验室研究

目的:研究重组真核载体PcDNA3.l-MxA体外抗HBV的作用,为研究MxA基因(myxovirus-resistant A)治疗慢性HBV感染奠定基础.方法:将构建成功的重组真核载体PcDNA3.l-MxA转染入HepG 2.2.15.将HepG 2.2.15分为实验组(转染PcDNA3.1-MxA的HepG 2.2.15)和对照组(转染PcDNA3.1的HepG 2.2.15),应用RT-PCR方法检测两组HepG2.2.15内MxAmRNA(P<0.01),并应用ELISA法检测两组HepG2.2.15内HBsAg、HBeAg的水平.结果:RT-PCR扩增结果显示实验组的MxAmRNA水平均较对照组明显升高,实验组HBsAg、HBeAg水平明显低于对照组(均P<0.01).结论:转染重组真核载体PcDNA3.l-MxA HepG2.2.15内MxA蛋白明显抑制了HBV DNA的复制及表达,为进一步研究MxA蛋白体内抗病毒作用提供理论.     

紫红獐牙菜醋酸乙酯部位体外抗乙型肝炎病毒作用的研究

目的观察紫红獐牙菜醋酸乙酯部位抗乙型肝炎病毒的作用。方法在对2215细胞最大无毒浓度范围内,将含有不同浓度醋酸乙酯提取物的DMEM培养液加入2215细胞共同培养8天。采用固相放免实验方法,检测药物对2215细胞HBsAg和HBeAg表达的作用。结果供试品对乙型肝炎病毒转染的2215细胞培养液中HBsAg、HBeAg的选择指数(SI)分别为5.13和4.08。结论紫红獐牙菜醋酸乙酯部位在体外有抗HBV的作用。     

乙型肝炎病毒表面抗原单链抗体细菌内免疫抗乙型肝炎病毒基因治疗研究

目的：研究乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg)人源单链可变区抗体（ScFv)细胞内免疫抗乙型肝炎病毒（HBV）基因治疗的作用。方法：用噬菌体表面展示技术筛选特异性的HBsAg人源单链可变区抗体，聚合酶链反应（PCR）法扩增HBsAg单链抗体基因，并构建表达HBsAg ScFv基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-HBsAg ScFv,转染PA317细胞，将转染细胞分泌的假病毒颗粒感染2．2．15细胞，酶联免疫吸附法（ELISA）检测其上清HBsAg和HBeAg，定量检测HBV DNA。结果：成功筛选出HBsAg ScFv,PCR扩增出750bp的全基因，构建HBsAg ScFv基因的逆转录病毒载体，转染PA317细胞，在上清中检测出含HBsAg ScFv假病毒颗粒的存在，上清感染2．2．15细胞后第3、5、7、14天，HBsAg,HBeAg逐渐下降，到第14天时HBsAg已变为阴性，DNA定量检测无明显变化。结论：HBsAg ScFv能成功地在逆转录病毒载体中表达，并有抑制HBsAg,HBeAg表达的作用。     

外源性microRNA介导的RNA干扰抑制HBV复制和表达

目的 设计并构建靶向HBV的外源性microRNA表达载体,观察其对HBV表达和复制的抑制作用.方法 以HBV P基因和X基因为靶基因,根据pcDNA6.2-G/W-miR载体要求,设计靶向HBV的microRNA序列,进行直接合成获得目的 片段并克隆到载体中,测序正确的载体通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR、乙肝五项定量和荧光定量PCR检测其对HBV mRNA和HBV DNA的抑制作用.结果 质粒的转染效率为50%～60%,在这种状态下,外源性microRNA表达载体在HBV mRNA和HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平上均能显著抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达(P＜0.05).结论 外源性microRNA表达载体构建成功,并能抑制HBV靶基因的表达,为其在慢性HBV感染基因治疗中的应用奠定了基础.     

