survivin启动子调控siRNA真核表达载体的构建及对HeLa细胞中stathmin基因的干涉作用

目的:探讨survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体对HeLa细胞中stathmin基因表达的肿瘤特异性封闭作用。方法:合成针对人stathmin基因的siRNA cDNA寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHI和HindIII双酶切后的pSilencer4.1-CMV neo真核表达载体。PCR扩增suvivin基因启动子并测序,用EcoRI和BamHI分别双酶切,连接至经相同内切酶消化的载体,获得survivin启动子调控的siRNA真核表达载体,酶切及测序鉴定。脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,G418筛选。RT-PCR扩增stathmin基因,检测其对stathmin基因表达的干涉效果;流式细胞仪分析转染后HeLa细胞增殖周期的改变。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建重组质粒;RT-PCR结果显示所构建的干涉载体可有效封闭stathmin基因表达;流式细胞仪分析结果显示,Hale细胞在stathmin siRNA作用下G2/M期细胞的比例明显增加。结论:survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体可有效地封闭HeLa细胞中stathmin基因表达并使HeLa细胞阻断于G2/M期,为以stathmin基因为靶点的恶性肿瘤生物治疗奠定了理论基础。     

Survivin基因启动子调控的肿瘤特异性表达载体的构建

目的:扩增survivin基因启动子,构建survivin启动子调控的真核表达载体,验证其在肿瘤细胞的特异性表达。方法:以Hep-2细胞基因组DNA为模板,PCR扩增survivin启动子;利用核酸内切酶双酶切sur-vivin启动子基因片段和pShuttle质粒,构建载体pSurp,酶切和测序鉴定;分别双酶切pSurp载体和pEGFP-C1载体,构建survivin启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,脂质体转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP的表达,Western blot方法验证该基因的蛋白表达。结果:成功扩增survivin基因启动子并构建survivin基因启动子调控的pSurp-EGFP真核表达载体。脂质体法转染Hep-2细胞和血管内皮细胞ECV304,在荧光显微镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞没有绿色荧光;Western blot的结果也确证了EGFP蛋白仅在Hep-2细胞表达。结论:Survivin启动子的成功克隆与其真核表达载体的构建,为肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。     

Survivin基因启动子调控的肿瘤特异性表达载体的构建

目的：扩增survivin基因启动子,构建survivin启动子调控的真核表达载体,验证其在肿瘤细胞的特异性表达。方法：以Hep-2细胞基因组DNA为模板,PCR扩增survivin启动子;利用核酸内切酶双酶切sur-vivin启动子基因片段和pShuttle质粒,构建载体pSurp,酶切和测序鉴定;分别双酶切pSurp载体和pEGFP-C1载体,构建survivin启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,脂质体转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP的表达,Western blot方法验证该基因的蛋白表达。结果：成功扩增survivin基因启动子并构建survivin基因启动子调控的pSurp-EGFP真核表达载体。脂质体法转染Hep-2细胞和血管内皮细胞ECV304,在荧光显微镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞没有绿色荧光;Western blot的结果也确证了EGFP蛋白仅在Hep-2细胞表达。结论：Survivin启动子的成功克隆与其真核表达载体的构建,为肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。     

survivin启动子调控siRNA真核表达载体的构建及对HeLa细胞中stathmin基因的干涉作用

目的：探讨survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体对HeLa细胞中stathmin基因表达的肿瘤特异性封闭作用。方法：合成针对人stathmin基因的siRNAcDNA寡核苷酸链退火形成双链，连接入经BamHI和HindIII双酶切后的pSilencer4．1-CMVneo真核表达载体。PCR扩增suvivin基因启动子并测序，用EcoRI和BamHl分别双酶切，连接至经相同内切酶消化的载体，获得survivin启动子调控的siRNA真核表达载体，酶切及测序鉴定。脂质体法转染重组质粒人HeLa细胞，G418筛选。RT-PCR扩增stathmin基因，检测其对stathmin基因表达的干涉效果；流式细胞仪分析转染后HeLa细胞增殖周期的改变。结果：经酶切及测序鉴定，成功构建重组质粒；RT—PCR结果显示所构建的干涉载体可有效封闭stathmin基因表达；流式细胞仪分析结果显示，Hale细胞在stathminsiRNA作用下G2／M期细胞的比例明显增加。结论：survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体可有效地封闭HeLa细胞中stathmin基因表达并使HeLa细胞阻断于G2／M期，为以stathmin基因为靶点的恶性肿瘤生物治疗奠定了理论基础。     

