同型半胱氨酸对体外大鼠神经干细胞增殖及Notch信号通路相关基因表达的影响

【摘要】目的 研究同型半胱氨酸（Hcy）对体外大鼠神经干细胞(NSCs)增殖及Notch信号通路相关基因Notch1和Hes1mRNA表达的影响。方法 采用无血清培养原代培养新生大鼠NSCs,细胞分为对照组(Hcy-C)、Hcy低剂量组（Hcy-L）、Hcy中剂量组（Hcy-M）、Hcy高剂量组（Hcy-H）。采用免疫组化法检测Nestin、β-tubulin Ⅲ及GFAP的表达对NSCs进行鉴定,MTT法检测细胞增殖情况,Real-time PCR检测Notch1、Hes1基因mRNA表达。结果 无血清培养条件下,所培养细胞形成大量呈Nestin抗原阳性细胞组成的神经球;诱导分化6d后,形成β-tubulin Ⅲ表达呈阳性的神经元和GFAP表达呈阳性的星形胶质细胞;Hcy干预组细胞活力低于对照组,且有剂量依赖性(P<0.05)。Hcy干预组Hes1mRNA表达低于对照组(P<0.05)。Hcy-H组Notch1mRNA表达低于其他3组(P<0.05);Hcy-M组Notch1mRNA表达低于对照组和低剂量组(P<0.05)。结论 Hcy能抑制大鼠新生鼠NSCs的增殖,可能与下调Notch信号通路中Notch1和Hes1mRNA表达有关     

黄芪甲苷和齐墩果酸对体外神经干细胞增殖和Jagged1 mRNA表达的影响

目的 观察黄芪甲苷和齐墩果酸对体外神经干细胞增殖和相关基因Jagged1表达的影响。方法 采用机械吹打法从胎鼠脑内获得神经干细胞,随机分组,分别给予不同浓度(10^-6,5×10^-7,10^-7,5×10^-8,10^-8,5×10^-9,10^-9 mol·L^-1)的黄芪甲苷、齐墩果酸进行干预,72 h后用WST法检测细胞的增殖情况,PCR检测Jagged1表达水平。结果 黄芪甲苷对体外神经干细胞增殖影响不显著,高剂量尚存在细胞毒性。齐墩果酸能促进神经干细胞增殖,且呈一定的剂量效应关系,与对照组和黄芪甲苷组比较均有显著差异(P<0.05)。细胞未分化状态下Jagged1基因存在一定的表达,增殖率越高Jagged1表达水平越高;与同浓度黄芪甲苷组比较,齐墩果酸显著上调Jagged1表达(P<0.05)。结论 不同浓度的黄芪甲苷和齐墩果酸对体外培养神经干细胞增殖和Jagged1表达的影响不同;齐墩果酸作用优于黄芪甲苷。     

腺苷促进体外培养神经干细胞增殖作用研究

目的研究腺苷促进体外培养神经干细胞（NSCs）增殖作用。方法取新生小鼠大脑进行神经干细胞原代培养,观察神经球生成情况,特异性蛋白质免疫细胞化学染色和BrdU标记鉴定并判断其增殖能力;将腺苷按0.4,2.0,10.0 μmol&#8226;L 13个浓度加入神经干细胞培养基,同时设立溶媒对照组和阳性对照组,通过观察神经球形态、神经球生成数目及 MTT法定量比较,分析不同浓度腺苷对神经干细胞分裂增殖的影响。结果培养物中有大量神经球生成,神经干细胞特异性蛋白质免疫细胞化学染色呈阳性,BrdU标记亦呈阳性反应,所培养的细胞为神经干细胞,具有增殖能力;腺苷中、高浓度组神经球数目、MTT比色结果明显高于溶媒对照组。结论腺苷具有促进NSCs增殖作用。     

甲氨蝶呤对体外培养神经干细胞的毒性作用

目的:观察甲氨蝶呤(MTX)对体外培养的神经干细胞(NSC)毒性作用的特点,并初步探讨其毒性机制.方法:体外培养胎鼠大脑皮质NSCs,采用Nestin免疫荧光法进行鉴定;光镜下观察MTX干预后NSC形态变化;采用5-溴脱氧尿苷(BrdU)掺入法和Nestin/BrdU免疫组化双标记检测MTX对NSCs增殖的影响;流式细胞术分析细胞周期变化;高压液相法检测细胞内同型半胱氨酸(Hcy)的浓度.结果:400μg/L MTX可引起明显的细胞形态改变;免疫荧光双标记结果显示,与对照组相比,MTX干预组可明显抑制NSCs增殖(JP<0.05);MTX干预48 h后,细胞停留在G1期的比例比空白对照组明显增加;MTX还可引起细胞内Hcy浓度升高.结论:MTX可能通过改变细胞周期和升高细胞内Hcy浓度而对体外培养NSCs产生明显的毒性损伤作用.     

