甲基化特异性熔点曲线分析检测FMR1基因CpG岛甲基化状态方法的建立

目的建立一种可靠的检测脆性X智力障碍1基因(FMR1)CpG岛甲基化状态的方法。方法用亚硫酸氢钠对基因组DNA进行脱氨基修饰,以修饰后的DNA为模板,利用荧光定量PCR仪扩增FMR1基因CpG岛序列并进行熔点曲线分析,并对PCR产物进行克隆测序,验证其甲基化状态。结果分析包含10个CpG位点FMR1基因CpG岛105bp片段显示,非甲基化与甲基化引物扩增产物之间熔点温度相差2.5℃;克隆测序显示两者之间未被修饰的胞嘧啶相差7个。结论所建立甲基化特异性熔点曲线分析方法可以有效地检测FMR1基因CpG岛甲基化状态,为临床诊断脆性X综合征提供依据。     

非同位素PCR方法检测脆性X 综合征FMR-1基因CGG重复序列数目

目的 建立一种可靠、简便的非同位素PCR方法检测脆性X综合征的突变基因。方法 采用生物素标记的CGG寡核苷酸探针，检测通过PCR扩增的FMR-1基因中CGG三核苷酸重复序列数目。从而判断所检样品中FMR—1基因是否正常。结果 该法可检测出正常人及携带者的CGG重复拷贝数。结论 该方法可以简便、安全、可靠地检测FMR—1基因中(CGG)n重复拷贝数，从而确定为正常人或携带者，可作为临床上筛查脆性X综合征的首选方法。     

正常人群及3个智力低下家系FMR1基因CGG重复序列检测与分析

目的:检测、分析脆性X综合征致病基因FMR1第1外显子的三核苷酸CGG重复序列在正常人群及智力低下家系中的分布情况。方法:采用PCR扩增技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术方法,对随机抽取的154名中国汉族正常人(男73人、女81人)和3个智力低下家系有关成员FMR1基因CGG重复序列进行分析。结果:共检测到19种等位基因,CGG重复变异范围n=12～40,最大频率等位基因n=29,频率为16.2%。3个智力低下家系中未检测到CGG重复序列异常扩增。结论:在中国正常人群体中FMR1基因CGG重复序列变异分布与高加索人群体有差异;所检测的3个家系智力低下症状不是由于FMR1基因CGG重复异常扩增所致。     

DNA甲基化PCR引物的设计

DNA甲基化是哺乳类动物一个重要的基因外遗传信号。有研究表明,DNA甲基化与大多数肿瘤的发生相关,抑癌基因启动子CpG岛的高甲基化可引起抑癌基因表达沉默,细胞出现无节制生长,导致肿瘤的发生[1]。目前,甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR)是研究DNA甲基化最为常用且准确度较高的方法之一,而理想的引物设计则是其成功的关键因素之一。国外互联网上有1个提供免费在线引物设计程序“MethPrimer”,它能够预测CpG岛,根据实验者要求设计硫化测序PCR(bisulfate-sequencing PCR,BSP)和甲基化特异性PCR(methylation-sp…     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

应用降落PCR及克隆测序检测2型糖尿病外周血白细胞胰岛素样生长因子受体IGF1R基因甲基化

目的:比较应用降落PCR(TD-PCR)及克隆测序检测2型糖尿病患者外周血白细胞中胰岛素样生长因子受体(IGF1R)基因启动子区DNA甲基化位点的方法。方法:提取2型糖尿病患者外周血白细胞DNA进行亚硫酸氢盐处理,设计引物扩增IGF1R基因启动子区富含CG位点序列,分别行普通PCR和TD-PCR扩增,对含目的条带产物进行直接测序和克隆后测序。结果:与普通PCR扩增结果相比,TD-PCR扩增条带清晰、产物量多、二聚体少;且TD-PCR减少了对退火温度不断摸索的过程。克隆后测序峰图清晰,碱基丢失错判频率减少。结论:推荐应用TD-PCR检测亚硫酸氢盐处理的DNA甲基化位点,并进行克隆后测序。     

死亡相关蛋白激酶基因启动子甲基化特异性PCR法的建立与初步应用

目的:建立甲基化特异性PCR(MSP)技术检测死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因启动子甲基化.方法:设计针对DAPK基冈启动子的MSP引物,建立MSP检测体系对甲基化阳性模板进行检测,评价其特异性、重复性和灵敏性,并经测序鉴定.结果:所建市的甲基化MSP方法仅能扩增出甲基化阳性模板.不能扩增出未甲基化阳性模板和未硫化处理的DNA模板;对不同梯度稀释的甲基化阳性模板进行检测,其最大敏感性可达2%;在不同时间进行甲基化MSP检测的结果均一致.结论:成功建立的DAPK基因启动子甲基化MSP检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可用于肿瘤标本的批量检测.     