survivin启动子的克隆及在HeLa细胞中的特异生物活性

目的: 构建带有survivin启动子的pGL3Basic真核表达载体，探讨survivin启动子在HeLa细胞中的特异表达活性。 方法: 采用PCR技术扩增survivin启动子，插入pGL3Basic载体，构建携带survivin启动子的pGL3Basic真核表达载体（pGL3Basic/ Surp）。纯化pGL3Basic/ Surp质粒，用脂质体法转染HeLa细胞和正常血管内皮细胞ECV304，48 h后收集转染细胞与荧光素酶底物反应，检测荧光素酶活性。 结果: 成功克隆1 kb survivin基因启动子，并构建了携带有survivin基因启动子的pGL3Basic真核表达载体，转染后的Hela细胞荧光素酶活性为2074.2±78.5，而ECV304荧光素酶活性为9.7±1.1。 结论： 成功克隆的survivin启动子在HeLa细胞中表现出较高的肿瘤特异性活性，为进一步开发肿瘤的靶向基因治疗奠定了基础     

人P21WAF1/CIP1启动子荧光素酶真核表达载体的构建

目的：构建含人P21^WAF1/CIP1基因启动子的表达载体pGL3-P21p。方法：以全血总RNA为模板,经RT-PCR扩增P21^WAF1/CIP1基因启动子,并将其克隆到T-easy载体,测序分析,然后经酶切再克隆到pGL3-basic,构成重组真核表达载体pGL3-P21p。将pGL3-P21p转染到乳腺癌细胞株MCF7中,并检测细胞中荧光素酶的活性。结果：经测序、酶切等检测证实重组真核表达载体pGL3-P21p构建成功,荧光素酶活性检测显示P21^WAF1/CIP1基因启动子对荧光酶基因表达起到了正调控作用。结论：P21^WAF1/CIP1启动子荧光素酶真核表达载体的成功构建为进一步研究P21^WAF1/CIP1基因启动子的表达调控奠定了基础。     

表达的siRNA对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因的干涉作用

目的:构建针对人survivin基因的siRNA真核表达载体,检测其对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因表达的干涉作用.方法:将合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入经HindⅢ和BglⅡ双酶切后的pSUPER真核表达载体.对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定.通过脂质体介导,把重组质粒稳定转染入SKBr-3细胞,RT-PCR、Western blot印记杂交和细胞免疫化学法检测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果.结果:经酶切鉴定及基因测序证实,重组质粒中已插入目的基因片段.RT-PCR显示两个干涉载体均抑制了目的基因的转录;Western blot印记杂交和细胞免疫化学检测结果显示pSUPER-S1对蛋白表达的抑制作用更强.结论:成功地构建了针对人survivin基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,并在人乳腺癌细胞株SKBR-3中有效发挥了对survivin基因的干涉作用.     

淋巴瘤特异性高效基因表达载体survivin-VISA的构建与鉴定

目的 构建含survivin启动子及VP16-GAL4-WPRE整合型系统性放大系统（VISA）的淋巴瘤 特异性高效基因表达载体survivin-VISA（S-VISA）。方法 应用基因重组技术构建含survivin启动子 与土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）、二步转录放大系统（TSTA）和VISA系统分别构成的 表达载体S-WPRE、S-TSTA和S-VISA,经PCR法及酶切鉴定。用脂质体法转染淋巴瘤细胞株Ramos、 U937、 Raji及人肝细胞株Chang Liver,检测荧光素酶活性。结果 表达载体S-WPRE、S-TSTA和 S-VISA通过PCR法及酶切鉴定证明构建正确,荧光素酶活性检测表明S-VISA载体在淋巴瘤细胞中实 现了目的基因特异性高效表达。结论 成功构建了含survivin启动子及VISA系统的淋巴瘤特异性高效 基因表达载体S-VISA,为淋巴瘤基因治疗的进一步研究奠定了良好的基础。     

人骨髓、脐血CD34~ 干细胞体外扩增的树突状细胞的表型及其T细胞刺激活性分析

目的:扩增出单纯疱疹病毒I型(HSV-I)Stocker株胸苷激酶(tk)基因,并将其克隆到真核表达质粒中,构建一个含有tk基因片段的高效真核表达载体.方法:根据已发表的HSV-I CL101株tk基因的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,以HSV-I Stocker株核酸为模板,进行PCR扩增,并将扩增产物连接到pUCll9中,进行序列分析,将此基因进一步克隆到含巨细胞病毒极早期启动子的真核表达质粒pCR3-Uni中,并对重组子进行酶切鉴定.结果:PGR扩增出1.427Kb大小的片段,通过酶切和序列分析证明含完整的tk基因序列,此序列与CL101株tk基因的同源性为98.5%.酶切证实了构建的真核表达载体株的同源性很高,重组子pCR3-tk含tk基因并获得了正向重组子.结论:克隆的HSV-I Stocker株tk基因与CL101株的同源性很高,重组于pCR3-tk是一种高效真核表达载体,这为今后应用非病毒载体特别是脂质体进行基因转导来研究HSV-tk/CCV系统在肿瘤基因治疗中的应用打下了基础.     