Notch1表达对肝癌细胞HepG2生物学行为的影响

目的研究Notch1基因对Hes1、Hes2表达水平以及肝癌细胞HepG2生物学行为的影响。方法将HepG2细胞分为Notch1受体胞内段质粒(A)组、Notch1干扰RNA(B)组、空载体(C)组和未处理HepG2细胞(D)组。采用MTT法检测各组细胞增殖能力,流式细胞术测定细胞周期,RT-PCR和Western blot法分别检测Notch1、Hes1、Hes2mRNA和蛋白的表达。结果与C组和D组相比,A组细胞增殖能力减弱,G1期细胞以及Notch1、Hes1、Hes2mRNA和蛋白表达均明显增加(P<0.05),而B组细胞增殖能力增强,G1期细胞以及Notch1、Hes1、Hes2mRNA和蛋白表达均明显减少(P<0.05)。结论上调Notch1的表达能促进Hes1与Hes2表达水平并抑制肝癌细胞HepG2增殖。     

双嘧达莫对体外培养神经干细胞增殖的影响

目的研究双嘧达莫(dipyridamole)对体外培养神经干细胞的促增殖作用.方法取新生小鼠大脑进行神经干细胞原代培养,通过神经球生成的观察、特异性蛋白质免疫细胞化学染色和BrdU标记鉴定并判断其增殖能力;双嘧达莫按0.1,0.5,2.5 μmol·L-13个浓度加入神经干细胞培养基中,同时设立溶媒对照组和阳性对照组,通过观察神经球形态、神经球生成数目及MTT法定量比较,分析不同浓度双嘧达莫对神经干细胞分裂增殖的影响.结果在培养物中有大量神经球生成,神经干细胞的特异性蛋白质免疫细胞化学染色呈阳性,BrdU标记亦呈阳性反应,表明所培养的细胞为神经干细胞,具有增殖能力.双嘧达莫中、高浓度组神经球数目、MTT比色结果明显高于溶媒对照组.结论双嘧达莫具有促进神经干细胞增殖的作用.     

黄芪多糖对电离辐射骨髓间充质干细胞向神经分化潜能的影响

目的研究黄芪多糖对X射线照射人骨髓间充质干细胞向神经分化的干预作用。方法采用CCK-8法筛选不同浓度的黄芪多糖作用于2Gy X射线辐射人骨髓间充质干细胞的增殖能力;细胞形态计数X射线对骨髓间充质干细胞分化为神经细胞数量的影响;甲苯胺蓝染色检测X射线对骨髓间充质干细胞分化为神经细胞中尼氏体的表达量;Western blot检测神经巢蛋白(Nestin)及神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)表达变化。结果与对照组相比,X射线照射后细胞增殖水平明显降低(P<0.05),与单纯照射组比较,加药照射组骨髓间充质干细胞增殖水平显著增加(P<0.05),其中黄芪多糖浓度为50 mg·L~(-1)时促增殖作用最强,设为最佳药物浓度;单纯辐射后骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的数量明显降低(P<0.05),当给予黄芪多糖干预后分化为神经细胞的数量明显上升(P<0.05);辐射后骨髓间充质干细胞分化为神经细胞中尼氏体的表达量降低(P<0.05),当给予黄芪多糖干预后,尼氏体的表达量明显增多;单纯辐射后Nestin及NSE表达量降低(P<0.05),而当给予黄芪多糖干预后,Nestin和NSE表达量升高(P<0.05)。结论黄芪多糖对电离辐射人骨髓间充质干细胞向神经分化潜能的影响具有保护作用。     

