川续断皂苷Ⅵ诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的研究

目的探讨川续断皂苷Ⅵ(akebia saponin D)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的影响。方法用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs,选择合适的培养基,传代扩增。采用不同浓度的川续断皂苷Ⅵ对大鼠MSCs定向诱导分化,MTT法观察各组对MSCs的增殖作用并绘制细胞生长曲线;观察MSCs诱导分化过程中成骨细胞内碱性磷酸酶(alkaliphosphatase,ALP)活性;采用ELISA法检测MSCs诱导分化过程中骨钙素(Osteo-calcin,OC)的含量;RT-PCR方法检测MSCs诱导分化过程中核心结合因子α-1(Cbfα1)mRNA表达。结果细胞生长曲线显示各组MSCs数量均随时间延长而增加,中、高浓度的川续断皂苷Ⅵ能明显提高MSCs分化为成骨细胞的ALP活性和骨钙素的含量,且使Cbfα1 mRNA的表达升高。结论川续断皂苷Ⅵ具有促进大鼠体外MSCs向成骨细胞增殖和分化的作用,这一作用可能与其升高Cbfα1 mRNA的表达有关。     

骨髓来源成骨细胞体外成骨表达的研究

目的探索在体外诱导兔骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化及成骨表达的特性。方法抽取兔骨髓,通过离心法获取单个核细胞,在体外经条件培养基培养21d,通过倒置显微镜及激光共聚焦显微镜观察成骨细胞的形态学特点;应用MTT法测定成骨细胞活性;并检测成骨细胞分泌碱性磷酸酶活性及形成矿化结节情况。结果体外BMSCs可在成骨条件培养液下诱导培养后可向成骨细胞分化,经倒置显微镜和激光共聚焦显微镜观察证实,诱导后BMSCs由长梭形转变为短胖形的成骨细胞,MTT检测成骨细胞活性良好,分泌碱性磷酸酶并形成矿化结节。结论骨髓基质干细胞在体外可定向诱导为成骨细胞,并具有成骨细胞功能,有希望成为理想的种子细胞应用于临床。     

雷洛昔芬通过促进一氧化氮释放诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化

目的探讨雷洛昔芬诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化作用及其机制。方法从大鼠体内提取分离脂肪干细胞,并进行多向分化能力鉴定。在成骨诱导培养液中加入不同浓度雷洛昔芬(0、0.01、0.1、1μmol.L-1)、非选择性一氧化氮合成酶抑制剂L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME(1 mmol.L-1))、雷洛昔芬(1μmol.L-1)+L-NAME(1 mmol.L-1),在共同条件培养14～28 d,测定各项成骨细胞形成指标。结果雷洛昔芬(0.01～1μmol.L-1)能明显提高脂肪干细胞胞质一氧化氮的释放和成骨细胞分化标志基因(碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原)的表达以及矿化结节的生成,L-NAME可以拮抗雷洛昔芬引起的胞质一氧化氮的释放,并同时抑制雷洛昔芬诱导脂肪干细胞向成骨分化的作用。结论雷洛昔芬可以促进胞质一氧化氮释放,从而诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化。     

人参总皂苷增强成骨分化的间充质干细胞促造血作用研究

目的观察人参总皂苷(TSPG)诱导间充质干细胞向成骨细胞分化的作用,探讨TSPG增强成骨分化的间充质干细胞促造血的可能机制。方法贴壁法培养人源骨髓间充质干细胞(h MSCs),成骨细胞分化和免疫表型进行鉴定。不同剂量的TSPG联合成骨细胞条件诱导液培养h MSCs,MTT法检测细胞增殖活性,对-硝基苯磷酸盐(p NPP)法检测培养上清碱性磷酸酶含量,茜素红染色法观察钙结节数量,Western blot法检测成骨细胞分化转录因子-核心结合蛋白因子2(RUNX2)蛋白表达水平,Elisa法检测培养上清造血相关因子含量,造血祖细胞集落生成实验检测培养上清造血支持能力。结果 MTT和p NPP结果均显示随着TSPG剂量增加,吸光值逐渐增加,呈剂量依赖性。钙结节数量和RUNX2蛋白表达水平明显高于对照组。造血相关生长因子和造血祖细胞集落数明显高于对照组。结论TSPG通过上调RUNX2蛋白表达诱导h MSCs向成骨细胞分化,同时增强成骨分化的MSCs支持造血。     