双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统的构建及体外效应研究

目的：构建高靶向性基因转移及表达系统，并研究其介导HSVtk/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的体外杀伤作用。方法： 通过重组技术分别构建antiTfR ScFvGAL4融合蛋白表达载体ScFvGAL4pET28a及含AFP启动子、GAL4特异性识别序列（GAL4rec）的HSVtk真核表达载体pEBAF/tkGAL4rec。IPTG诱导后，利用受体介导内吞作用介导pEBAF/tkGAL4rec质粒转染表面均高表达TfR的人肿瘤细胞株HepG2，SMMC7721及A549。潮霉素筛选后，MTT法检测GCV对它们的杀伤作用。结果：双酶切鉴定、SDSPAGE电泳及测序分别证明antiTfR ScFvGAL4融合蛋白及重组pEBAF/tkGAL4rec真核表达质粒构建成功。体外杀伤实验中，高分泌AFP(845 ng/ml) 的HepG2/tk细胞对GCV很敏感，且抑制率与GCV浓度及作用时间呈正相关；而低分泌AFP(2 ng/ml)的SMMC7721/tk细胞对GCV低度敏感；不分泌AFP 的A549/tk细胞则不敏感。结论：双靶向组织特异性HSVtk/GCV抗瘤系统构建成功，并显示出很好的靶向性。     

人类Survivin基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

 目的　构建带有绿色荧光蛋白的Survivin基因真核表达载体pIRES2-EGFP／Survivin,并转染K562细胞。方法　以 pDNR／Survivin质粒为模板,PCR扩增Survivin基因,T-A 克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用Superfect转染试剂转染K562细胞。提取细胞RNA,RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达。结果　经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP／Survivin载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在Survivin基因mRNA的表达。结论　pIRES2-EGFP／Survivin表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达。     

Survivin基因在喉癌中的表达及意义

目的研究Survivin基因在喉癌中的表达及其与各临床病理因素的关系.方法应用RT-PCR法检测2株喉癌细胞株,40例喉癌组织标本及相应的癌旁组织中Survivin基因的表达;应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接SP法检测Survivin基因在120例喉癌组织中的表达情况.结果 RT-PCR显示喉癌细胞株和67.5%(27例)的喉癌组织表达Survivin mRNA,而癌旁组织内无1例阳性表达.SP法显示在Survivin基因在喉癌中阳性表达率为66.7%,其阳性表达率在有无淋巴结转移、复发、临床分期、5年生存率等方面差异有显著性(P＜0.05).结论 Survivin基因与喉癌的自然的发展过程有关,同时可作为判断肿瘤恶性程度,判断预后的有效指标.Survivin基因可能成为喉癌新的诊断标志及基因治疗的靶点.     

双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统构建及体外效应研究

目的 构建高靶向性基因转移及基因表达系统,并研究其介导HSV-tk/GCV自杀基因系统对人肝癌细胞的体外杀伤作用。 方法 通过重组DNA技术分别构建anti-TfR ScFv-GAL4融合蛋白表达载体ScFv-GAL4-pET28a及含AFP启动子、GAL4特异性识别序列(GAL4rec)的HSV-tk真核表达载体pEBAF/tk-GAL4rec。前者经IPTG诱导表达获取anti-TfR ScFv-GAL4融合蛋白作为非病毒转运载体,利用受体介导内吞作用介导pEBAF/tk-GAL4rec质粒转染表面均高表达TfR的人肝癌细胞株HepG2、SMMC7721及人肺癌细胞株A549,潮霉素筛选阳性细胞,扩大培养,分别命名为HepG2/tk、SMMC7721/tk及A549/tk,然后通过MTT法检测GCV对它们的杀伤作用。 结果 双酶切鉴定及SDS-PAGE电泳证明非病毒转移载体anti-TfR ScFv-GALA融合蛋白及重组pEBAF/tk-GAL4rec真核表达质粒构建成功。体外杀伤实验中,表面TfR阳性且高分泌AFP(845 ng/ml)的HepG2/tk细胞对GCV很敏感,且抑制率与GCV浓度及作用时间呈正相关;而低分泌AFP(2ng/ml)的SMMC7721/tk细胞对GCV低度敏感;表面TfR阳性但不分泌AFP的A549/tk细胞则对前药不敏感。 结论 双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统构建成功,并显示出很好的靶向性。     