黄芪甲苷对兔脂肪来源的间充质干细胞体外增殖和细胞周期的影响

目的观察黄芪甲苷对兔脂肪来源的间充质干细胞(ASCs)体外增殖的作用。方法提取实验家兔ASCs,培养之后,设实验组和对照组,实验组加入不同浓度黄芪甲苷溶液,对照组加常规培养液,用流式细胞仪观察细胞周期,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞的增殖率,比较细胞周期和细胞增殖率。结果实验组和对照组培养24 h后,实验组增殖期细胞为72.9%,明显高于的对照组的61.2%(P<0.01);48 h后观察,黄芪甲苷浓度在0.019 5 mg/L时,对ASCs无明显的促进增殖作用(P>0.05);而黄芪甲苷浓度在0.039 1～10 mg/L范围时,对ASCs均有明显的促进增殖的作用(P<0.01)。结论黄芪甲苷对ASCs体外增殖有明显的促进作用。     

脐血源性神经干细胞移植对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠的治疗作用

目的 探讨人脐血源性神经干细胞(NSCs)移植治疗缺血缺氧性脑损伤(HIBD)新生大鼠的可行性.方法 7d龄大鼠随机分成NSCs移植(A)组、HIBD模型对照(B)组和正常对照(C)组,每组40只.从人脐血中分离出单个核细胞(UBC-MNCs),定向诱导分化出NSCs并行溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)标记,经尾静脉移植到HIBD新生大鼠体内.免疫组化法检测移植后1、7、14、21 d各组动物脑组织易损区室管膜前下区(SVZa)神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、BrdU染色阳性细胞表达情况及移植细胞在脑内的存活、迁移和分化情况.结果 UBC-MNCs可体外培养并定向诱导分化为NSCs,A组SVZa区NSE、BrdU阳性细胞表达量较B组均增高(P<0.01);移植早期Nestin增高,移植后14 d达峰,以后逐渐下降(P(0.01);A组GFAP表达较B组降低,大鼠损伤区面积显著减小(P<0.01).结论 移植的NSCs可在HIBD新生大鼠SVZa存活、增殖及分化,促进组织结构恢复和细胞功能重建,NSCs移植是治疗HIBD的一种新途径.     

黄芪甲苷下调TNF-α和iNOS水平保护缺血再灌注大鼠脑损伤的实验研究

目的:研究黄芪甲苷对缺血再灌注脑损伤保护作用的机制。方法:建立大鼠缺血再灌注动物模型。给予黄芪甲苷、尼莫地平干预,观察大鼠神经功能缺损,实时定量PCR检测大脑病灶处TNF-α、iNOS的mRNA水平,蛋白免疫杂交检测TNF-α、iNOS表达水平。结果:模型组神经功能缺损评分为5.26±0.33;黄芪甲苷组评分为2.43±0.17;尼莫地平组评分为3.13±0.21。实时定量PCR检测计算Ct值,模型组TNF-a为23.42±0.03,iNOS为25.23±0.04;尼莫地平组分别为23.89±0.03,24.73±0.02;黄芪甲苷组分别为25.68±0.05,27.63±0.03。蛋白免疫杂交检测,模型组的TNF-α和iNOS的相对灰度分别为71%和22%;尼莫地平组分别为52%和15%;黄芪甲苷组分别为2%和10%。结论:黄芪甲苷对缺血再灌注性脑损伤具有保护作用,效果同尼莫地平相近;其作用机制可能与黄芪甲苷具有下调病灶处组织TNF-a和iNOS基因和蛋白表达有关。     

nNOS参与OGD介导的促神经干细胞增殖效应

目的：体外研究脑缺血促神经发生的机制。 方法： 体外培养神经干细胞（neural stem cells,NSCs）与海马神经元,并采用氧糖剥夺模型（oxygen and glucose deprivation, OGD）模拟在体缺血,通过RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学、酶活性测定、亚硝酸盐/硝酸盐（nitrite/nitrate,NOx） 含量测定等多种方法研究神经干细胞的生物学行为以及介导这种效应的分子机制。结果： （1）OGD通过直接和间接（神经元）作用增加神经干细胞中BrdU＋ 细胞比例。（2）OGD上调神经干细胞中神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase,nNOS）并下调神经元中nNOS,且都有利于神经干细胞增殖。（3）采用nNOS基因敲除小鼠来源的神经干细胞以及神经元（用于共培养）进行实验,发现OGD并不能升高神经干细胞中BrdU＋ 细胞比例。 结论：神经干细胞和神经元中nNOS水平变化共同参与了OGD诱导的促神经干细胞增殖效应。     