大黄素对体外大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化的影响

目的 :观察大黄素对骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化的影响 ,探讨大黄素对干细胞分化方向的调节作用。方法 :用密度梯度离心的方法和传代贴壁筛选的方法相结合 ,分离纯化骨髓基质细胞。对硝基苯磷酸盐法判断是否成功诱导骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化 ,碱性磷酸酶染色法、放射免疫测定法观察大黄素对骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化的影响。结果 :结合密度梯度离心的方法和传代贴壁筛选的方法 ,分离纯化后可得到成分较为均一的骨髓基质细胞 ,其间存在有间质干细胞 ,经诱导后向成骨细胞方向分化。大黄素可增加大鼠骨髓基质细胞成骨诱导后细胞碱性磷酸酶的含量 ,其中10 -6mol·L-1浓度组作用 7d时效果明显。大黄素在 2 .5× 10 -7～ 10 -5mol·L-1浓度范围内未能增加细胞上清液和细胞裂解液中骨钙素含量。结论 :大黄素能促进骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化 ,这一作用主要体现在骨形成过程的早期 ,对矿化期没有促进作用。     

非病毒载体携带Cbfa1诱导成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的研究

目的:观察核心结合因子a1(Cbfa1)对成人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向成骨细胞定向分化的诱导作用。方法:经密度梯度离心法和贴壁筛选法获得hBMSCs。非病毒载体FuGene HD携带Cbfa1转染hBMSCs后7、14d,经Real-time PCR分析hBMSCs成骨细胞标志基因表达,包括Cbfa1、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、骨桥蛋白(OPN)和Ⅰ型胶原;培养1、2和3周,ALP染色、钙结节染色检测成骨分化。结果:培养的hBMSCs阳性表达CD73,阴性表达CD34。第3代细胞增殖曲线呈"S"形,符合对数生长曲线。Cbfa1转染hBMSCs表现出与成骨细胞相似的形态,成骨细胞标志基因ALP、OC、OPN和Ⅰ型胶原的表达均明显上调,ALP染色阳性,并且有明显的钙结节形成。结论:非病毒载体携带Cbfa1转染hBMSCs可诱导其向成骨细胞分化。     

兔骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的实验研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为成骨细胞的途径.方法 抽取兔骨髓,以全骨髓贴壁培养法进行体外培养,贴壁细胞传代.取第3代细胞诱导培养,倒置显微镜下观察细胞形态.培养16 d后,用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)/氯化硝基四氮唑蓝(NBT)底物显色试剂检测碱性磷酸酶(AP),茜素红染色检测钙结节.结果 全骨髓贴壁培养法可获得MSCs,原代和传代培养的MSCs具有活跃的增殖能力.诱导培养后,AP检测与钙结节染色均为强阳性.结论 兔骨髓中培养出的MSCs可以定向分化为成骨细胞,可用作骨组织工程中的种子细胞.     

木脂素分解产物enterolactone和enterodiol对成骨细胞样细胞MG63的双相作用

目的:观察enterolactone和enterodiol对成骨细胞样细胞MG63的作用。方法:用MTT法检测观察enterolactone和enterodiol对MG63细胞生长的影响,用碱性磷酸酶活性检测观察enterolactone和enterodiol对MG63细胞活性的影响,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)观察enterolactone和enterodiol对MG63细胞碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原基因表达水平的影响。结果:Enterolactone和enterodiol在0.01 mg/mL浓度时能增加MG63细胞的活力。随着浓度的增加,细胞活力逐渐减弱。Enterolactone和en-terodiol对MG63细胞碱性磷酸酶活性的影响与对MG63细胞生长的影响基本一致,也是在低浓度时增加其活性,在高浓度时抑制其活性。En-terolactone和enterodiol都能增加MG63细胞碱性磷酸酶、骨钙素和Ⅰ型胶原的基因转录。结论:Enterolactone和enterodiol在低浓度时能增进成骨细胞的活性,在高浓度时抑制其活性,对成骨细胞有双相调节作用。     

成人骨髓间充质干细胞多向分化潜能特性

目的 探讨体外不同诱导条件下成人骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞、脂肪细胞分化的能力.方法 采用地塞米松、胰岛素、β-磷酸甘油、抗坏血酸等诱导培养液对体外分离培养的成人骨髓MSCs进行成骨细胞及脂肪细胞的定向诱导并进行鉴定.结果 成人骨髓MSCs向成骨细胞诱导后可见钙盐分泌,茜素S与钙盐结合成红色,四环素标记后可见到黄色发光的钙化结节;而向脂肪细胞诱导后则可见含有多量脂滴的脂肪细胞,苏丹Ⅳ染色脂滴呈红色,苏木精染色细胞核呈蓝色.结论 成人骨髓MSCs在体外一定条件下可以诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,具有多向分化潜能.     