巢式PCR法检测不同类型标本中p16基因启动子过甲基化

目的 介绍一种高灵敏度的DNA甲基化分析方法，即巢式甲基化特异性。PCR法(nested-MSF，nMSP)，探讨该方法最佳应用条件，并用该法分析新鲜癌组织、石蜡包埋组织及肿瘤患者血清中p16基因启动子的甲基化状态。方法 将基因组DNA变性成为单链，用亚硫酸氢盐修饰单链DNA，所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因的特异引物，进行巢式PCR扩增，最后经凝胶电泳检测目的片段。结果 在3种类型的标本中都检测出了p16基因启动子的甲基化，比普通的甲基化特异性PCR法具有更高的灵敏度。结论 巢式甲基化特异性PCR是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法，可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化分析。     

改进的亚硫酸氢钠测序法检测HepG2 RASSF1A基因CpG岛甲基化状态

目的 改进亚硫酸氢钠测序法，并检验改进后方法在甲基化检测中的可行性。方法 提取人肝癌细胞株HepG2基因组DNA，亚硫酸氢钠化学修饰，针对修饰后Ras相关家族1A基因（RASSF1A）启动子序列设计特异引物并结合沉降PCR扩增，T-A载体克隆、测序。结果 HepG2细胞RASSF1A基因启动子CpG岛的16个CpG位点均被甲基化。结论 改进后亚硫酸氢钠测序法能明显减少非特异性扩增，提高PCR效率，更适于基因甲基化状态的检测。     

巢式甲基化特异性PCR检测不同类型组织标本中WIF-1基因启动子异常甲基化

目的:采用一种高灵敏度的DNA甲基化分析方法,即巢式甲基化特异性PCR法(nested-MSP,nMSP),检测外科手术切除新鲜组织、石蜡包埋组织及纤维支气管镜活检组织中WIF-1基因启动子的异常甲基化状态。方法:将基因组DNA变性成为单链,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA,所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因的特异引物,进行巢式PCR扩增,最后经凝胶电泳检测目的片段。结果:在3种类型的原发性非小细胞肺癌标本中都检测出了WIF-1基因启动子的异常甲基化。结论:巢式甲基化特异性PCR是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化的分析。     

改良的降落PCR与普通PCR结果比较

目的：设计并验证一改良的降落PCR(MTD—PCR)程序。方法：自盐藻bardawi1中提取基因组DNA作为PCR模板，使用TaqDNA聚合酶及pfu DNA聚合酶，运用普通PCR和MTD—PCR程序，扩增胡萝卜素生物合成相关基因(cbr)上游启动子序列，并电泳比较PCR扩增产物的特异性。结果：使用普通Taq酶进行PCR，普通PCR程序产生200bp，500bp和1272bp的3条带，而MTD—PCR程序仅克隆出1272bp的特异带；利用高保真的pfu DNA聚合酶作PCR，在MTD—PCR泳道中也仅有1272bpl条带，而普通PCR除了产生1272bp的特异带外，还出现1条500bp的非特异带。结论：无论使用普通Taq酶或高保真酶pfu，改良的MT—PCR程序均明显提高PCR的特异性，提示它可用于克隆普通PCR难以克隆的基因片段，或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性。     

PCR佐剂在单细胞PCR技术中的优化应用

目的:探索一种优化的单细胞PCR佐剂,应用于分子病理学研究中单细胞基因的检测。方法:从淋巴结反应性增生冷冻组织切片中,应用激光捕获显微切割获取单个淋巴细胞,优化单细胞PCR反应体系进行actin基因检测。对照组不添加PCR佐剂,实验A、B、C组分别添加PCR佐剂二甲基亚砜、甘油、牛血清白蛋白。结果:对照组、实验A、B、C组的单细胞扩增阳性率分别为5%,7.5%,10%,45%,对照组和实验A、B组的单细胞扩增阳性率比较无显著性差异(P>0.05),而实验C组的单细胞扩增阳性率显著性高于对照组和实验A组(P<0.01)。结论:牛血清白蛋白是最佳的单细胞PCR佐剂,显著提高了单细胞PCR的敏感性、特异性和稳定性。     

PCR基因芯片

基因芯片(gene chips)可以快速、微型化、自动化地检测大量基因,成了生物医学研究的重要推动力.随着微加工技术的发展, 我们建立了有1 200个微反应池的PCR基因芯片,将基因芯片和聚合酶链式反应(PCR)技术结合在一起.PCR基因芯片综合了基因芯片体积小却可以检测大量基因,以及PCR敏感而且容易发现各种基因变异的特点,采用以PCR 为基础,而非以分子杂交为基础的检测方式,克服了杂交技术所存在的内在缺陷,大大增强了实验的敏感性和可重复性;扩展了基因芯片在生物医学领域中应用的范围,更适用于各种基因重排、基因突变和基因缺失的鉴定.PCR反应采用荧光探针作实时定量分析.在临床肿瘤和白血病的诊断、人类基因组分析、基因多态性和疾病易感性鉴定、遗传性疾病的基因诊断、动物和植物基因变异筛选、各种病原微生物鉴定等多方面会有广泛应用前景.     