骨骼肌提取液促进体外培养神经干细胞增殖作用研究

目的寻找促神经干细胞分裂增殖物质,为神经系统发育研究和神经系统疾病的治疗研究提供新的依据。方法用硫酸铵盐析及超滤离心法分离骨骼肌蛋白质,体外培养新生小鼠神经干细胞,通过神经球生成的观察、特异性蛋白质免疫细胞化学染色和MTT比色检测法鉴定神经干细胞并判断其增殖能力。结果在培养物中有大量神经球生成,且与对照组差异有显著性(P<0.01),神经干细胞的特异性蛋白质(Nestin)免疫细胞化学染色呈阳性。结论骨骼肌提取液可促进体外培养神经干细胞增殖分裂,且呈一定量效关系,其有效成分为分子量≤100 ku的蛋白质分子。     

黄芪甲苷对大鼠海马源神经干细胞体外增殖的影响

目的观察黄芪甲苷对神经干细胞（NSC）体外增殖的影响,为神经干细胞应用于临床提供理论依据。方法利用无血清培养技术,从新生大鼠海马区分离培养NSC,并进行体外扩增、传代。取传至第3代的NSC,观察不同浓度黄芪甲苷（40、80、120mg／L）对其增殖的影响。对神经球形成数进行计数并进行噻唑蓝（MTT）比色分析。结果40mg／L和80mg／L黄芪甲苷实验组神经球形成数和细胞吸光度值均明显高于对照组（神经球形成数：8．1±1．4,8．8±1．3比7．2±1．2;细胞吸光度值：0．87±0．02、0．89±0．03比0．694-0．03,P〈0．05或P〈0．01）,而120mg／L黄芪甲苷组实验组神经球形成数和细胞吸光度值（分别为3．1±1．2、0．30±0．02）低于对照组（P〈0．01）。结论在一定浓度范围内,黄芪甲苷可促进体外培养NSC的增殖。     

胃癌中survivin和cyclinD 1基因的表达及其相关性研究

目的探讨survivin基因表达与胃癌生物学行为及与cyclinD1表达的关系.方法利用免疫组化S-p法检测50例胃癌和24例慢性胃炎中survivin和cyclinD1的表达.结果 Survivin和cyclinD1的阳性检测率分别为66%(33/50)和64%(32/50),survivin和cyclinD1的阳性表达与胃癌组织学类型相关(P<0.05,P<0.01),survivin表达与淋巴结转移有关,survivin的阳性表达与cyclinD1的阳性表达呈正相关.survivin和cyclinD1的高表达均与患者术后<3年生存期相关(P<0.01,P<0.05)).结论 Survivin和cyclinD1基因在胃癌的发生、发展中起着不同的作用,它们的检测对胃癌恶性程度的判定、预后和进一步治疗提供有效的依据.     

SRC-1基因在小鼠神经干细胞分化过程中的变化

目的观察类固醇受体辅助活化因子-1(SRC-1)基因在小鼠神经干细胞(NSCs)体外培养分化过程中表达的变化。方法用机械分离和酶消化法从1~3 d小鼠大脑皮质获取NSCs原代细胞,体外培养获神经球,传代并消化,经血清诱导神经球细胞分化。形态学、细胞免疫荧光实验观察神经球形态、Nestin表达鉴定NSCs;抗体分别标记神经元、星形胶质细胞,检测细胞分化d 3、9的细胞类型。RT-qPCR和免疫印迹法检测细胞分化d 0、3、9 SRC-1基因mRNA和蛋白的表达。结果新生小鼠大脑皮质获取的细胞,体外培养能扩增形成神经球,Nestin阳性表达。NSCs分化d 3主要为神经元,d 9主要为星形胶质细胞。与NSCs分化d 0相比,SRC-1表达在分化d 3明显升高,在分化d 9明显降低。 结论 成功分离并获取新生小鼠皮质NSCs。在NSCs分化中,SRC-1表达量有明显变化,分布依次为神经元>NSCs>星形胶质细胞。     