碱性成纤维细胞生长因子对非贴壁骨髓基质前体细胞增殖及分化作用的研究

目的　探讨碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)对非贴壁骨髓前体细胞的增殖及分化作用。方法　分离骨髓前体细胞体外培养 ,用碱性磷酸酶化学染色及图像分析仪测定细胞克隆数 ;采用免疫组化 (ABC法 )检测PCNA、Ⅰ型胶原、钙及骨钙素。研究bFGF对非贴壁前体细胞的促增殖及分化作用。结果　骨髓细胞中许多基质前体细胞以非贴壁前体细胞 (NASP)形式存在 ,bFGF不仅能促进其增殖 ,而且能诱导其向成骨细胞分化。结论　bFGF主要作用于非贴壁生长的基质前体细胞 :能增加骨细胞的数量 ,促进骨样组织形成 ,为临床用bFGF治疗骨折、骨不连提供理论依据。     

狗骨髓基质细胞的分离培养及成骨潜能的研究

目的观察狗骨髓基质细胞(MSCs)的生长特点及诱导条件下的成骨能力,为利用狗的MSCs进行成骨研究提供实验基础。方法从成年狗胫骨取骨髓进行MSCs培养,检测细胞周期;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察细胞增殖;测定碱性磷酸酶活性;用Von Kossa染色法观察钙化结节。观察在条件培养液中MSCs生长及成骨分化情况。结果MSCs增殖能力强,细胞周期显示有20%的细胞处于G0/G1期。诱导条件下的细胞碱性磷酸酶活性明显增高,10~12 d达到高峰,并出现钙化结节。结论体外培养狗的MSCs具有分化成骨的潜能,增殖能力强,可作为骨组织工程的种子细胞。     

Icariin, a flavonoid from the herb Epimedium enhances the osteogenic differentiation of rat primary bone marrow stromal cells

The herb Epimedium has long been used in Traditional Chinese Medicine to treat bone fracture and prevent osteoporosis. Researchers believe that the flavonoids contained in the herb are the effective component for this activity. However, no single flavonoid has been studied for its effect on bone-related cells. In the present study, icariin, one of the major flavonoids of the herb, supplemented the primary culture medium of rat bone marrow stromal cells (rMSCs) at 0.1 microM , 1 microM and 10 microM respectively. It was found that icariin stimulated the proliferation of rMSCs and increased the number of CFU-F stained positive for alkaline phosphatase in a dose-dependent manner. Icariin also dose-dependently increased the alkaline phosphatase activity, osteoalcin secretion and calcium deposition level of rMSCs during osteogenic induction. The addition of 10 microM icariin caused four times more mineralized bone nodules to be formed by rMSCs than in the control. The results demonstrated that icariin should be an effective component for bone-strengthening activity, and one of the mechanisms is to stimulate the proliferation and enhance the osteogenic differentiation of MSCs.     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的机制研究

目的体外诱导成人骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化,并探讨分化过程中多效蛋白(PTN)mRNA的表达,以了解MSCs向神经元样细胞分化的特性和机制。方法密度梯度离心加贴壁培养法分离成人MSCs,原代和传代培养。取第6代MSCs设对照和试验组进行诱导,诱导后30 min至3 d,观察细胞形态并计数。免疫细胞化学法和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定分化后细胞神经细胞特异性表面标志神经元烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白(MAP)-2,胶原酸性蛋白(GFAP)和诱导前、诱导后12 h PTN mRNA的表达。结果接种24 h后MSCs开始贴壁,呈圆形或椭圆形。3 d后可见梭状细胞呈集落状生长,10～14 d融合。第5～6代时呈现较均一的成纤维细胞样形态。诱导后胞体向胞核收缩;出现双极及多极细胞。12 h变形细胞增多,细长突起相互连接。24 h后变形细胞增多不明显。诱导后12 h大部分细胞表达NSE(64.79±0.07)%、MAP-2(60.05±0.09)%,未检测到GFAP的表达,RT-PCR半定量检测有NSE mRNA的表达(0.66±0.15)。实验组诱导后12 h细胞有PTN mRNA的表达(0.689±0.017)。结论建立了稳定的成人MSCs培养增殖体系,MSCs可体外诱导分化为神经元样细胞,在分化过程中有外观形态变化和特异性标志物NSE和MAP-2的表达,同时有PTN mRNA的表达,提示PTN可能参与调控了MSCs向神经元样细胞的分化。     