土贝母皂甙对HBV转染的HepG2 2.2.15细胞分泌HB-sAg和HBeAg的抑制作用

目的观察土贝母皂甙对乙型肝炎病毒(HBV)基因转染的人肝癌细胞系2215细胞的毒性及其分泌的HBsAg和HBeAg的抑制作用.方法以MTT比色法观察药物的细胞毒性,以酶联免疫吸附(ELISA)法检测培养上清中HBsAg和HBeAg的表达.结果不同浓度的土贝母皂甙对HBsAg和HBeAg的分泌均有一定的抑制作用,药物作用到48h时对HBsAg和HBeAg的抑制作用最强(P＜0.01),且对HBeAg的抑制作用强于拉米夫定;在0.01ug/ml浓度下无明显细胞毒性作用.结论体外细胞培养表明,土贝母皂甙对HBV有抑制作用.     

Caveolin-1的低表达与乙型肝炎病毒感染相关肝细胞癌的关系研究

目的研究小窝蛋白-1(Caveolin-1)的表达与乙型肝炎病毒(HBV)感染以及相关肝细胞癌(HCC)的关系。方法免疫组化法检测HBV相关HCC中Caveolin-1表达量。构建Caveolin-1重组质粒,用Western blot检测转染了重组质粒的HepG2.2.15细胞中Caveolin-1表达量,并用ELISA法检测转染后培养上清中的HBsAg。结果免疫组化结果显示Caveolin-1在95%HBV相关HCC组织中表达低于癌旁组织(P<0.05)。Caveolin-1重组质粒构建成功并在HepG2.2.15中成功表达。ELISA检测发现用Caveolin-1重组质粒转染HBV感染稳定模型HepG2.2.15细胞48、72 h后,细胞培养上清中的HBsAg浓度相对未转染细胞分别下降了46.2%和48.8%(P<0.05)。重组质粒转染HBV感染急性细胞模型48、72 h后,HBsAg浓度相对未转染细胞分别下降了41%和50%(P<0.05)。结论 Caveolin-1在HBV相关HCC中呈低表达,Caveolin-1的高表达抑制了HBV HBsAg的分泌。     

逆转录病毒载体介导HBV前C/C反义RNA的体外抗HBV作用

目的：了解反义乙型肝炎病毒(HBV)基因转移、表达的抗HBV作用。方法：BamH Ⅰ酶切HBV质粒获取1504bp前C／C基因片段，将其正、反向插入逆转录病毒载体pDOR构建了正、反义前C／C重组体。将重组体转染逆转录病毒包装细胞PA317，G418筛选获取抗性细胞及假逆转录病毒。RT-PCR检测了反义HBV基因表达的反义RNA。将重组假逆转录病毒感染2．2．15细胞，ELISA及斑点杂交法分别检测被感染细胞培养上清中HBsAg、HBeAg及HBV DNA。结果：反义前C／C重组逆转录病毒载体在细胞内能转录HBV反义RNA。反义前C／C重组假病毒感染的2．2．15细胞HBsAg、HBEAg的合成分别降低了55．5％、78％；HBV DNA水平也明显低于空白对照组。该抑制具有一定特异性。增加假病毒感染次数在一定范围内能提高抑制作用。正义假逆转录病毒感染对2．2．15细胞HBV DNA水平及抗原合成无影响。结论：逆转录病毒载体介导反义HBV基因转移表达的反义RNA能抑制HBV复制及抗原合成，具有潜在应用价值。     

靶向X基因shRNA特异抑制HBV基因表达和复制

目的:研究针对HBV X基因小发夹RNA(shRNA)对HBV基因表达和复制的抑制作用。方法:利用分子克隆方法构建了4个HBV X基因特异性shRNA的表达质粒pshHBx1-4,与HBV复制性质粒共转染HepG2细胞,Northern和Southern印迹法检测HBV的mRNA和病毒复制中间体,化学发光微粒免疫分析方法检测细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg,免疫荧光染色分析细胞HBcAg的表达水平。结果:共转染pshHBx1-4显著抑制HBV mRNA表达、降低细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的水平和细胞内HBcAg的表达水平、并有效抑制HBV的病毒复制中间体的合成。结论:HBV X基因特异性的shRNA可以有效抑制HBV的基因表达和病毒复制,有可能发展成为新的抗HBV制剂。     

人GM—CSF基因转移表达及抑制乙肝病毒的实验研究

为了探讨重组腺病毒为载体的人GM—CSF基囤转移表达及对HBV复制的影响，将携带人GM—CSF基因的重组腺病毒感染22．15HepG2细胞，观察了GM—CSF基因转染前后2.2.15 HepG2细胞上清中HBV—M的变化。