PCR及Real-time PCR评价细菌DNA提取方法

目的:比较几种不同的细菌DNA提取方法,建立一种适于PCR和Real-time PCR的细菌DNA提取方法.方法:分别用蛋白酶K法、碱裂解法、Chelex-100 NP40、Chelex-100 TritonX-100法和水煮法提取同种浓度大肠杆菌DNA,测定OD260/280;用不同方法提取不同浓度的大肠杆菌DNA,进行PCR和实时荧光定量PCR扩增,比较灵敏度.结果:5种方法提取细菌DNA,其中Chelex-100 NP40 法纯度(OD260/280=1.79±0.03)最高,此方法所提取的DNA产物进行PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,其灵敏度为10个/ml细菌浓度.结论:Chelex-100 NP40的细菌DNA提取方法纯度及灵敏度高,且适应于PCR及Real-time PCR.     

博尔纳病病毒荧光定量PCR试剂盒扩增缓冲液的优化

目的 选择并优化博尔纳病病毒荧光定量PCR TaqMan探针法反应体系中的扩增缓冲液,使PCR反应体系对该病毒p24模板基因的扩增效率得到明显提高.方法 通过常规PCR比较选择3种常用酸(盐酸、磷酸和硫酸)所滴定的缓冲液体系,在其基础上选择适合浓度的硫酸铵配制TSS buffer,在TSS buffer中分别加入四甲基...     

Real-time PCR与常规PCR在Q热立克体检测中的比较

目的比较与评价Real-time PCR与常规PCR,寻求适合于Q热患者早期诊断的方法。方法应用Taq Man探针定量PCR、SYBR Green染料定量PCR、巢式PCR和普通PCR四种方法分别对T-A克隆的Q热立克次体基因htp AB片断进行灵敏性、特异性和重复性检测及评价。结果 Taq Man PCR方法的灵敏度分别为SYBR Green PCR、巢式PCR和普通PCR的10倍、10倍和100倍。重复性测试Taq Man法Ct变异系数CV:0.2%~3.0%,SYBR Green法的CV:0.3%~6.0%。Taq Man和SYBR Green PCR均耗时约1h,巢式PCR耗时约2.5h,普通PCR耗时约1.5h。四种方法检测25种相关病原菌结果均为阴性。结论 Taq Man探针定量PCR方法具有很好的特异性、灵敏性、重复性和可操作性,可用于Q热患者临床早期诊断。     

聚合酶链反应微孔酶免疫法检测新型隐球菌

目的 建立一种检测脑膜炎新型隐球菌聚合酶链反应（PCR）产物的微孔酶免疫方法,方法 对PCR所用2条引物进行双标记,使扩增产物一端标记上生物素,另一端标记上地高辛,通过包被在微孔板上的亲和素捕获固定,然后用碱性磷酸酶标记的地高辛抗体反应后显色测定。结果 三种PCR产物检测方法的对照分析表明微孔板酶免疫法敏感性最强,加样量38nL时即可显色,模板DNA经过10^11倍稀释后仍为阳性结果,聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖电泳则分别可检测到0.3125uL,1.25uL及10^7,10^4稀释度,对临床脑脊液标本的检测结果微孔板酶免疫法和聚丙烯酰胺凝胶电泳的符合率为100%,二敏感性均高于琼脂微电泳,结论 建立的方法与常规电泳法相比灵敏准确,结果判断客观,重复性也较好;所测结果可相对反应PCR产物量的多少,此方法可取代电泳法成为常规检测PCR产物的方法。     

PCR法与荧光定量PCR法在人巨细胞病毒检测中的作用比较

目的 比较常规PCR法与荧光定量RCR（RQ-PCR）法在人巨细胞病毒（HCMV）检测中的作用,寻找更适合于HCMV检测的方法。方法 构建携带CMV-DNA的标准质粒,利用常规PCR技术及FQ-PCR技术分别对不同稀释度的标准质粒进行检测。结果 FQ-PCR法对HCMV,标准质粒检测的灵敏度及线性范围均显著高于常规RCR法。结论 RCP法比常规PCR法更适合HCMV病毒的检测。     

多重巢式和定量PCR联合应用提高SARS病毒检测率

目的寻求一种可靠、可行的对急性严重呼吸道综合征病毒的早期诊断方法.方法应用多重巢式PCR联合荧光实时定量方法,对广州地区91份确诊和疑似病例标本、25份健康志愿者标本同时进行检测.结果25份健康志愿者标本经两种方法检测均为阴性.91份确诊和疑似病例标本经多重巢式PCR方法检测,阳性标本数53例,总阳性检测率58.24%;荧光实时定量PCR检测阳性标本数68例,阳性检出率74.73%;两种方法联合,阳性标本数76例,阳性检出率83.52%.结论多重巢式PCR联合荧光实时定量方法可进一步提高SARS病毒的阳性检出率,也为今后应对可能发生的其它突发性传染病病毒的检测提供分子诊断基础.