RNA干涉技术抑制骨肉瘤细胞MG63中Survivin基因表达的研究

目的：构建人Survivin基因的si RNA真核表达载体,探讨其对骨肉瘤细胞MG63中Survivin基因表达的干涉作用。方法：应用pSilencer3.0-H1neo构建Survivin特异性RNA干涉载体,转染MG63细胞,G418筛选稳定转染的细胞。HE染色观察细胞形态学变化,透射电镜观察细胞超微结构。应用RT-PCR、间接免疫荧光和western blot等方法检测Survivin的mRNA和蛋白水平变化。流式细胞仪检测细胞周期变化。结果：成功构建了Survivin基因si RNA真核表达载体PsvA和PsvB,获得了稳定转染的MG63细胞。与野生型MG63、阴性对照和MG63/PsvA细胞相比,MG63/PsvB细胞增殖反应明显减弱,差异有统计学意义,P〈0.01。MG63/PsvB细胞中Survivin mRNA和蛋白表达减少。与野生型MG63、阴性对照和MG63/PsvA细胞相比,MG63/PsvB凋亡率增加7倍（P〈0.01）。结论：特异性si RNA能够明显抑制Survivin基因在MG63细胞中的表达,为进一步研究survivn在MG63细胞中的生物学功能和作用机制奠定了基础。     

Survivin基因真核表达载体的构建及其在cos-7中的表达

[目的]克隆人survivin基因并在真核细胞中表达。[方法]以人喉癌组织中提取总RNA为模版，采用反转录聚合酶链RT-PCR法获得survivin cDNA。将该基因克隆到pcDNA3．0载体中，构建真核细胞表达载体pcDNA3．0／survivin，将测序正确的survivin基因通过脂质体介导下转染cos-7,Westem blot检测survivin蛋白在cos-7中表达。[结果]DNA测序证明获得了survivin基因，其序列与GeneBank中报道序列完全一致。Western blot检测survivin蛋白获得高效表达，其相对分子质量为16．5kD。[结论]Survivin基因的克隆和表达均获得了成功，为进一步探讨survivin基因在喉癌诊治中应用奠定了基础。     

Use of gastrin-releasing peptide promoter for specific expression of thymidine kinase gene in small-cell lung carcinoma cells

For specific transduction of herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk) into human small-cell lung carcinoma (SCLC) cells, we explored the 5'-flanking region (-1.1 kb) of the gastrin-releasing peptide (GRP) gene as a lung cancer-specific promoter. RT-PCR analysis demonstrated expression of GRP mRNA in the SBC5 human SCLC cell line but not in the RERF human SCLC cell line, the A549 human lung adenocarcinoma cell line or the HeLa human uterine cervix epithelioid carcinoma cell line. A reporting vector containing the GRP promoter (pGL2-GRP) exhibited higher luciferase activity in SBC5 than in the other 3 cell lines. After transfecting an expression vector containing the GRP promoter-bound HSV-tk gene (pGRP-TK) into the cells, we measured their sensitivity to ganciclovir (GCV). In SBC5, pGRP-tk-transfected cells became about 100 times more sensitive to GCV than parental cells in vitro. In nude mice, tumors of pGRP-tk-transfected SBC5 regressed completely after i.p. administration of GCV. GRP promoter might be a good tool for tumor-specific transduction of suicide genes in GRP-expressing SCLC cells.     

TSLC1基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

Objective： To construct the eukaryotic expression vector for human TSLC1 gene, and to express TSLC1 in HepG2 cells for investigating its effect on HepG2 cell growth. Methods： Full length of TSLC1 cDNA was amplified from RNA of normal human liver by RT-PCR, and cloned into pCI-neo expression vector. The recombinant plasmid pCI-TSLC1 was identified with restriction enzyme and sequenced, and then was stably transfected into HepG2 cells with lipofectamine 2000. The positive clones were examined by western-blotting and immunofluorescence, cell growth was analyzed with MTT assay. Results： The eukaryotic expression vector pCI-TSLC1 was successfully constructed and the stable cell line highly expressing TSLC1 protein was obtained. The growth of TSLCl-transfected cells was significantly suppressed in vitro. Conclusion： The HepG2 stable cell line could highly express TSLC1 protein, which provided a basis for further exploring the roles of TSLC1 in hepatocellular carcinoma.