亚低温联合载神经干细胞的纤维蛋白支架对颅脑创伤的修复作用

目的 研究大鼠颅脑创伤 （TBI） 后原位移植神经干细胞 （NSCs） 治疗的可能性, 探讨载有 NSCs 的纤维蛋白支架及与亚低温（MHT）联合对 TBI 的治疗作用。方法 从孕 14 d SD 大鼠皮质组织中分离 NSCs, 与纤维蛋白支架共培养, 应用扫描电镜观察支架及 NSCs 的形态, 并通过免疫荧光检测细胞类型。将 48 只雄性 SD 大鼠随机分成 TBI 组 （A 组）、 TBI+NSC 组 （B 组）、 TBI+MHT 组 （C 组）、 TBI+NSC+MHT 组 （D 组）, 每组 12 只。A 组通过液压损伤仪行 TBI 造模; B 组 TBI 后接受 NSCs 移植治疗; C 组 TBI 后接受 MHT 治疗; D 组 TBI 后接受 NSCs 与 MHT 联合治疗。分别在第 14、 28 天通过神经功能缺陷评分 （mNSS） 和水迷宫实验对大鼠进行神经功能评价; 28 d 后取脑组织切片, 行细胞免疫荧光检测, 观察移植后的 NSCs 在体内分化情况。结果 电镜扫描显示, NSCs 与纤维蛋白支架共培养 3 d 后形态无明显改变; 免疫荧光提示 NSCs 特异性标志物 Nestin 阳性表达, 表明神经干细胞在纤维蛋白支架上存活; D 组大鼠的 mNSS 在第 14 天和第 28 天均低于 A、 B、 C 各组; 水迷宫结果显示, D 组大鼠逃避潜伏期短于 A、 B、 C 各组; D 组 28 d 后脑组织取材可追踪到 BrdU 标记的神经干细胞分化为了神经元。结论 纤维蛋白支架与 NSCs 生物相容性良好, 具有可降解性。亚低温与载 NSCs 的纤维蛋白支架对大鼠 TBI 后的神经功能修复具有协同作用。     

高糖抑制内皮细胞增殖的细胞周期调控

目的 研究高浓度葡萄糖(HG)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖和细胞周期的影响.方法 以体外培养的HUVEC为模型,采用倒置显微镜观察细胞形态学;噻唑蓝比色法测定细胞的增殖与活性;流式细胞术检测细胞周期以及相关蛋白-增殖性细胞核抗原(PCNA)与细胞周期蛋白D1的表达.结果 HG(20mmol/L、40mmol/L)作用72h后,HUVEC的增殖受到了明显抑制(P＜0.01);48～72h后细胞周期中G0-G1期细胞的百分比增加,与对照组同期比较均有显著差异(P＜0.01);同时PCNA、周期蛋白D1的表达均明显低于对照组(P＜0.01).结论 HG可抑制体外培养的HUVEC增殖,使细胞阻滞于G1期,PCNA及周期蛋白D1表达的下调可能参与了此过程的调控.     

Protocatechuic acid promotes cell proliferation and reduces basal apoptosis in cultured neural stem cells

Protocatechuic acid (PCA), a phenolic compound isolated from the kernels of Alpinia oxyphylla, showed anti-oxidant neuroprotective property in our previous study. However, it is still unknown whether PCA have effects on the cultured neural stem cells (NSCs). In this study, we investigated the roles of PCA in the survival and apoptosis of rat NSCs under normal conditions. NSCs obtained from 13.5-day-old rat embryos were propagated as neurospheres and cultured under normal conditions with or without PCA for 4 and 7 days. The cell viability was determined by the cell counting kit-8 (CCK-8) test, while cell proliferation was assayed by bromodeoxyuridine (BrdU) labeling. PCA increased the cellular viability of NSCs and stimulated cell proliferation in a dose- and time-dependent manner. Apoptotic cells were detected after 4 days by observing the nuclear morphological changes and flow cytometric analysis. Compared with the control on both culture days, treatment with PCA effectively reduced the levels of apoptosis of NSCs. At the same time, the reactive oxygen species (ROS) level in NSCs was depressed. In addition, PCA also significantly decreased the activity of elevated caspase-3, indicating that PCA may inhibit apoptosis of NSCs via suppression of the caspase cascade. These results suggest that PCA may be a potential growth inducer and apoptosis inhibitor for NSCs.