Smad6信号干扰对MSCs骨向分化中Smad5及Smurf1基因表达的影响

目的研究在骨形态发生蛋白2(BMP-2)诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)骨向分化中Smad6信号干扰对Smad5、Smurf1基因表达的影响。方法培养小鼠骨髓MSCs,并分为3组:A组为对照细胞;B组细胞用携带绿色荧光蛋白(GFP)的空白载体病毒转染+BMP-2骨向诱导;C组细胞用Smad6重组RNA干扰载体转染+BMP-2诱导。结果病毒转染后GFP在MSCs中有效表达,病毒转染效率接近100%。与A组比较,BMP-2诱导24h显著提高了B组Smurf1 mRNA水平(P<0.01);而Smad6信号干扰在两个时间点则进一步提高了C组Smurf1 mRNA水平,并显著高于B组(P<0.01)。C组磷酸化的Smad5(pSmad5)和Smurf1水平在两个时间点也显著高于B组(P<0.01),而Smad5蛋白水平则未受影响。结论在BMP-2诱导的MSCs骨向分化中,Smad6 RNA干扰可促进Smad5磷酸化,并引起Smurf1基因表达代偿性增高。     

Microsphere-based drug releasing scaffolds for inducing osteogenesis of human mesenchymal stem cells in vitro

In this study, in vitro osteogenesis was successfully achieved in human mesenchymal stem cells (hMSCs) by controlled release of the osteogenesis-inducing drugs dexamethasone, ascorbic acid (AA) and β-glycerophosphate (GP) from poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) sintered microsphere scaffolds (SMS). We investigated the osteogenesis of human MSCs (hMSCs) on dexamethasone laden PLGA-SMS (PLGA-Dex-SMS), and dexamethasone, AA and GP laden PLGA-SMS (PLGA-Com-SMS). hMSCs cultured on the microsphere systems, which act as drug release vehicles and also promote cell growth/tissue formation—displayed a strong osteogenic commitment locally. The osteogenic commitment of hMSCs on the scaffolds were verified by alkaline phosphatase (ALP) activity assay, calcium secretion assay, real-time PCR and immunohistochemistry analysis. The results indicated hMSCs cultured on PLGA-Com-SMS exhibited superior osteogenic differentiation owing to significantly high phenotypic expression of typical osteogenic genes—osteocalcin (OC), type I collagen, alkaline phosphatase (ALP), and Runx-2/Cbfa-1, and protein secretion of bone-relevant markers such as osteoclast and type I collagen when compared with PLGA-Dex-SMS. In conclusion, by promoting osteogenic development of hMSCs in vitro, this newly designed controlled release system opens a new door to bone reparation and regeneration.     

淫羊藿苷对体外在无地塞米松培养基中诱导培养大鼠骨髓基质细胞成骨性分化的影响

目的：探讨在无地塞米松（dexamethasone）时淫羊藿苷（icariin,ICA）对体外培养大鼠骨髓基质细胞成骨性分化的影响,并试图寻找一种新的或更强的促体外培养骨髓基质细胞成骨性分化的诱导剂。方法用1×10－5 mol·L －1淫羊藿苷或1×10－8 mol·L －1的地塞米松对大鼠骨髓基质细胞分别进行药物干预,细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测细胞增殖,碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性,茜素红染色检测钙化结节数量,实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测骨保护素（osteoprotegerin,OPG）、核因子-κB 受体活化因子配体（receptor activator of NF-κB ligand, RANKL）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）的信使 RNA（mRNA）表达情况。结果1×10－5 mol·L －1淫羊藿苷在无地塞米松的培养基中能显著提高大鼠骨髓基质细胞 ALP 活性;明显增加大鼠骨髓基质细胞钙化结节数目;显著上调BMP、OPG mRNA 水平以及 OPG／RANKL mRNA 比值。结论淫羊藿苷可能是一种潜在的促体外培养大鼠骨髓基质细胞成骨性分化的新诱导剂。